El uso de una trampa óptica para el estudio de interacciones huésped-patógeno de imágenes dinámicas de células vivas

El objetivo general del siguiente experimento es utilizar el atrapamiento óptico combinado con la microscopía confocal de disco giratorio para observar las interacciones entre el huésped y el patógeno en tiempo real. Esto se logra agregando primero los patógenos de interés a un cubreobjetos con cámara. A continuación, se selecciona una partícula y se captura con la trampa óptica.

Finalmente, la partícula se dirige a la célula de interés. Como se ve aquí. El atrapamiento óptico puede ser un método eficaz para controlar dos partículas para la observación de interacciones intracelulares dinámicas.

Este método puede responder a preguntas importantes en las interacciones entre el huésped y el patógeno en los campos de las enfermedades infecciosas y la inmunología, incluyendo cuál es el efecto sobre la fagocitosis cuando se obtiene un control completo de las relaciones espaciales entre las células huésped y los patógenos, así como si el orden de los patógenos que son absorbidos por una célula fagocítica afecta a la maduración del faa soma. Por lo general, los individuos nuevos en este método tendrán dificultades porque las condiciones de captura deben optimizarse para diferentes tipos de celdas y perlas. La demostración visual de este método es fundamental como el proceso para configurar e integrar un disco giratorio.

Confocal a una trampa óptica es difícil de conceptualizar debido a la alineación precisa que es necesaria para todos los componentes ópticos. Cosecha el patógeno de interés. Por ejemplo, aquí, 300 microlitros de albicans canadienses cultivados durante la noche en caldo se retiran del cultivo y transfieren los patógenos a un tubo de reacción de 1,5 mililitros.

A continuación, lavar los patógenos tres veces a aproximadamente 1300 Gs durante cinco minutos a temperatura ambiente, aspirando el sobrenadante y dejando el pellet sin perturbar cada vez que se resuspende PBS y se sonicate. Después del tercer lavado, resus suspender el pellet en 500 microlitros de PBS. A continuación, disuelva un miligramo del colorante en 100 microlitros de dimetilformamida para obtener una concentración final de 10 miligramos por mililitro.

A continuación, añada tres microlitros de la mezcla de colorante al tubo de reacción que contiene los patógenos lavados. Coloque papel de aluminio alrededor de los tubos, ya que los tintes son sensibles a la luz y agite la muestra a 37 grados centígrados durante una hora, y luego granule y lave la muestra en PB S3 veces como antes. Vuelva a suspender el pellet en 300 microlitros de PBS después del último lavado.

Calentar los medios de prueba y PVS a 37 grados centígrados en un baño de agua Lavar. Una placa de cultivo de tejidos de 10 centímetros recubierta con macrófagos crudos 2 6 4 0,7 dos veces con PBS aspirando el PBS entre cada lavado. A continuación, cubra la superficie de la placa con cinco mililitros de tripsina e incube la placa durante cinco minutos a 37 grados centígrados.

A continuación, golpee suavemente el lateral de la placa para separar las células de la superficie de la placa. Teniendo cuidado de no salpicar la tripsina fuera del plato. Ahora agregue cinco mililitros de medio a la placa y transfiera la mezcla a un tubo de reacción.

Después de la granulación, las células aspiran el medio teniendo cuidado de no alterar el pellet y resuspenden el pellet en 10 mililitros de medio. Agregue 400 microlitros de medios a cada cámara de un portaobjetos de cámara y, a continuación, agregue cinco microlitros de la suspensión celular a cada cámara. Deje que las células crezcan durante la noche en una incubadora a 37 grados centígrados con 5% de CO2.

Recupere el portaobjetos de la cámara de la incubadora, pipetee de cinco a 10 microlitros de los patógenos de interés previamente preparados marcados con fluorescencia en cada cámara de macrófagos. Mezcle bien los macrófagos y los patógenos pipeteando hacia arriba y hacia abajo, teniendo cuidado de no tocar el fondo de la cámara y perturbar los macrófagos adheridos. Encienda todos los componentes del microscopio confocal de disco giratorio.

Prepare el microscopio agregando aceite a la lente del objetivo de inmersión en aceite. Inserte el portaobjetos de la cámara en la platina especializada y, a continuación, retire la parte superior del microscopio de alineación del portaobjetos de la cámara para la obtención de imágenes DIC. Encienda el obturador de la trampa óptica y el láser IR.

A continuación, abra el obturador del láser hasta la trampa óptica. Confirme que el obturador frente al láser IR está cerrado verificándolo con la tarjeta IR. Ahora concéntrese en los macrófagos en el portaobjetos adherido.

A continuación, encuentre los patógenos que flotan libremente en la solución adyacente a los macrófagos. La parte más difícil de este procedimiento es encontrar el objeto correcto para rastrear en la cámara de muestras debido a las fuerzas de adhesión entre el objeto y el cubreobjetos en la cámara de muestras. Para mover ese objeto, debe mover el escenario mientras el objeto está sostenido por el láser de tráfico, y también es importante tener en cuenta que debe mover el escenario lo suficientemente lento como para que la fuerza de arrastre del escenario no exceda la fuerza máxima de captura de la trampa.

Mueva la etapa de manera que el patógeno esté cerca de la trampa. A continuación, abra el obturador y active la trampa. Mueva la muestra para que los macrófagos entren en contacto con una imagen fija de patógeno atrapado.

Los patógenos con un microscopio confocal de disco giratorio, ya sea en fluorescencia DIC o en una combinación de ambas poblaciones separadas de albicans de Canadá, que suelen tener un tamaño de aproximadamente cinco micras, se marcaron en verde, azul y rojo. Para ilustrar las imágenes, una sola C. albicans fue atrapada y movida en un patrón cuadrado a través de un grupo de otras levaduras, como lo indican las flechas grises, lo que demuestra la capacidad de capturar y manipular la ubicación específica de un solo patógeno elegido por el operador, incluso en un entorno abarrotado. Para ilustrar aún más la flexibilidad de este sistema para atrapar las diferentes morfologías de forma exhibidas por los organismos patógenos en esta figura, se utilizó la pinza óptica para sujetar y situar una partícula de C. albicans con una pseudo hifia.

El C. albicans se marca con colorante rojo y se mueve a lo largo de una trayectoria delineada por la flecha blanca y se coloca junto a las células crudas fluorescentes GFPL C3. En verde. La porción de levadura de los albicans quedó atrapada a medida que el pseudo hito avanzaba.

La diosa Aspergillus fum también se colocó junto a una célula macrófaga de ratón cruda para analizar el marco temporal absoluto de la fagocitosis con esta línea celular y patógeno en particular. En esta figura, las imágenes de campo claro muestran cómo el aspergillus atrapado, como lo indica la flecha blanca, se movió y se colocó a lo largo del camino como lo indica la flecha roja. El patógeno atrapado está ligeramente fuera de foco debido a que la trampa empuja al organismo ligeramente por encima del plano focal.

El Aspergillus se movió hasta que se colocó adyacente a la célula cruda deseada. Una vez que el patógeno entraba en contacto con la célula, la trampa se desactivaba. Se activó el proceso de fagocitosis y se emplearon imágenes de lapso de tiempo para observar los eventos celulares posteriores.

A los 30 segundos, la membrana de la célula cruda comenzó a cambiar y a formar una copa alrededor de la partícula. A los 60 segundos, la copa estaba completamente formada. De 90 a 150 segundos, el Afu Gotti se estaba convirtiendo y engullendo, y a los 180 segundos la partícula estaba completamente internalizada.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo crear un aparato de trampa óptica de disco giratorio y cómo un instrumento de este tipo puede permitir controlar patógenos de manera no invasiva para obtener imágenes de células vivas después de su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de las interacciones entre el huésped y el patógeno investigaran el papel de las relaciones espaciales entre las células huésped y los patógenos, y su papel en la respuesta inmunitaria resultante.