Un flujo de trabajo de detección rápido para identificar una posible terapia combinada para GBM utilizando células madre de glioma derivadas del paciente

Las células madre del glioma son una subpoblación de células en el glioma, que generalmente son resistentes a la quimioterapia y la radioterapia. Aquí describimos el método para la identificación rápida de terapias combinadas, dirigidas a células madre de glioma, en lugar de células de glioma diferenciadas. En comparación con otros métodos, que pueden ser laboriosos y complicados.

Este protocolo es relativamente simple y rápido, para identificar posibles combinaciones de medicamentos útiles. Comience recolectando las células madre del glioma o GSC del medio de cultivo y centrifugándolas a 70 veces G durante tres minutos a temperatura ambiente. Después de retirar el sobrenadante, digiera las células con accutase durante cuatro minutos a 37 grados centígrados.

Usando una punta de 200 microlitros, pipetee las células repetidamente para disociarse y vuelva a enviar la bolita celular. Agregue las GSC a una densidad de 200, 000 células en un mililitro de medio de cultivo, en cada pozo de una placa de cultivo de 12 pozos, e incube durante la noche. Oh, al día siguiente, agregue 30 microlitros de sobrenadante del virus luciferasa-eGFP en cada pozo de la placa.

Centrifugar las células a 1000 veces G durante dos horas, a 25 grados centígrados e incubarlas durante la noche. Al día siguiente, reemplace el medio en los pozos recolectando los GSC, centrifugando, retirando el sobrenadante, reutilizándolos en medio fresco y replatándolos. Culta las células durante otras 48 horas.

Observe la placa bajo un microscopio fluorescente y confirme la aparición de células GFP positivas. Clasonde y recoge las GSC con una alta fluorescencia utilizando un clasificador de células de flujo y cultivalas aún más. Cubra 96 placas inferiores ópticas de pozo con una mezcla de matriz extracelular, como matrigel, e incube durante una hora a 37 grados centígrados.

Retire el exceso de mezcla y enjuague suavemente las placas una vez con PBS, luego sellen las células XG387-Luc a una densidad de 1000 células en 100 microlitros de medio de cultivo, y a cada pozo de las placas recubiertas y cultivarlas durante la noche. Al día siguiente, observe las células bajo un microscopio para confirmar su unión a la placa. A continuación, prepare una solución de temozolomida micromolar de 200 y dos soluciones micromolares de los agentes objetivo, en medio de cultivo.

Para la detección combinada de fármacos, retire el medio en blanco y agregue el medio que contiene 200 temozolomida micromolar o dos agentes dirigidos micromolares, o una combinación de ambos, en cada pozo durante tres réplicas técnicas por tratamiento. Incubar la placa a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante tres días. Tome imágenes de la bioluminiscencia celular en la placa utilizando el sistema de imágenes del espectro IVIS.

Utilizando el software incorporado, cree múltiples áreas circulares de la región de interés y cuantifique la bioluminiscencia celular. Para identificar posibles candidatos que podrían mejorar el efecto antiglioblastoma de la temozolomida, se analizaron 20 inhibidores selectivos de moléculas pequeñas objetivo a través de la detección de combinaciones de fármacos. Los valores del índice sensible de 13 agentes objetivo estaban por encima de cero y cinco de ellos estaban por encima de 0,1.

El índice sensible de los dos principales fármacos candidatos UMI-77 y A 83-01, fue superior a 0,25, lo que sugiere su potencial para sinergizar con temozolomida. El tratamiento combinado de temozolomida y UMI-77 se evaluó mediante un ensayo antiproliferativo en una matriz de titulación de dosis de seis por seis. Los valores del índice de combinación fueron inferiores a uno.

Y los altos valores de un solo agente fueron mayores que cero para la mayoría de las combinaciones de temozolomida y UMI-77 en diferentes concentraciones. Sugiriendo una interacción sinérgica general de temozolomida y UMI-77 en las GSC XG387 y XG328. Este protocolo también se puede aplicar para encontrar una combinación de medicamentos utilizando células cancerosas adherentes simplemente eliminando el paso de recubrimiento de la placa.