Recopilación remota de datos por tomografía crioelectrónica y promedio de subtomografía
12 de julio de 2022
El presente protocolo describe la adquisición remota de datos por criotomografía electrónica de alta resolución utilizando Tomo5 y el posterior procesamiento de datos y el promedio de subtomografías utilizando emClarity. La apoferritina se utiliza como ejemplo para ilustrar procesos detallados paso a paso para lograr una estructura crio-ET a una resolución de 2,86 Å.
Este protocolo proporciona una ruta de fácil acceso al mundo cada vez más popular pero complejo de la criotomografía electrónica. Se pueden obtener imágenes de seis especímenes celulares. Instituto en un estado cercano al nativo.
Las micromoléculas pueden resolverse a alta resolución en su entorno celular nativo mediante el uso de CROW, ET y promedio de subátomos. Comience iniciando el software Tomo five desde la PC del servidor TEM. Inicie la configuración de la sesión ajustando los parámetros de adquisición de imágenes en la pestaña de preparación, en ajustes preestablecidos.
Copie los parámetros de adquisición de imágenes en todos los demás ajustes preestablecidos de gran aumento. Pulse Set"para ajustar la exposición al microscopio y Get" para obtener los ajustes de exposición para todos los demás aumentos altos después de seleccionarlos individualmente. Para recopilar un atlas, haga clic en la pestaña "Nueva sesión" en el Atlas.
Establezca las preferencias de sesión. Introduzca la ruta de almacenamiento y el formato de salida y pulse aplicar. Seleccione "Proyección" y marque todos los atlas que desea adquirir.
Seleccione Cerrar válvulas de llamada"Si el microscopio no está supervisado, esto cerrará las válvulas de columna. Luego, para iniciar la proyección, presione el botón de inicio. Inspeccione los atlas únicos o múltiples en busca de objetivos haciendo clic en la cuadrícula en el panel izquierdo en Configuración de sesión"Luego haga clic izquierdo y arrastre el mouse para moverse y desplácese hacia el medio para acercar y alejar.
Elija la cuadrícula para la configuración de destino. Selecciónelo y haga clic en Cargar muestra" desde dentro del software. Para realizar la calibración del desplazamiento de imagen, en la pestaña Funciones automáticas"establezca el ajuste preestablecido en Altura eucéntrica"Navegar a Eucéntrico automático" mediante inclinación de escenario y pulse Inicio.
Si la función permaneció centrada durante la segmentación, omita las calibraciones de desplazamiento de imagen. De lo contrario, vaya a la pestaña Preparación "para calibrar el desplazamiento de imagen, seleccione Calibrar desplazamiento de imagen" y presione inicio. Esto alineará los aumentos más bajos con la función centrada en el aumento de la exposición.
Para la configuración de la tomografía, inicie una nueva sesión en Configuración de sesión"para muestras biológicas. Elija Slab like"como el tipo de muestra y seleccione Lote" y Dosis baja"Luego seleccione la carpeta Formato de salida y almacenamiento". Opcionalmente, agregue un destinatario de correo electrónico y presione Aplicar"Para configurar objetivos, vaya a la flecha del atlas, busque una región de interés y muévase seleccionando las opciones que aparecen con un clic derecho del mouse.
Tome una imagen general para confirmar una buena posición para el ajuste de altura eucéntrica. A continuación, pulse autoeucentric"para ejecutar la rutina eucentric by stage tilt, vuelva a adquirir una nueva imagen de visión general para actualizar la altura eucéntrica. Inspeccione la vista general cuadrada o el mapa de búsqueda adquirido.
Muévase a una región de interés y presione adquirir búsqueda. Luego inspeccione la imagen de búsqueda si la región de interés no está centrada, haga clic derecho en la posición deseada y repita la etapa Mover aquí "y adquiera la imagen. Ajuste las áreas de enfoque y seguimiento.
Haga clic izquierdo para arrastrar las áreas de seguimiento y enfoque. Una vez que todos los parámetros estén configurados, presione Agregar posición "Para realizar funciones automáticas, verifique la configuración para realizar las alineaciones a través de la pestaña Funciones automáticas" navegando por el atlas a un área de carbono. Lleve esa área a la altura eucéntrica y siga el orden de alineaciones como se describe en el manuscrito de texto.
A continuación, inicie la adquisición automatizada de la pestaña de tomografía. Seleccione la losa de adquisición de datos y establezca los parámetros deseados. Configure los parámetros de adquisición de datos: paso de inclinación, ángulo positivo máximo, ángulo negativo máximo, esquema de seguimiento.
A continuación, seleccione Cerrar válvulas de columna" para el esquema de altura eucéntrica. Comience con la preparación de archivos de entrada y directorios. Establezca una carpeta de proyecto en la carpeta Project".
Crea otra nueva carpeta fija en pilas y prepara los archivos de entrada. Inclinación serie uno basculación fija serie 1. Serie XF e inclinación 1.tlt.
Para calcular el desenfoque, actualice el archivo de parámetros con el microscopio y los parámetros de imagen. Copie un archivo de parámetros en la carpeta del proyecto. Cambie su nombre a param_CTF.
M y ejecute el comando indicado. A continuación, verifique los resultados de la estimación de CTF. Para cada pila, verifique las pilas alineadas usando 3D mod y asegúrese de que las cuentas fiduciales se borren correctamente.
Asegúrese de que la mano es correcta ejecutando el comando indicado. A continuación, compruebe el valor de desenfoque y asegúrese de que coincida con la estimación teórica de CTF. Para definir las subregiones, genere un tomograma de plegado.
En la carpeta del proyecto, ejecute el comando indicado. Determine los límites eligiendo seis puntos Xmin Xmax Ymin, Ymax, Zmin y Zmax, para crear una subregión en la carpeta bin10, ejecute el comando indicado. A continuación, ejecute la selección de partículas para cada subregión.
Para el conjunto de datos de apoferritina, realice una búsqueda de plantillas en el contenedor seis. Modifique el ángulo de subrayado de la plantilla. Parámetros de búsqueda para determinar el ángulo, el rango y los intervalos para la búsqueda dentro o fuera del plano en grados.
En la carpeta del proyecto, ejecute el comando indicado. Elimine las partículas incorrectas usando 3D mod debajo de la carpeta. Convmap_wedge_Type2_bin6. Ejecute el comando indicado.
A continuación, inicialice el proyecto. En la carpeta del proyecto, ejecute el comando indicado para crear una base de datos para mayor claridad EM, AppoF.mat. Realice la reconstrucción del tomograma antes del promedio y la alineación del subtomo para generar tomogramas de subregión corregidos por CTF en bin4, ejecute el comando indicado.
A continuación, para realizar el promedio y la alineación de sub tomo, realice el promedio utilizando los subtelegramas corregidos de CTF a partir de bin4. En la carpeta del proyecto, ejecute el comando indicado. Continúe haciendo alineaciones y ejecute el comando.
Limpie las partículas superpuestas ejecutando el comando indicado. Realice la reconstrucción final combinando los dos conjuntos de datos de la mitad. En la carpeta del proyecto ejecute los comandos indicados.
La descripción general del flujo de trabajo de tomografía para la tomografía celular y molecular se muestra aquí para muestras celulares y laminares, la estrategia de recopilación de datos depende en gran medida de la muestra y el objetivo del estudio de imagen. Aquí se muestran los parámetros de recolección para varios estudios crioET. Aquí se muestran tomogramas representativos de muestras moleculares como apoferritina, procesos celulares delgados y láminas fresadas por haz de iones enfocados de la muestra celular gruesa.
El análisis estructural de alta resolución puede ayudar a revelar sitios de unión para objetivos farmacológicos y la tomografía y el promedio subtomogral también han ayudado al desarrollo de vacunas contra el SARS-CoV-2.
Resumen
Este protocolo describe los pasos detallados para la adquisición y procesamiento remoto de datos mediante tomografía crioelectrónica de alta resolución (crio-ET), utilizando la apoferritina como sistema modelo. El flujo de trabajo logra una resolución estructural de crio-ET de 2,86 Å, mostrando métodos eficientes desde la recopilación de datos hasta el promediado de subtomogramas.
Componentes Clave del Estudio
Área de Investigación
- Tomografía electrónica criogénica
- Biología estructural
- Imagen celular
Antecedentes
- Introducción a las técnicas de tomografía electrónica criogénica.
- Importancia de la obtención de imágenes de especímenes celulares en su estado nativo.
- Uso de apoferritina para la ilustración metodológica.
Métodos Utilizados
- Adquisición remota de datos con el software Tomo5.
- Metodologías de procesamiento utilizando emClarity para el promediado de subtomogramas.
- Imagen de alta resolución en sistemas biológicos.
Resultados principales
- Demostrar con éxito la recopilación y el procesamiento de datos de alta resolución.
- Lograr imágenes detalladas de apoferritina con una resolución significativa.
- Metodologías validadas para futuros estudios de tomografía electrónica criogénica.
Conclusiones
- Este estudio proporciona un enfoque sistemático para la obtención de imágenes de alta resolución en biología estructural.
- Las metodologías descritas son relevantes para avanzar en la investigación de tomografía electrónica criogénica.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La tomografía electrónica criogénica (cryo-ET) con recopilación remota de datos y promediado de subtomogramas permite el análisis estructural de macromoléculas a alta resolución en entornos celulares casi nativos. Esta capacidad es fundamental para la validación de objetivos, la reducción del riesgo mecanicista y la aceleración de las decisiones en las fases iniciales del descubrimiento en la I+D de biofármacos. La integración de flujos de trabajo remotos robustos garantiza un acceso ininterrumpido a infraestructuras avanzadas de imagen, apoyando la continuidad de la cartera y la colaboración entre diferentes ubicaciones.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la visualización directa de complejos moleculares in situ, lo que apoya la validación funcional de dianas.
- Facilita la eliminación de riesgos mecanicistas al revelar conformaciones e interacciones nativas.
- Mejora la confianza predictiva para la interacción con dianas y el análisis de vías.
Desarrollo de pruebas y cribado
- Proporciona plantillas estructurales validadas para el desarrollo de ensayos posteriores.
- Apoya resultados cuantitativos reproductibles de imágenes listos para cribado.
- Permite la estandarización de la preparación de muestras y de los parámetros de imagen entre proyectos.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Combina imágenes de alta resolución con sistemas relevantes para enfermedades en el descubrimiento traslacional de biomarcadores.
- Asegura la continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica mediante el mantenimiento de la fidelidad estructural en estado nativo.
- Apoya decisiones de avance ajustadas al riesgo basadas en conocimientos estructurales.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
Este flujo de trabajo remoto de tomografía crioelectrónica (crio-ET) conecta el descubrimiento temprano, la identificación de compuestos activos y la investigación preclínica al proporcionar datos estructurales cuantitativos de alta resolución accesibles desde cualquier ubicación.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías mediante la visualización molecular directa.
- Selección: Proporciona resultados de imagen cuantitativos y reproducibles para la estandarización de ensayos.
- Análisis: Permite mediciones robustas de parámetros estructurales y comparaciones estadísticas entre diferentes condiciones.
- Investigación Traducional: Mantiene la continuidad estructural para la alineación de biomarcadores y la modelización de enfermedades.
- Reutilización Empresarial: Establece una capacidad de imagen escalable con acceso remoto para apoyar múltiples programas.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en la validación de objetivos.
- Valor operativo: Estandariza los flujos de trabajo de imagen y permite la recopilación remota y escalable de datos.
- Valor estratégico: Apoya decisiones informadas de avance/no avance y una gestión eficiente del portafolio en términos de capital.
- Impacto en el portafolio: Facilita la priorización ajustada al riesgo y las decisiones de avance multifuncionales.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en instrumentación de criomicroscopía electrónica y software de análisis de datos (Tomo5, emClarity).
- Exige una infraestructura informática robusta para acceso remoto y almacenamiento de datos.
- Necesita estandarización entre equipos de los protocolos de adquisición de imágenes y análisis.
- La adaptación a diversos tipos de muestras puede requerir optimización del protocolo.
- Las limitaciones prácticas incluyen el grosor de la muestra, el rendimiento de la adquisición de imágenes y los recursos computacionales.
