Visualización de compactación del ADN en cianobacterias por Tomography del Cryo-electrón de alta tensión

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la microbiología, como cómo cambia la estructura del ADN durante el ciclo celular de las bacterias. La principal ventaja de esta técnica es que es posible visualizar la ultraestructura de células bacterianas enteras cerca del estado vivo en puntos de tiempo apropiados sin ningún tratamiento adicional. Chihong Song, un postdoc de mi laboratorio, y Mako Hayashi, un estudiante graduado del laboratorio del Dr. Kaneko, demostrarán el procedimiento.

Comience con el cultivo de cianobacterias en placas BG-11 esterilizadas de nueve centímetros que contienen 1,5% de agar y 0,3% de tiosulfato de sodio. Incubar las placas a 23 grados centígrados bajo un ciclo de luz de 12-12 con 50 micro-E de luz por metro cuadrado por segundo. Para mantener las células, transfiéralas semanalmente a placas de agar BG-11 frescas.

Al cabo de una semana, los cultivos aparecen como bandas verdes. Transfiera los grupos verdes de células con un lazo esterilizado por llama y colóquelos en la nueva placa. Para observar la compactación del ADN, recoja las células cultivadas durante seis días al final del período de luz.

Para liberar las células de la placa, agregue un mililitro de sacarosa 0.2 molar. Luego, recoja la suspensión celular y repita la adición y eliminación de sacarosa hasta que la solución se vuelva verde. El cambio de color indica que la mayoría de las celdas se han liberado.

Ahora, transfiera 500 microlitros de solución de celda suspendida a un tubo de Microfuge y agregue la tinción de Hoechst para obtener una concentración final de un microgramo por mililitro. Luego, deje que las células se incuben en la oscuridad durante 10 minutos. A continuación, centrifuga las células, desecha el sobrenadante y vuelve a suspenderlas en 10 microlitros de sacarosa 0,2 molar.

A continuación, transfiera un microlitro de la suspensión a un portaobjetos de vidrio, colóquelo en un cubreobjetos y observe las células bajo un microscopio de fluorescencia equipado con un filtro UV. Usando un objetivo de inmersión en aceite de 100 veces, busque evidencia de compactación del ADN, que debería ser observable en la mayoría de las células. Primero, prepare el dispositivo de congelación por inmersión.

Luego, configure el contenedor de nitrógeno líquido insertando el contenedor de etano y el accesorio de la varilla de enfriamiento. A continuación, llene el recipiente con nitrógeno líquido y enfríelo a la temperatura de nitrógeno líquido. Después de eso, cargue el gas etano en el contenedor.

Asegúrese de usar gafas de seguridad, ya que el etano líquido es explosivo. Finalmente, retire el accesorio de la varilla de enfriamiento y cubra el recipiente con una tapa de plástico para evitar que se adhiera escarcha. Para continuar, descargue el lado de carbono de una rejilla EM recubierta de carbono durante 30 segundos a 50 miliamperios utilizando una barrera de iones de plasma.

A continuación, prepare el Vitrobot de acuerdo con el protocolo de prueba. Utilice pinzas para ajustar la rejilla EM pretratada a la cámara. Trate la rejilla EM con un trazador de oro BSA de 15 nanómetros y microlitros para que sirva como marcador de referencia antes de aplicar la muestra.

Ahora, alícuota de 2,5 microlitros de suspensión celular en la red. Seque el exceso de solución con papel de filtro e inmediatamente congele la rejilla en etano líquido. Mantenga la rejilla congelada almacenada en nitrógeno líquido hasta que puedan ser examinados.

A continuación, encienda el HVEM y configúrelo a un alto voltaje de un megavoltio. A continuación, enfríe el soporte de la rejilla de la muestra a menos 150 grados centígrados con nitrógeno líquido. Una vez enfriada, monte la rejilla congelada en el soporte de muestras criogénicas enfriadas y cárguela en el HVEM.

Tenga cuidado de evitar contaminar la instalación con hielo. Ahora, seleccione un área de imagen con un aumento bajo de 1.000 veces. A continuación, ajuste la altura del eje z eucéntrico e incline la platina de la muestra a menos 60 grados.

A continuación, elimine la holgura de la rotación de inclinación. Ahora, enfoque cerca de la ubicación de destino con un aumento de 10.000 veces. Establezca un enfoque inferior de seis a 10 micras por desviación de la imagen enfocada.

Para la obtención de imágenes, establezca la dosis en dos electrones por angstrom cuadrado por segundo o menos. Vigile la dosis de electrones, que se refleja en la densidad de corriente, y tome una imagen con una cámara digital o en una película de electrones. A continuación, recopile imágenes de inclinación de menos 60 a positivo 60 grados en incrementos de dos a cuatro grados.

Utilice las funciones automatizadas del microscopio si es posible. Abra el paquete de software comercial y cargue las imágenes de inclinación para la reconstrucción tomográfica. A continuación, cree un archivo de pila de imágenes a partir de las imágenes individuales utilizando el comando tif2mrc o newstack.

A continuación, inicie el software eTomo GUI e introduzca los parámetros de la imagen para el tamaño de píxel, el diámetro de la fiducia, la rotación de la imagen, etc. Por lo tanto, cree el script de edición. Ahora, utilice el software sugerido para crear una serie de inclinación, alineada mediante marcadores de referencia, con un error residual medio inferior a 0,5.

Por último, reconstruya un tomograma 3D utilizando el algoritmo SIRT. Ahora, extraiga una región de interés del tomograma y aplique un filtro de eliminación de ruido, como un filtro de difusión anisotrópico, un filtro bilateral o un filtro de morfología matemática. Realice el filtrado utilizando parámetros que mejoren el contraste de la imagen.

A continuación, segmente una entidad de interés. Utilice la función de corte para abrir el tomograma. A continuación, vaya a la ventana Editor de segmentación y seleccione un nuevo campo de etiqueta para crear un archivo de segmentación.

A continuación, trace manualmente el borde de la entidad de interés en el primer sector y, a continuación, en cada uno de los demás sectores. Se puede agregar una característica adicional de interés utilizando las mismas operaciones. Ahora, para generar una representación de superficie utilizando las opciones del menú SurfaceGen para visualizar el volumen segmentado, seleccione el menú SurfaceView.

Para mover, rotar y hacer zoom en el volumen 3D, utilice las herramientas de la ventana Visor 3D. La segmentación automática se puede realizar utilizando la herramienta Varita mágica. Haga clic en un objeto y ajuste los controles deslizantes de Visualización y enmascaramiento para que las características del objeto estén completamente seleccionadas.

En un cultivo sincrónico preciso, el ADN marcado con Hoechst muestra una distribución normal y uniforme en la condición de oscuridad y luego se compacta progresivamente dentro de la célula durante el período de luz, adquiriendo una estructura ondulada en forma de bastón al final del período de luz. Finalmente, la varilla se divide en el centro y sus dos partes se distribuyen en las células hijas. Después de la división celular, el ADN compactado desaparece inmediatamente y el ADN vuelve a una distribución normal y uniforme.

Cuando las células en la etapa final de la compactación del ADN se congelaron y se observaron mediante microscopía electrónica de alto voltaje, muchas mostraron una compactación de ADN distinta que se distinguía fácilmente de las células normales. Algunos exhibieron una constricción en el centro de las células, como se esperaba antes de la división celular. A partir de las tomografías 3D, el ADN compacto se separa visiblemente en el citoplasma y está rodeado por un material de baja densidad.

Las capas de la membrana tilacoide se distorsionan a lo largo de la varilla ondulada de ADN compactado. Curiosamente, muchos cuerpos pequeños de fosfato se adhieren al ADN compactado y suelen aparecer en pares. Estos cuerpos de polifosfato pueden ser los proveedores de fosfato para la síntesis de ADN.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo visualizar la ultraestructura de células bacterianas completas cerca del estado vivo en el punto de tiempo apropiado mediante microscopía electrónica criogénica de alto voltaje sin ningún tratamiento adicional como la tinción. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que el estado de compactación del ADN cambia con cada minuto al final del ciclo de luz. Asegúrate de no perderte el mejor momento para congelar la muestra.

Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como CLEM para responder preguntas adicionales sobre la localización de proteínas o nucleótidos específicos en el ADN compactado. Después de su desarrollo, esta técnica debería allanar el camino para que los investigadores en el campo de la microbiología exploren la división celular, la segregación del ADN y la infección viral en bacterias o en pequeños eucariotas.