Un ensayo de unión de alto rendimiento MHC II para el análisis cuantitativo del péptido epítopos

El objetivo general de este procedimiento es cuantificar la unión de péptidos cortos con las proteínas inmunitarias humanas MHC clase II mediante un ensayo de alta capacidad en placas de 384 pozos. Esto se logra primero realizando ensayos de unión por competencia en fase acuosa con los péptidos de interés. En el segundo paso, los complejos péptido-MHC clase II en equilibrio se capturan mediante un anticuerpo anti-MHC clase II inmovilizado en placas ELISA de alta unión.

A continuación, los complejos capturados se incuban con estreptavidina marcada con opio y luego se eliminan por lavado la estreptavidina no unida; posteriormente, se activa el opio capturado. Finalmente, se puede utilizar fluorometría de tiempo resuelto para cuantificar los niveles del péptido control capturado por MHC clase II. Este método puede proporcionar información preliminar sobre el potencial inmunogénico de las proteínas diana.

Es especialmente útil para validar la salida de predictores in silico. Comience el procedimiento añadiendo 25 microlitros de una solución de anticuerpo L 2 43 recién diluida a cada pocillo de una placa ELIZA blanca de 84 pocillos de alta unión. Selle la placa con una película de poliéster e incúbela durante la noche a cuatro grados Celsius. A continuación, comience con un stock de 10 milimolar de cada muestra de prueba.

Prepare la siguiente serie de diluciones de péptido y DMSO, y tampón citrato fosfato, utilizando tres placas de polipropileno de 84 pozos. Tenga en cuenta que una placa completa de polipropileno de 84 pozos requiere tres placas EIA separadas, como se ilustra. A continuación, diluya las soluciones stock seleccionadas de MHC II hasta una concentración de 101 nanomolar en tampón de reacción, utilizando un tubo cónico de 15 mililitros.

Luego, diluya el péptido control desde 20 micromolar hasta una proporción de uno a 100 en la mezcla maestra de MHC II recién preparada y agregue 21,5 microlitros de la mezcla maestra de MHC II con péptido control al control positivo. En el pocillo de la placa de polipropileno de 384 pocillos, agregue la mezcla maestra de MHC II que contiene el péptido control a cada una de las diluciones del péptido de prueba en una proporción uno a uno para crear la reacción de unión en este momento también. Finalmente, selle la reacción de unión con una película de poliéster e incube la placa durante 12 a 24 horas en un incubador sin control de dióxido de carbono a 37 grados Celsius sin agitación.

Al día siguiente, diluya los pocillos de la reacción de unión en la placa de 384 pocillos a una proporción uno a uno con tampón de neutralización. Luego lave la placa ELISA tres veces con 60 microlitros por pocillo de PBS al 0,05 % entre cada transferencia. A continuación, transfiera 25 microlitros de cada solución de reacción de unión neutralizada de la placa de 384 pocillos, en réplicas triples, a la placa de 384 pocillos recubierta con anticuerpo.

Coloque bien la placa Eliza, luego incube la placa ELIZA cubierta con una película de poliéster a cuatro grados Celsius durante la noche. Después de la incubación, lave la placa ELIZA tres veces como se acaba de demostrar, y luego agregue 25 microlitros de estreptavidina diluida recientemente a cada pozo. Incube la placa cubierta con una película de poliéster, en la oscuridad y a temperatura ambiente, durante una hora.

Durante la incubación, llevar también a temperatura ambiente, en la oscuridad y tras una hora, 10 mililitros de solución de potenciación por placa, lavar la placa ELIZA como se ha demostrado, y luego añadir 25 microlitros de solución de potenciación a cada pocillo e incubar la placa cubierta con una película de poliéster durante 10 a 15 minutos en la oscuridad. Finalmente, leer la fluorescencia con un lector de placas fluorescente de resolución temporal con ajustes de opio. En este experimento representativo, se analizó una secuencia peptídica madura de enterobacter Cloe P nueve nueve beta-lactamasa para identificar posibles péptidos ligantes del alelo MHC dos.

Se identificaron 117 péptidos no o de DRB1*15:01 con un residuo ancla P1 obligatorio en la posición 1, necesario para la unión a MHC II a un umbral del 5%. Los péptidos con puntuaciones mayores o iguales a 2.6 probablemente sean ligantes. Por lo tanto, al umbral del 5%, solo los 11 péptidos superiores se predicen que se unen a MHC II DRB1*15:01.

Se seleccionó un panel representativo de epítopos predichos para su análisis en este ensayo de unión a MHC II. Se sintetizaron químicamente fragmentos peptídicos de beta-lactamasa de estos 15 residuos de modo que los epítopos putativos de MHC II de nueve aminoácidos quedaran incluidos dentro de sus fragmentos proteicos sintéticos. A continuación, se analizó la capacidad de estos péptidos sintéticos para competir con un péptido de control biotinilado de proteína básica de mielina B por la unión a MHC II DRB1*15:01, tal como se acaba de demostrar.

Las curvas de unión competitiva para los péptidos sintéticos se ilustran aquí. Los valores de IC50 se calcularon ajustando los datos transformados logarítmicamente mediante la función de ajuste no lineal de unión competitiva de un solo sitio del programa Prism. Como se muestra en la tabla y en el gráfico, los péptidos se agruparon naturalmente en tres categorías: péptidos con fuerte unión, con un IC50 menor a un micromolar; péptidos con unión moderada, con un IC50 mayor o igual a un micromolar, pero menor a 100 micromoles; y péptidos con unión débil, con un IC50 mayor o igual a 100 micromoles. Tras su desarrollo.

Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en los campos de la inmunología molecular y el diseño de biofármacos exploraran más completamente los eventos clave de reconocimiento molecular que subyacen a las respuestas inmunitarias anti proteína en pacientes humanos.