Un ensayo de unión de alto rendimiento MHC II para el análisis cuantitativo del péptido epítopos

El objetivo general de este procedimiento es cuantificar la unión de péptidos cortos con MHC humano, dos proteínas inmunitarias, utilizando un ensayo de placa de 3 84 pocillos de alto rendimiento. Esto se logra realizando primero ensayos de unión de competencia en fase de solución con los péptidos de interés. En el segundo paso, se capturan los dos complejos del péptido MHC equilibrado con un anticuerpo anti MHC dos inmovilizado en placas ELIZA de alta unión.

A continuación, los complejos capturados se incuban con el opio marcado con estreptavidina y luego la estreptavidina no unida se lava y se activa el opio capturado. En última instancia, la fluorometría resuelta en el tiempo se puede utilizar para cuantificar los niveles de MHC dos péptidos de control capturados. Este método puede proporcionar información preliminar sobre el potencial inmunogénico de las proteínas diana.

Es particularmente útil para validar la salida de predictores in silico, Comience el procedimiento agregando 25 microlitros de solución de anticuerpos L 2 43 recién diluida a cada pocillo de un 3 84. La placa ELIZA blanca de alta unión selló la placa con una película de poliéster y la incubó durante la noche a cuatro grados centígrados. A continuación, se comienza con una culata de 10 milimolares de cada prueba.

El péptido y el DMSO hacen la siguiente serie de dilución y tampón de fosfato de citrato utilizando placas de polipropileno de 3 84 pocillos. Tenga en cuenta que una placa completa de polipropileno de 3 84 pocillos requiere tres placas EIA separadas como se ilustra. A continuación, diluya las dos soluciones madre MHC seleccionadas hasta una concentración de 101 nanomolares en tampón de reacción utilizando un tubo cónico de 15 mililitros.

A continuación, diluya el péptido de control de 20 micromolares a una proporción de uno a 100 en la mezcla maestra MHC dos recién preparada y añada 21,5 microlitros de la mezcla maestra MHC dos con péptido de control al control positivo. Bueno, de la placa de polipropileno de 3 84 pocillos, agregue la mezcla maestra MHC dos que contiene péptido de control a cada una de las diluciones de péptidos de prueba en una proporción de uno a uno para crear la reacción de unión en este momento también. Finalmente, selle la reacción de unión con una película de poliéster e incube la placa durante 12 a 24 horas en una incubadora sin control de dióxido de carbono a 37 grados centígrados sin agitar.

Al día siguiente, diluir los pocillos de reacción de unión en el 3 84. Placa de pocillo en una proporción de uno a uno con tampón de neutralización. A continuación, lavar la placa Eliza tres veces con 60 microlitros por pocillo de PBS 0,05% entre 20 siguientes transferencias, 25 microlitros de cada solución de reacción de unión neutralizada de la placa de 3 84 pocillos por triplicado a la 3 84 recubierta de anticuerpos.

Bueno, la placa Eliza luego incuba la placa ELIZA cubierta con una película de poliéster a cuatro grados centígrados durante la noche después de la incubación. Lave la placa ELIZA tres veces, como se acaba de demostrar, y luego agregue 25 microlitros de estreptococo opio recién diluido a cada uno. Incubar bien la placa cubierta con una película de poliéster en la oscuridad a temperatura ambiente durante una hora.

Durante la incubación, lleve 10 mililitros de solución de mejora por placa a temperatura ambiente también en la oscuridad después de una hora, lave la placa ELIZA como se muestra y luego agregue 25 microlitros de solución de mejora a cada pocillo e incube la placa cubierta con una película de poliéster durante 10 a 15 minutos en la oscuridad. Finalmente, lea la fluorescencia con un lector de placas fluorescentes resueltas en el tiempo con configuraciones de opio. En este experimento representativo, se analizó una secuencia peptídica madura de enterobacter Cloe P nine nine beta-lactamasas en busca de posibles aglutinantes peptídicos para el alelo MHC dos.

Se identificaron DRB uno, quince oh, ciento diecisiete no péptidos o péptidos con un residuo de anclaje P uno obligatorio en la posición uno que se requiere para la unión de MHC dos a un umbral del 5% solamente. Los péptidos con puntuaciones mayores o iguales a 2,6 son probablemente aglutinantes. Por lo tanto, en el umbral del 5%, se predice que solo los 11 péptidos principales se unirán al MHC dos DRB 1 15 0 1.

Se seleccionó un panel representativo de epítopos predichos para el análisis en este ensayo de unión MHC dos. Los fragmentos de péptidos betalactamasas de estos 15 residuos se sintetizaron químicamente de tal manera que los epítopos MHC nonamer putativos dos se incrustaron dentro de sus fragmentos de proteínas sintéticas. A continuación, se analizó la capacidad de estos péptidos sintéticos para competir con un péptido de control de proteína B básica de mielina biotinilada para unirse a MHC dos DRB 1 15 0 1, como se acaba de demostrar.

Aquí se ilustran las curvas de unión competitivas para los péptidos sintéticos. Los valores de IC 50 se calcularon ajustando los datos de la transformación logarítmica utilizando la función de ajuste no lineal de enlace competitivo de un sitio del prisma. Como se demuestra en la tabla como se ve en el gráfico, los péptidos se dividen naturalmente en tres grupos, aglutinantes fuertes con un IC 50 de menos de un micromolar, aglutinantes moderados con un IC 50 mayor o igual a un micromolar, pero menos de 100 micromolares y aglutinantes débiles con un IC 50 de mayor o igual a 100 micromolares después de su desarrollo.

Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en los campos de la inmunología molecular y el diseño bioterapéutico exploraran más a fondo los eventos clave de reconocimiento molecular que subyacen a las respuestas inmunitarias antiproteínas en pacientes humanos.