Optimalisatie van de instellingen en voorwaarden voor ex vivo elektroretinogram om de retinafunctie in kleine en grote ogen te bestuderen

Dit protocol toont de omstandigheden aan die nodig zijn om de retinale functie in ex vivo ERG te behouden, met name de extreem gevoelige B-golf geproduceerd door ON-bipolaire cellen. Met ex vivo ERG kunnen we de functie van verschillende soorten retinale neuronen met een hoge signaal-ruisverhouding meten, terwijl we de gemakkelijke introductie van farmacologische middelen mogelijk maken. Deze methode is bijzonder vatbaar voor het kwantificeren van de werkzaamheid van farmacologische middelen op de retinale functie en ziekte.

Om te beginnen, converteer een multi-elektrode array setup door de ex vivo ERG monsterhouder aan te sluiten op een differentiële versterker via een headstage. De versterker moet worden aangesloten op de analoge ingang van de interfacekaart van het multi-elektrode arraysysteem. Gebruik de opnamesoftware voor de multi-elektrode array om de invoergegevens van de ex vivo ERG op te nemen en op te slaan.

Stel de versterking van de differentiële versterker in op 100 en voeg een extra 10X spanningsversterking toe, afhankelijk van de digitizerspecificaties. Stel het laagdoorlaatfilter in op 100 hertz. Als alternatief, om een patchklemopstelling om te zetten, sluit u de ex vivo ERG-monsterhouder via een headstage aan op een differentiële versterker, die moet worden aangesloten op de headstage van de patchklemversterker.

Gebruik de patchklemsysteemsoftware en de digitizer om de invoergegevens van de ex vivo ERG op te nemen en op te slaan. Stel de parameters in zoals eerder weergegeven. Sluit LED's met de juiste golflengten aan op de microscoop.

Om lichtprikkels te regelen, gebruikt u een LED-driver die wordt bestuurd door analoge uitgangen van een digitizer. Bedien de LED's met opnamesoftware die het activeren van lichtprikkels mogelijk maakt. Kalibreer vervolgens de lichtopbrengst van de LED's op de positie van het netvlies in de monsterhouder met behulp van een fotodiode.

Plaats indien nodig filters met neutrale dichtheid om de lichtintensiteit in het lichtpad te dimmen. Om de elektrode voor te bereiden, plaatst u een zilverchloride pelletelektrode in een draadgeleider. Vul de binnenkant van de kunstaasconnector met hete lijm en steek een socket van twee millimeter in de hete lijm vanaf de niet-schroefdraadzijde.

Soldeer een zilveren draad van de EP-1 elektrode aan de twee millimeter aansluiting. Schroef de afgewerkte elektrode met een O-ring op de schroefdraad in de elektrodepoorten van de ex vivo ERG-monsterhouder. Voor grote ogen, inclusief menselijke donorogen, reinigt u de bol van het resterende bindweefsel en verwijdert u het voorste segment en de lens.

Gebruik een scalpel om een snee te maken op ongeveer drie millimeter van de limbus. Steek een gebogen dissectieschaar in de incisie en knip langs de limbus om het voorste deel van het oog met de lens te verwijderen. Verkrijg retinale monsters voor ex vivo elektroretinografie met een wegwerpbiopsiepunch van drie tot zes millimeter.

Om het weefsel op de monsterhouder te monteren, plaatst u de onderste helft van de monsterhouder in een grote petrischaal en vult u deze met zuurstofrijk Ames'medium, zodat de koepel van de monsterhouder gewoon wordt ondergedompeld. Pak de rand van het netvlies voorzichtig vast met een fijne tang en breng het netvlies over op de koepel van de ex vivo monsterhouder, fotoreceptorzijde naar boven gericht. Til de monsterhouder uit de Ames'-oplossing en zorg ervoor dat het netvlies op zijn plaats blijft.

Droog de plaat van de monsterhouder volledig om ruis, elektrische overspraak en signaal rangeren te minimaliseren. Monteer vervolgens beide helften van de monsterhouder met vier schroeven en sluit de perfusielijn aan. Drijf de elektrode aan in de onderste helft van de monsterhouder en sluit de anodekabel aan op de binnenste retinale kant en de kathodekabel op de fotoreceptorzijde.

Perfuseer de monsterhouder met ten minste één milliliter per minuut zuurstofrijk Ames'medium gedurende 10 tot 20 minuten om de lichtrespons te laten stabiliseren. Ex vivo ERG maakte de opname van fotoreceptor- en ON-bipolaire cellichtreacties van het netvlies van de muis mogelijk. Registratie van fotoreceptorreacties van menselijke donorvliezen was mogelijk met tot vijf uur postmortale vertraging van enucleatie en minder dan 20 minuten vertraging voor ON-bipolaire celresponsen.

Onder ideale omstandigheden waren responsamplitudes en kinetiek in beide celtypen relatief stabiel in de loop van de tijd, maar vertoonden een langzame afname 40 tot 45 minuten nadat netvliezen op de monsterhouder waren gemonteerd. Verminderde temperatuur in de monsterhouder vertraagde de kinetiek van zowel fotoreceptoren als ON-bipolaire cellen aanzienlijk. Het verminderde echter de amplitude van de B-golf, maar niet de A-golf.

Omgekeerd verminderde het vertragen van de perfusiesnelheid de amplitudes van zowel fotoreceptor- als ON-bipolaire celresponsen, maar had geen invloed op de impliciete tijd van de A- of de B-golf. Stopzetting van de perfusie gedurende 10 minuten gevolgd door reperfusie resulteerde in een volledig verlies van ON-bipolaire celfunctie met geconserveerde fotoreceptorresponsen. Voldoende perfusiesnelheid en fysiologische temperatuur zijn van cruciaal belang voor het verkrijgen van stabiele responsen, met name van ON-bipolaire cellen in de ex vivo ERG.

Dit protocol maakt het mogelijk om de verschillen in fotoreceptorfunctie in de menselijke macula en periferie diepgaand te onderzoeken en vragen te beantwoorden die voorheen alleen bij niet-menselijke primaten konden worden uitgevoerd.