Name: Identificación global de redes de interacción co-traslacional mediante perfiles selectivos de ribosomas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-07T13:45:00.000+00:00
Duration: 6 min 58 s
Description: Aprende a identificar redes de interacción co-traslacional mediante perfiles selectivos de ribosomas en Saccharomyces cerevisiae. Este método permite estudiar modificaciones de cadenas nacientes y su impacto en enfermedades.

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Nos gustaría agradecer a todos los miembros del laboratorio por las fructíferas discusiones y a Muhammad Makhzumy por la lectura crítica del manuscrito. Este trabajo fue financiado por la subvención 2106/20 de la ISF (Fundación Israelí para la Ciencia).

<ol><li>Oh, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+ribosome+profiling+reveals+the+cotranslational+chaperone+action+of+trigger+factor+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Selective ribosome profiling reveals the cotranslational chaperone action of trigger factor in vivo.</a> Cell. 147 (6), 1295-1308 (2011).</li>
<li>Shiber, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cotranslational+assembly+of+protein+complexes+in+eukaryotes+revealed+by+ribosome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cotranslational assembly of protein complexes in eukaryotes revealed by ribosome profiling.</a> Nature. 561 (7722), 268-272 (2018).</li>
<li>Becker, A. H., Oh, E., Weissman, J. S., Kramer, G., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+ribosome+profiling+as+a+tool+for+studying+the+interaction+of+chaperones+and+targeting+factors+with+nascent+polypeptide+chains+and+ribosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Selective ribosome profiling as a tool for studying the interaction of chaperones and targeting factors with nascent polypeptide chains and ribosomes.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2212-2239 (2013).</li>
<li>Galmozzi, C. V., Merker, D., Friedrich, U. A., Döring, K., Kramer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+ribosome+profiling+to+study+interactions+of+translating+ribosomes+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Selective ribosome profiling to study interactions of translating ribosomes in yeast.</a> Nature Protocols. , (2019).</li>
<li>Knorr, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome-NatA+architecture+reveals+that+rRNA+expansion+segments+coordinate+N-terminal+acetylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Ribosome-NatA architecture reveals that rRNA expansion segments coordinate N-terminal acetylation.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 26 (1), 35-39 (2019).</li>
<li>Matsuo, Y., Inada, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ribosome+collision+sensor+Hel2+functions+as+preventive+quality+control+in+the+secretory+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">The ribosome collision sensor Hel2 functions as preventive quality control in the secretory pathway.</a> Cell Reports. 34 (12), (2021).</li>
<li>Döring, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+Ssb-Nascent+chain+interactions+reveals+principles+of+Hsp70-assisted+folding%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Profiling Ssb-Nascent chain interactions reveals principles of Hsp70-assisted folding.</a> Cell. , (2017).</li>
<li>Chartron, J. W., Hunt, K. C. L., Frydman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cotranslational+signal-independent+SRP+preloading+during+membrane+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cotranslational signal-independent SRP preloading during membrane targeting.</a> Nature. 536 (7615), 224-228 (2016).</li>
<li>Janke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+toolbox+for+PCR-based+tagging+of+yeast+genes%3A+New+fluorescent+proteins%2C+more+markers+and+promoter+substitution+cassettes%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">A versatile toolbox for PCR-based tagging of yeast genes: New fluorescent proteins, more markers and promoter substitution cassettes.</a> Yeast. 21 (11), 947-962 (2004).</li>
<li>Levi, O., Arava, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+CRISPR%2FCas9+Toolbox+for+Gene+Engineering+in+S.+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Expanding the CRISPR/Cas9 Toolbox for Gene Engineering in S. cerevisiae.</a> Current Microbiology. 77 (3), 468-478 (2020).</li>
<li>Giannoukos, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+robust+RNA-seq+process+for+cultured+bacteria+and+complex+community+transcriptomes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Efficient and robust RNA-seq process for cultured bacteria and complex community transcriptomes.</a> Genome Biology. 13 (3), 23(2012).</li>
<li>Guide, P. Illumina Index Adapters - Pooling Guide. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/chemistry_documentation/experiment-design/index-adapters-pooling-guide-1000000041074-05.pdf">https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/chemistry_documentation/experiment-design/index-adapters-pooling-guide-1000000041074-05.pdf</a> (2019).</li>
<li>Kanagawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bias+and+artifacts+in+multitemplate+polymerase+chain+reactions+%28PCR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bioscience+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Bias and artifacts in multitemplate polymerase chain reactions (PCR).</a> Journal of Bioscience and Bioengineering. 96 (4), 317-323 (2003).</li>
<li>Bertolini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+nascent+proteins+translated+by+adjacent+ribosomes+drive+homomer+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Interactions between nascent proteins translated by adjacent ribosomes drive homomer assembly.</a> Science. 371 (6524), (2021).</li>
<li>Kramer, G., Shiber, A., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+cotranslational+maturation+of+newly+synthesized+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of cotranslational maturation of newly synthesized proteins.</a> Annual Review of Biochemistry. 88, 337-364 (2019).</li>
<li>Joazeiro, C. A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+and+functions+of+ribosome-associated+protein+quality+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms and functions of ribosome-associated protein quality control.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (6), 368-383 (2019).</li>
<li>Beaupere, C., Chen, R. B., Pelosi, W., Labunskyy, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+quantification+of+translation+in+budding+yeast+by+ribosome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Genome-wide quantification of translation in budding yeast by ribosome profiling.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (130), e56820(2017).</li>
</ol>

Los autores declaran que no hay conflictos de intereses.

Aquí, el protocolo detalla el enfoque de perfil selectivo de ribosomas para capturar interacciones co-traduccionales en resolución cercana al codón. A medida que el ribosoma se eleva como un centro para coordinar la aparición de la cadena naciente en el citoplasma abarrotado, este es un método crucial para identificar y caracterizar las diversas interacciones co-traduccionales necesarias para garantizar un proteoma funcional, así como para estudiar diversas enfermedades. Hasta la fecha, SeRP es el único método que puede ...

Elrofiling Ribosome P(SeRP) es el único método, hasta la fecha, que captura y caracteriza las interacciones co-traslacionales, in vivo, de manera directa 1,2,3,4,5,6. SeRP permite el perfil global de las interacciones de cualquier factor con la traducción de ribosomas en resolución de codón cercano 2,7.
El método se basa en la congelación instantánea de las células en crecimiento y la preservación de la traducción activa. Los lisados celulares se tratan con RNasa I para digerir todo el ARNm en la célula, excepto los fragmentos de ARNm protegidos por ribosomas denominados "huellas de ribosomas". La muestra se divide entonces en dos partes; una parte se utiliza directamente para el aislamiento de todas las huellas ribosómicas celulares, que representan toda la traducción en curso en la célula. La segunda parte se utiliza para la afinidad-purificación del subconjunto específico de ribosomas asociados con un factor de interés, por ejemplo: enzimas modificadoras, factores de translocación, chaperonas plegables e interacciones complejo-ensamblaje. Las huellas ribosómicas purificadas por afinidad se denominan colectivamente el interactoma. Luego, los ARNm protegidos por ribosomas se extraen y se utilizan para la generación de bibliotecas de ADNc, seguidos de una secuenciación profunda.
El análisis comparativo de las muestras totales de translatoma e interactoma permite la identificación de todos los orfs que se asocian con el factor de interés, así como la caracterización de cada perfil de interacción orf. Este perfil informa las secuencias precisas de inicio y terminación del compromiso a partir de las cuales se pueden inferir los codones decodificados y los residuos respectivos de la cadena polipeptídica emergente, así como sobre las variaciones de velocidad del ribosoma durante la interacción 7,8. La figura 1 muestra el protocolo como un esquema.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62878/62878fig1v2.jpg"> Figura 1: Una visión general del protocolo SeRP. Este protocolo se puede realizar en su totalidad en un plazo de 7-10 días. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62878/62878fig1v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>3'-Fosforilado 28 nt RNA control oligonucleótido</td><td>IDT</td><td>pedido personalizado</td><td>RNasa purificación de HPLC sin RNasa; 5'-AUGUAGUCGGAGUCGAGGCGC GACGCGA/3Phos/-3'Etanol</td></tr> <tr><td>absoluto</td><td>VWR</td><td>20821</td><td></td></tr><tr><td>Fenol ácido&ndash; cloroformo</td><td>Ambion</td><td>AM9722</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo: anti-HA monclonal de ratón</td><td>Merck</td><td>11583816001</td><td>12CA5</td></tr><tr><td>Aprotinina</td><td>Roth</td><td>A162.3</td><td></td></tr><tr><td>ATP*</td><td>NEB</td><td>P0756S</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Bacto agar</td><td>BD</td><td>214030</td><td></td></tr><tr><td>Bacto peptona</td><td>BD</td><td>211820</td><td></td></tr><tr><td>Bacto triptona</td><td>BD</td><td></td><td></td>211699</tr><tr><td>Extracto de levadura Bacto</td><td>BD</td><td>212720</td><td></td></tr><tr><td>Clorhidrato de bestatina</td><td>Roth</td><td>2937.2</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformo</td><td>Merck</td><td>102445</td><td></td></tr><tr><td>CircLigasa II ssDNA Ligasa*</td><td>Epicentro</td><td></td><td>CL9025K 100 U/&mu; L</td></tr><tr><td>Solución de tinción coloidal de Coomassie</td><td>Roth</td><td>4829</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete, comprimidos de cóctel de inhibidores de proteasa sin EDTA</td><td>Roche Diagnostics</td><td>29384100</td><td></td></tr><tr><td>Cicloheximida</td><td>Biological Industries</td><td>A0879</td><td></td></tr><tr><td>Agua filtrada estéril y tratada con DPC*</td><td>Sigma</td><td>95284</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucosa anhidra</td><td>Merck</td><td>G5767-500G</td><td></td></tr><tr><td>Dietilpirocarbonato</td><td>Roth</td><td>K028</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido*</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>276855</td><td></td></tr><tr><td>escalera de ADN, 10 pb O'RangeRuler*</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SM1313</td><td></td></tr><tr><td>Colorante de carga de ADN*</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0631</td><td>6&times;</td></tr><tr><td>DNasa I, Roche recombinante</td><td></td><td>4716728001</td> juego de soluciones dNTP <td>sin ARNasa</td></tr><tr><td>*</td><td>NEB</td><td>N0446S</td><td></td></tr><tr><td>EDTA*</td><td>Roth</td><td>8043</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>VWR</td><td>24388.260.</td><td></td></tr><tr><td>Solución de glicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>67419-1ML-F</td><td>1 M</td></tr><tr><td>GlycoBlue</td><td>Ambion</td><td>AM9516</td><td>15 mg/mL</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Roth</td><td>HN78.3</td><td></td></tr><tr><td>HF Phusion polimerasa*</td><td>NEB</td><td>M0530L</td><td></td></tr><tr><td>HK de S. cerevisiae</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6380-1.5KU</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorhídrico</td><td>AppliChem</td><td>A1305</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>33539</td><td></td></tr><tr><td>Isopropilo &beta;-D-1-tiogalactopiranósido</td><td>Roth</td><td>CN08</td><td></td></tr><tr><td>Kanamicina</td><td>Roth</td><td>T832.4 KCl</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Roth</td><td>6781.1</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Roth</td><td>3904.1</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptina</td><td>Roth</td><td>CN33.4</td><td></td></tr><tr><td>Linker L(rt)</td><td>IDT</td><td>pedido</td><td></td>personalizado</tr><tr><td>Nitrógeno</td><td></td><td></td><td></td>líquido</tr><tr><td>MgCl2</td><td>Roth</td><td>KK36.3</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Roth</td><td>P030.2</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4&middot; 2H2O Roth</td><td></td><td>T879.3</td><td></td></tr><tr><td>NaCl*</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>AM97606 5 M</td></tr><tr><td>NaH2PO4&middot; H2O</td><td>Roth</td><td>K300.2</td><td></td></tr><tr><td>Activado por el NHS Sepharose 4 perlas de flujo rápido</td><td>GE Life Sciences</td><td>17090601</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P 40 sustituto</td><td>Sigma</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>Pepstatina A</td><td>Roth</td><td>2936.2</td><td></td></tr><tr><td>Fluoruro de fenilmetilsulfonilo</td><td>Roth</td><td>6367</td><td></td></tr><tr><td>Geles prefabricados</td><td>Bio-Rad</td><td>5671034</td><td>10% y 12%</td></tr><tr><td>RNasa I</td><td>Ambion</td><td>AM2294</td><td></td></tr><tr><td>SDS, 20%</td><td>Ambion</td><td>AM9820</td><td>Libre de RNasa</td></tr><tr><td>Acetato de sodio*</td><td>Ambion</td><td>AM9740</td><td>3 M, pH 5.5</td></tr><tr><td>Azida de sodio</td><td>Merck</td><td>S8032-100G</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Roth</td><td>9265</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio*</td><td>Sigma</td><td>S2770</td><td>1 N</td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>16104</td><td></td></tr><tr><td>SUPERasa-En inhibidor de la RNasa</td><td>Ambion</td><td>AM2694</td><td></td></tr><tr><td>Superscript III Transciptasa inversa*</td><td>Invitrogen</td><td>18080-044</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Gold*</td><td>Invitrogen</td><td>S11494</td><td></td></tr><tr><td>T4 polinucleótido quinasa*</td><td>NEB</td><td>M0201L</td><td></td></tr><tr><td>T4 ARN ligasa 2*</td><td>NEB</td><td>M0242L</td><td></td></tr><tr><td>Gel de poliacrilamida TBE *</td> <td>Novex</td><td>EC6215BOX</td><td>8%</td></tr> <tr><td>TBE&ndash; gel de poliacrilamida de urea*</td><td>Novex</td><td>EC68752BOX</td><td>10%</td></tr><tr><td>TBE&ndash; gel de poliacrilamida de urea*</td><td>Novex</td><td>EC6885BOX</td><td>15%</td></tr><tr><td>TBE&ndash; tampón de muestra de urea *</td> <td>Novex</td><td>LC6876</td><td>2 y veces;</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Roth</td><td>4855</td><td></td></tr><tr><td>Tris*</td><td>Ambion</td><td>AM9851</td><td>1 M, pH 7.0</td></tr><tr><td>Tris*</td><td>Ambion</td><td>AM9856</td><td>1 M, pH 8.0</td></tr><tr><td>UltraPure 10&times; Tampón TBE*</td><td>Invitrogen</td><td>15581-044</td><td></td></tr><tr><td>* - para la junta de preparación</td><td></td><td></td><td></td>de la biblioteca</tr><tr><td>y la abrazadera de resorte, 90 mm,Millipore</td><td></td><td>&nbsp; </td><td></td>XX1009020</tr><tr><td>matraz de junta molida 1 L ,</td><td>Millipore</td><td>XX1504705</td><td></td></tr></tbody></table>

identificación global de redes de interacción co-traslacional mediante perfiles selectivos de ribosomas

Global Identification of Co-Translational Interaction Networks by Selective Ribosome Profiling

En los últimos años, se ha hecho evidente que los ribosomas no solo decodifican nuestro ARNm, sino que también guían la aparición de la cadena polipeptídica en el entorno celular abarrotado. Los ribosomas proporcionan la plataforma para la unión controlada espacial y cinéticamente de factores dirigidos a la membrana, enzimas modificadoras y chaperonas plegables. Incluso el ensamblaje en complejos oligoméricos de alto orden, así como los pasos de formación de la red proteína-proteína, se descubrieron recientemente que estaban coordinados con la síntesis.
Aquí, describimos el Perfil Selectivo de Ribosomas, un método desarrollado para capturar interacciones co-traslacionales in vivo. Detallaremos los diversos pasos de purificación de afinidad necesarios para capturar complejos de cadena ribosómica-naciente junto con interactores co-traduccionales, así como la extracción de ARNm, la exclusión de tamaño, la transcripción inversa, la secuenciación profunda y los pasos de análisis de big data, necesarios para descifrar las interacciones co-traduccionales en resolución cercana al codón.

Como se ilustra en el diagrama de flujo de este protocolo (Figura 1), las células se cultivaron hasta la fase de registro, y luego se recolectaron rápidamente por filtración y se lisaron mediante molienda criogénica. El lisado se dividió en dos: uno para las huellas totales de ARNm protegido por ribosomas y el otro para las huellas de ARNm protegidas por ribosomas seleccionadas, en las que realizamos la purificación de afinidad para reducir los complejos de cadenas nacientes proteína-ribosom...

Las interacciones co-traslacionales juegan un papel crucial en las modificaciones de la cadena naciente, la orientación, el plegado y las vías de ensamblaje. Aquí, describimos el Perfil Selectivo de Ribosomas, un método para el análisis directo in vivo de estas interacciones en el modelo eucariota Saccharomyces cerevisiae.

Identificación global de redes de interacción co-traslacional mediante perfiles selectivos de ribosomas

In recent years, it has become evident that ribosomes not only decode our mRNA but also guide the emergence of the polypeptide chain into the crowded ...

Las interacciones co-traslacionales juegan un papel crucial en las modificaciones de cadena nacientes dirigidas a las vías de plegado y ensamblaje. Aquí, describimos el perfil selectivo de ribosomas, un método para el análisis directo in vivo de estas interacciones en el modelo eucariota Saccaromyces cerevisiae. El perfil selectivo de ribosomas es el único método hasta la fecha que captura y caracteriza las interacciones co-traduccionales in vivo de manera directa.El perfil selectivo de ribosomas permite el perfil global de cualquier factor e interacción con la traducción de ribosomas en resolución cercana al codón. Comience recolectando las células de levadura construidas que contienen las proteínas marcadas deseadas. Realice la lisis celular utilizando la molienda criogénica en un molino mezclador dos veces durante dos minutos a 30 hercios.Centrifugar durante dos minutos a 30.000 veces G a cuatro grados centígrados para limpiar el lisado y recoger el sobrenadante. Transfiera 200 microlitros del sobrenadante a un tubo de microcentrífuga para el análisis total de ARN y 700 microlitros a un tubo de microcentrífuga para inmunopurificación. Digiera la muestra de ARN total previamente separada utilizando 10 unidades de RNasa I durante 25 minutos a cuatro grados Celsius en una rejilla de mezcla giratoria a 30 rotaciones por minuto.Prepare la mezcla maestra de cojín de sacarosa como se describe en el manuscrito de texto. Luego, cargue la muestra en 400 microlitros del cojín de sacarosa y la centrífuga durante 90 minutos a 245, 000 veces G y a cuatro grados Celsius. Retire el sobrenadante rápidamente con una bomba de vacío y superponga pellets con 150 microlitros de tampón de lisis.Asegure la muestra con una envoltura de parafina y vuelva a suspender los gránulos agitando durante una hora a cuatro grados centígrados a 300 rotaciones por minuto. Lave de 100 a 400 microlitros de la matriz de unión de afinidad por muestra tres veces con un mililitro de tampón de lisis resuspiendo la matriz de afinidad en el tampón de lisis. Luego, gire a 30 rotaciones por minuto con una rejilla de mezcla giratoria a cuatro grados Celsius durante cinco minutos.Precipitado por centrifugación. Deseche el líquido superior y repita este proceso tres veces. Agregue la matriz de unión a la afinidad a la muestra de inmunopurificación previamente separada y digiera con RNasa I.Gire durante 25 minutos a 30 rotaciones por minuto y cuatro grados Celsius con un bastidor de mezcla giratorio para unir la proteína a la matriz de afinidad.Prepare la mezcla maestra del tampón de lavado como se describe en el manuscrito de texto. Lave la matriz de unión de afinidad con un mililitro de tampón de lavado durante aproximadamente un minuto, girando en la rejilla de mezcla. A continuación, precipitar por centrifugación a 3000 veces G durante 30 segundos a cuatro grados centígrados y desechar el líquido superior.Repetir tres veces. Lave dos veces más en un mililitro de tampón de lavado, cada vez durante cinco minutos, girando en la rejilla de mezcla. Precipitar de nuevo por centrifugación.Utilice 50 microlitros de perlas para la elución de proteínas con la misma cantidad de tampón de muestra 2X. Centrifugar para peletizar las perlas y desechar el líquido superior. Elute con 700 microlitros de Tris 10 milimolares.Luego, congelar en nitrógeno líquido. Retire la muestra del nitrógeno líquido y guárdela a menos 80 grados centígrados para ser utilizada para la posterior extracción de ARN. Evaluar el éxito del paso de purificación de afinidad mediante tinción de Western blot o Coomassie con alícuotas de cada paso utilizando IP simulada en una cepa no etiquetada de tipo salvaje como control para la unión no específica a la matriz de afinidad.Los resultados de Western blot después de la purificación por afinidad demostraron el éxito de la expresión de proteínas marcadas. El aislamiento de las huellas protegidas por ribosomas se validó utilizando los resultados del bioanalizador. Al generar una biblioteca de ADNc para la secuenciación profunda y el análisis de big data, el subciclo conduce a un bajo rendimiento.Sin embargo, con los dNTP todavía presentes, la reacción procede, generando artefactos de PCR más largos con secuencias quiméricas debido a que los productos de PCR se ceban a sí mismos. La biblioteca generada fue validada aún más por electroforesis de ADN de alta sensibilidad para la distribución y cuantificación exacta del tamaño. La biblioteca de secuencias se recortó para adaptadores y códigos de barras y las lecturas resultantes se dividieron en diferentes grupos de secuencias de codificación, intrones y secuencias intergénicas.Los perfiles de ribosomas que analizan las interacciones co-traduccionales de Vma2p con chaperonas asociadas a ribosomas Ssb1p, Pfk2p y Fas1p se muestran aquí con el esquema experimental de cada purificación de afinidad. Hubo ocupación de ribosomas a lo largo del marco de lectura abierto de los traducomas totales en comparación con los interactomas Ssb1, Pfk2p y Fas1p. El enriquecimiento medio de Ssb1p, Pfk2p y Fas1p en cada posición del ribosoma a lo largo del marco de lectura abierto se muestra aquí.Este método permite la identificación y caracterización de las diversas interacciones co-traduccionales, asegurando un proteoma funcional, así como el estudio de diversas enfermedades. Hasta la fecha, el perfil selectivo de ribosomas es el único método que puede capturar y caracterizar estas interacciones de manera directa in vivo.

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Investigación

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Biology

Biología

En este artículo se describe un protocolo para la extracción de la traducción de los ribosomas de las células eucariotas. Una vez extraído, ribosomas están separados en monosomes y polirribosomas por fraccionamiento en gradiente de sacarosa para permitir que las diferentes poblaciones de ribosomas para ser analizados. Por lo tanto, este método es el estándar de oro para el examen de la regulación de la traducción.

Análisis eucariotas perfil Polyribosome

Una técnica para identificar sitios traduccionales pausa en ARNm se describe. Este procedimiento se basa en el aislamiento de polipéptidos nacientes acumulan en los ribosomas durante la traducción in vitro de un ARNm diana, seguido por el análisis del tamaño de las cadenas nacientes utilizando una electroforesis en gel de desnaturalización.

El aislamiento de los ribosomas polipéptidos nacientes Bound<em&gt; In vitro</em&gt; Para la identificación de sitios de traslación pausa a lo largo del ARNm

Este protocolo ilustra modificaciones esenciales de fraccionamiento polyribosome con el fin de estudiar la translatome in vivo de muestras del SNC. Permite la evaluación global de la traducción y transcripción de regulación a través del aislamiento y la comparación de ARN total a ribosoma ARN fracciones unidas.

En Interrogatorio vivo del Sistema Nervioso Central Translatome por Polyribosome Fraccionamiento

Los ribosomas desempeñan un papel central en la síntesis de proteínas. Polyribosome (polisomas) fraccionamiento por centrifugación en gradiente de densidad de sacarosa permite la determinación directa de la eficiencia de traducción de los ARNm individuales en un genoma de gran escala. Además, este método se puede utilizar para el análisis bioquímico de ribosoma y factores de polisomas asociados tales como chaperones y moléculas de señalización.

Polisoma Fraccionamiento y análisis de los mamíferos Translatomes en un genoma de gran escala

La capacidad de las células para adaptarse al estrés es crucial para su supervivencia. La regulación de la traducción del ARNm es una de esas estrategias de adaptación, que proporciona una regulación rápida del proteoma. Aquí, proporcionamos un protocolo estandarizado de perfiles de polisomas para identificar ARNm específicos que se traducen selectivamente en condiciones de estrés.

Evaluación del selectivo ARNm traducción en células de mamífero por polisoma perfiles

Aquí, presentamos un protocolo de captura interactome aplicado a Arabidopsis thaliana protoplastos hoja mesófilo. Este método depende crıticamente de la reticulación UV in vivo y permite el aislamiento e identificación de proteınas de unión a mRNA de plantas desde un entorno fisiológico.

ARNm Interactome Captura de Planta Protoplastos

Regulación traduccional desempeña un papel importante en el control de la abundancia de la proteína. Aquí, describimos un método de alto rendimiento para el análisis cuantitativo de la traducción en la levadura de florecimiento Saccharomyces cerevisiae.

Cuantificación del genoma de traducción en levadura de florecimiento por Ribosome Profiling

Aquí se describen las etapas de la recolección de muestras y la preparación de RIBO-seq en bacterias. La secuenciación de las bibliotecas preparadas de acuerdo con estas directrices da como resultado datos suficientes para un análisis bioinformático exhaustivo. El protocolo que presentamos es simple, utiliza equipos de laboratorio estándar y tarda siete días desde la lisis hasta la obtención de bibliotecas.

RIBO-seq En Bacterias: Una Colección de Muestras Y Protocolo De Preparación De La Biblioteca Para La Secuenciación NGS

Presentamos una técnica para estabilizar rápidamente complejos traslacionales (biosíntesis de proteínas) con reticulación de formaldehído en levaduras vivas y células de mamíferos. El enfoque permite diseccionar intermedios transitorios e interacciones dinámicas ARN:proteína. Los complejos reticulados se pueden utilizar en múltiples aplicaciones posteriores, como en métodos de perfiles basados en secuenciación profunda, microscopía y espectrometría de masas.

Fijación rápida in vivo y aislamiento de complejos traslacionales de células eucariotas

La traducción de ribosomas decodifica tres nucleótidos por codón en péptidos. Su movimiento a lo largo del ARNm, capturado por el perfil de ribosomas, produce las huellas que exhiben una periodicidad de triplete característica. Este protocolo describe cómo usar RiboCode para descifrar esta característica prominente a partir de los datos de perfiles de ribosomas para identificar marcos de lectura abiertos traducidos activamente a nivel de transcriptoma completo.

De novo Identificación de marcos de lectura abiertos traducidos activamente con datos de perfil de ribosomas

Aprende a identificar redes de interacción co-traslacional mediante perfiles selectivos de ribosomas en Saccharomyces cerevisiae. Este método permite estudiar modificaciones de cadenas nacientes y su impacto en enfermedades.

Identificación global de redes de interacción co-traslacional mediante perfiles selectivos de ribosomas

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