Control óptico de una proteína neuronal utilizando un ácido Unnatural Amino genéticamente codificados en las neuronas
28 de marzo de 2016
Aquí, se presenta un procedimiento para activar selectivamente una proteína neuronal con un pulso corto de luz mediante la codificación genética de un aminoácido no natural foto-reactivo en una proteína neuronal diana expresada en neuronas en cultivo o in vivo.
El objetivo general de este procedimiento es controlar ópticamente la función de una proteína neuronal utilizando un aminoácido no natural codificado genéticamente en las neuronas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre la contribución de una proteína neuronal específica a la señalización neuronal en la función cerebral con resolución espacio-temporal. La principal ventaja de esta técnica es que tiene el potencial de ser aplicada a varias proteínas neuronales para lograr la regulación óptica de varios procesos neuronales.
Comience este procedimiento colocando las neuronas del hipocampo en cubreobjetos en una placa de 24 pocillos con 500 microlitros de medio de crecimiento, después de filtrar a través de una malla de nailon de 40 micrómetros. Después de eso, incubar el cultivo neuronal a 35 grados centígrados en una incubadora humidificada con un cinco por ciento de dióxido de carbono y un 95 por ciento de aire durante 2 a 3 semanas. El día de la transfección, prepare una solución fresca de cloruro de calcio 2,5 molares en agua bidestilada y fíltrela estérilmente con un filtro de 0,22 micrómetros.
A continuación, prepare 2X BBS fresco a pH 7 y fíltrelo estérilmente con un filtro de 0,22 micrómetros. Después de eso, reemplace el medio de crecimiento de cultivo con 500 microlitros de medio de transfección fresco y precalentado, y no deseche el medio de crecimiento viejo. Prepare la solución de transfección inmediatamente antes de agregarla al cultivo combinando cloruro de calcio y agua bidestilada, mientras agita lentamente el tubo.
Continúe agitando el tubo y agregue lentamente el ADN a la solución. A continuación, agregue el búfer BBS 2X gota a gota. La preparación del tampón BBS 2X es un paso crítico en la transfección de fosfato de calcio, y es una buena idea calibrar el pH óptimo para el tampón BBS 2X entre 6,90 y 7,15 para nuevas construcciones o preparaciones de ADN.
A continuación, añada inmediatamente 30 microlitros de la solución de transfección a cada cubreobjetos del cultivo neuronal. Agite la placa de cultivo varias veces para mezclar la solución e incube a 35 grados centígrados durante 45 minutos a una hora. Después de aproximadamente una hora, se debe observar una capa fina de precipitados de fosfato de calcio que cubre las neuronas.
A continuación, sustituya el medio de transfección por 500 microlitros de tampón de lavado precalentado e incube a 35 grados centígrados durante 15 a 20 minutos. Los precipitados de fosfato de calcio deben desaparecer después del lavado. Ahora, sustituya el tampón de lavado por 500 microlitros de medios de crecimiento frescos.
A continuación, sustituya los medios de crecimiento por los medios originales guardados. A continuación, se añade al cultivo el aminoácido no natural Cmn premezclado en 50 microlitros de medio de crecimiento tibio, lo que da como resultado una concentración final de un milimolar. Incubar el cultivo transfectado a 35 grados centígrados durante 12 a 48 horas antes del registro.
En este procedimiento, prepare las soluciones extracelulares e intracelulares. En nuestra configuración, el LED con una emisión de 385 nanómetros se instala junto al microscopio para entregar luz a un centímetro de distancia del punto focal en un ángulo de 45 grados. A continuación, extraiga algunas pipetas de parche con un electrodo de vidrio utilizando un microextractor de pipetas.
Después, tome un cubreobjetos de cultivo de neuronas de la incubadora y enjuáguelo una vez en la solución extracelular. Profuse el aparejo con solución extracelular. A continuación, coloque el cubreobjetos en la plataforma del microscopio electrofisiológico, utilizando técnicas estándar de sujeción de parches.
Parche una neurona transfectada con fluorescentes M-citrino. A continuación, registre la actividad neuronal utilizando el método de pinza de corriente. Primero, ajuste el potencial de reposo a alrededor de menos 72 milivoltios.
Luego, inyecte una corriente escalonada para inducir el disparo continuo de potenciales de acción a cinco a 15 hercios. Durante la grabación, envíe pulsos individuales de LED a la neurona y controle los cambios de sus potenciales de acción. A continuación, añadir 0,5 milimolares de cloruro de bario al baño, para recuperar los potenciales de acción.
En el contexto de un corte agudo del cerebro, parchee una neurona con fluorescentes GFP de cereza M de la región neocortical. A continuación, registre la actividad de PIRK utilizando el método de rampa de voltaje. Específicamente, monitoree las corrientes internas específicas de Kir2.1 a menos 100 milivoltios.
A continuación, envíe pulsos individuales de LED a la neurona mientras graba y controle si las proteínas PIRK están activadas. Una vez que se activa PIRK, las corrientes internas a menos 100 milivoltios aumentarían significativamente. Al final, agregue 0,5 milimolares de cloruro de bario al baño y verifique si PIRK está inactivado.
Aquí se muestran imágenes ejemplares de cultivos neuronales sanos del hipocampo de rata. Y dos neuronas sanas que exhiben cuerpos celulares regordetes y dendritas y axones pronunciados. Estas son las imágenes de DIC y fluorescencia de neuronas de hipocampo de rata cultivadas in vitro, y transfectadas para la expresión de PIRK sin CMN.
En presencia de un milimolar de CMN, las neuronas transfectadas son capaces de expresar proteínas PIRK M-citrina de longitud completa, mostrando así fluorescencia verde. Y aquí hay un ejemplo de un solo pulso de luz, suprimiendo la actividad de una neurona del hipocampo expresada por PIRK. Estas imágenes de fluorescencia de neuronas corticales embrionarias de ratón muestran la incorporación exitosa de CMN en las proteínas GFP y Kir2.1 in vivo.
En este gráfico, la activación dependiente de la luz de PIRK se indica en las corrientes registradas de las neuronas neocorticales del ratón. Las implicaciones de esta técnica se extienden a la terapia de enfermedades cerebrales causadas por el mal funcionamiento de proteínas neuronales específicas, por ejemplo, Kir2.1 mutado en el síndrome de Andersens, porque esta técnica ayuda a descubrir qué circuitos cerebrales se ven afectados por los déficits de Kir2.1. Una vez dominada, esta técnica se puede utilizar para controlar la función de las proteínas neuronales con luz en alta especificidad en neuronas vivas.
Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo incorporar aminoácidos no naturales en las proteínas de las neuronas para lograr el fotocontrol sobre las proteínas neuronales de interés.
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Descripción general
Este artículo presenta un método para controlar ópticamente la función de una proteína neuronal mediante un aminoácido genéticamente codificado y no natural. Esta técnica permite a los investigadores estudiar el papel de proteínas neuronales específicas en la señalización y la función cerebral con alta resolución espacial y temporal.
Componentes Clave del Estudio
Área de la Ciencia
- Neurociencia
- Biología celular
- Optogenética
Antecedentes
- Comprender la señalización neuronal es fundamental para obtener conocimientos sobre la función cerebral.
- El control óptico de proteínas puede mejorar la precisión experimental.
- Los aminoácidos no naturales codificados genéticamente ofrecen nuevas vías para la investigación.
- Este método puede aplicarse a diversas proteínas neuronales.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un procedimiento para la activación selectiva de proteínas neuronales.
- Explorar la contribución de proteínas específicas a la señalización neuronal.
- Lograr la regulación óptica de procesos neuronales.
Métodos Utilizados
- Placar neuronas del hipocampo sobre cubreobjetos en una placa de 24 pocillos.
- Incubar cultivos neuronales en un ambiente controlado.
- Transfectar neuronas con una solución de cloruro de calcio.
- Utilizar aminoácidos no naturales codificados genéticamente para la activación de proteínas.
Resultados principales
- El método permite un control óptico preciso de las proteínas neuronales.
- Proporciona información sobre el papel de proteínas específicas en la señalización neuronal.
- La técnica es versátil y puede aplicarse a diversas proteínas.
- Mejora la comprensión de los procesos neuronales en la función cerebral.
Conclusiones
- Este procedimiento es una herramienta valiosa para la investigación en neurociencia.
- Abre nuevas posibilidades para estudiar las funciones de las proteínas en las neuronas.
- Las aplicaciones futuras podrían conducir a avances en la comprensión de la señalización cerebral.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La incorporación de aminoácidos no naturales (Uaa) codificados genéticamente permite un control óptico preciso de la función de proteínas neuronales, proporcionando una alta resolución espacial y temporal para desentrañar los roles de las proteínas en la señalización neuronal. Este enfoque apoya la desactivación de riesgos mecanicistas y la validación de dianas en las fases iniciales del descubrimiento, especialmente para canales iónicos y dianas neuronales implicadas en trastornos cerebrales. La versatilidad del método lo posiciona como una plataforma reutilizable para la interrogación funcional en diversas clases de proteínas dentro de carteras de I+D en neurociencia.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la interrogación directa de la función de proteínas neuronales en entornos celulares nativos.
- Apoya la reducción de riesgos mecanicistas al aislar la contribución de proteínas específicas en la señalización neuronal.
- Facilita la validación funcional de dianas con precisión óptica y reversibilidad.
- Proporciona una plataforma para evaluar variantes de proteínas relevantes para enfermedades in situ.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Prepara sistemas neuronales validados para ensayos posteriores de cribado de moduladores o variantes genéticas.
- Proporciona lecturas electrofisiológicas cuantitativas y reproducibles tras la activación luminosa.
- Permite la estandarización de ensayos mediante el control de la actividad proteica con estímulos ópticos definidos.
- Facilita la adaptación escalable a otras proteínas neuronales utilizando aminoácidos fotoactivos disponibles.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Se alinea con sistemas relevantes para la enfermedad al permitir el control óptico in vivo en el neocórtex embrionario de ratón.
- Facilita el desarrollo de biomarcadores traslacionales al vincular la activación de proteínas con salidas neuronales funcionales.
- Apoya el avance ajustado al riesgo al aclarar el impacto de la disfunción proteica en la conectividad cerebral.
- Proporciona confianza predictiva para modelos preclínicos dirigidos a proteínas neuronales.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
Este método integra desde el descubrimiento inicial hasta la validación preclínica, permitiendo la comprobación de hipótesis, la reducción de riesgos del blanco terapéutico y lecturas funcionales en sistemas neuronales tanto in vitro como in vivo.
- Biología del Descubrimiento: Apoya pruebas basadas en hipótesis de la función proteica y la participación en vías de señalización neuronal.
- Selección: Proporciona resultados electrofisiológicos cuantitativos y reproducibles para la selección de compuestos o genética.
- Análisis: Permite la medición directa de potenciales de acción y corrientes iónicas en respuesta a la activación óptica.
- Investigación Traductiva: Conecta estudios in vitro e in vivo para lograr continuidad en modelos relevantes para enfermedades.
- Reutilización Empresarial: Ofrece una plataforma modular adaptable a múltiples proteínas neuronales y preguntas de investigación.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en la validación de objetivos neuronales.
- Valor operativo: Estandariza los protocolos de control óptico para garantizar la reproducibilidad y escalabilidad entre proyectos.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al proporcionar evidencia funcional del compromiso del objetivo y la relevancia de la vía.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de objetivos neuronales y apoya la transferencia de conocimientos entre programas.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en cultivo neuronal, manipulación genética y electrofisiología.
- Necesita acceso a equipos de estimulación óptica e infraestructura para grabación mediante parche adherido (patch-clamp).
- Exige la estandarización entre equipos de los protocolos de incorporación de aminoácidos no canónicos (Uaa) y de administración de luz.
- Adaptable a diversas proteínas neuronales y sistemas modelo cuando se dispone de Uaas fotoactivos.
- Depende del control preciso de las condiciones experimentales para obtener resultados reproducibles.
