Name: Control óptico de una proteína neuronal utilizando un ácido Unnatural Amino genéticamente codificados en las neuronas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 20 s
Description: Aprende a controlar ópticamente proteínas neuronales utilizando aminoácidos no naturales codificados genéticamente en neuronas de hipocampo. Este método permite estudiar la función de proteínas específicas en la señalización neuronal con alta resolución espacial y temporal.

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Agradecemos al Dr. S. Szobota por su útil discusión sobre el cultivo de neuronas y la transfección de Ca-P. L.W. agradece el apoyo de The Salk Innovation Grant, el Instituto de Medicina Regenerativa de California (RN1-00577-1) y los Institutos Nacionales de Salud (1DP2OD004744).

Todos los procedimientos descritos en el presente estudio se realizaron utilizando Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión (IACUC) aprobaron protocolos para el manejo de animales en el Instituto Salk para Estudios Biológicos en La Jolla, CA. 1. Incorporación Uaa en Kir2.1 y Expresión de la resultante en el PIRK cultivos neuronales primarios <ol><li> La construcción de ADN <ol><li> Seleccionar un sitio diana de Kir2.1 para Uaa incorporación. Explotar el conocimiento previo y la información acerca de la estructura y la función de Kir2.1, de modo que el sitio elegido con el photoresponsive Uaa Incorporated permite de modulación óptica de la función Kir2.1 21. </li><li> Construir un gen Kir2.1 ADN recombinante que codifica el sitio elegido mutado para el TAG codón de parada ámbar. Utilizar las técnicas de clonación estándar 25 para clonar el ADN Kir2.1-TAG en un plásmido de expresión de mamífero. </li><li> Clone tRNA genes / sintetasa que son específicos para la UAA y incorporan la SAU en respuesta ael codón de parada TAG en otro plásmido de expresión de mamíferos 21. Nota: Para una óptima incorporación UAA, diferentes promotores y combinaciones de los casetes de genes (por tRNA sintetasa, y Kir2.1) pueden ser probados en diferentes plásmidos. </li><li> Obtener los ADN de plásmido de alta calidad usando miniprep o maxiprep kits comerciales de acuerdo con el protocolo del fabricante. Alrededor de 1,9 de la relación 260/280 es óptimo para el ADN purificado. Cuando sea necesario, realizar una electroforesis en gel de agarosa para comprobar la pureza del ADN preparado 25. ADN de plásmido superenrollado con alta pureza son los mejores para la transfección neuronal. </li></ol></li><li> Cultura rata neuronas del hipocampo primaria <ol><li> cubreobjetos lugar de vidrio (círculos, de 12 mm de diámetro) en placas de 24 pocillos, uno cubreobjetos en cada pocillo, y la capa de cada pocillo con 250 l de 0,5 mg / ml de poli-D-lisina (en 100 mM de tampón de borato: 1,24 g bórico ácido y 1,90 g de tetraborato de sodio en 400 ml de desionizada H2O destilada o ddH 2 </sub&gt; O a pH 8,5) durante más de 10 horas a temperatura ambiente, se selló. Preparar unas 10-12 cubreobjetos recubiertos por las crías. </li><li> En el día de la disección, recoger los cerebros de ratas neonatales de las crías después del parto (día postnatal 1-4) después de anestesiar con isoflurano y decapitar. Anestesiar a los cachorros en una cámara que contiene anestesia con isoflurano (2-4%). Espere hasta que pierden la consciencia y no responden a los estímulos táctiles y pellizcos de las patas. </li><li> Utilizando la técnica estándar 26, diseccionar hipocampo del cerebro en caliente (~ 37 ° C) solución salina (HEPES 10 mM y 20 mM D-glucosa añadida en solución salina equilibrada de Hank), y recoger hipocampos en un tubo cónico con 4,5 ml de solución salina caliente . </li><li> Añadir 500 l de 2,5% de tripsina a los hipocampos (0,25% de concentración final de tripsina), y se incuba durante 10 min en un baño de agua a 37 ° C. </li><li> Enjuague el tejido con solución salina (3 x 10 ml) y se tritura. </li><li> Recuperar las neuronas disociadas en 1 ml wmedios de cultivo que contienen brazo medio esencial mínimo (MEM) suplementado con 5% de suero bovino fetal (FBS), 21,2 mM de D-glucosa, 2 mM L-glutamina, 2% de B-27, y el extensor de suero 0,1%. Nota: Añadir L-glutamina y B-27 en el día de la disección para preparar un medio de crecimiento fresco. </li><li> Cuenta las neuronas con un hemocitómetro, y la placa ellos en cubreobjetos en placas de 24 pocillos a 1,0 a 1,5 x 10 5 células / pocillo densidad con medio de crecimiento 500 l después de filtró a través de una malla de nylon 40 micras. </li><li> Incubar el cultivo neuronal a 35 ° C en un 5% de CO 2: 95% de aire humidificado incubadora durante 2-3 semanas. Para un mejor resultado, no molestar a la cultura tanto como sea posible durante la incubación. </li></ol></li><li> El fosfato de calcio (Ca-P) La transfección de cultivos neuronales primarias <ol><li> Hacer las soluciones madre y se almacena a 4 ° C: 0,5 M BES (N, N -bis [2-hidroxi-etil] -2-aminoetanosulfónico ácido) tampón (10x); 150 mM Na 2 HPO 4 (100x); 2,8 M NaCl (10x); ddH estéril 2 O; NaOH estéril 1N. </li><li> En el día de la transfección, hacer solución fresca 2,5 M CaCl 2 en ddH 2 O y el filtro estéril con 0,22 micras filtro. Hacer memoria intermedia amortiguadora de BES fresca 2x Saline (BBS) que contiene BES 50 mM, 1,5 mM Na 2 HPO 4, y NaCl 280 mM a pH 7,00 (ajustar el pH con NaOH) y el filtro estéril con 0,22 micras filtro. Nota: Se calcula la cantidad de solución de CaCl 2 y tampón de BBS en función del número de cubreobjetos a transfectar. También mire 1.3.4. </li><li> Vuelva a colocar el medio de crecimiento de cultivo con 500 medios de cultivo de transfección l fresca precalentada. (El medio de transfección se pueden hacer con MEM más 21,2 mM D-glucosa). Nota: No se deshaga de los viejos medios. </li><li> Calcular la cantidad de ddH 2 O y se preparan para añadir con el fin de hacer que la solución de transfección (33 l por cada cubreobjetos) que contiene 1,65 l CaCl 2, 0,7 g de ADN, y 16.5 y# 181; l 2x BBS. </li><li> Preparar la solución de transfección inmediatamente antes de añadir a la cultura. Para preparar, combinar la primera CaCl2 y ddH2O mientras se agita lentamente el tubo. Continuar agitando y se añade lentamente el ADN en la solución. Por último, añadir tampón 2x ​​BBS gota a gota mientras se agita. </li><li> Inmediatamente añadir 30 l de la solución de transfección a cada cubreobjetos de cultivo neuronal. </li><li> Roca la placa de cultivo de un par de veces para mezclar la solución y se incuba a 35 ° C en un 5% de CO 2: 95% de aire humidificado incubadora de 45 min-1 hr. Después de las neuronas se incuban con la solución de transfección, muy finos precipitados Ca-P formarían una capa que cubre las neuronas. </li><li> Sustituir el medio de transfección con 500 l pre-calentado tampón de lavado (NaCl mM 135, HEPES 20 mM, KCl 4 mM, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 1 mM Na 2 HPO 4, glucosa 10 mM a pH 7,3, estéril filtrado con 0,22 micras filtro) y se incuba a 356; C en un 5% de CO 2: 95% incubadora humidificada de aire durante 15-20 min. precipitados de Ca-P desaparecerían después de la etapa de lavado. </li><li> Reemplazar el tampón de lavado con 500 l medio de cultivo fresco. Una vez más, sustituir el medio de cultivo con el medio original guardado. </li><li> Añadir la SAU CMN (pre-mezclado en 50 l de medios de crecimiento en caliente) al cultivo hasta llegar a concentración final 1 mM. </li><li> Incubar el cultivo transfectadas a 35 ° C en un 5% de CO 2: 95% incubadora humidificada de aire para 12 a 48 h antes de los ensayos. </li></ol></li><li> La grabación de la célula entera con Luz de la activación <ol><li> Preparar soluciones supletorias / intracelulares. La solución intracelular contiene 135 mM de gluconato de potasio, NaCl 10 mM, 2 mM MgCl 2 mM, HEPES 10 mM, EGTA 1, 2.56 mM K 2 ATP, y 0,3 mM Li 2 GTP a pH 7,4. La solución de registro extracelular contiene NaCl 150 mM, KCl 3 mM, 5 mM MgCl2, 0,5 mM CaCl 2, glucosa 5 mM, y HEPES 10 mM a pH 7,4. </li><li&gt; Configuración de la plataforma de electrofisiología patch clamp de célula completa: microscopio equipado con 4X y 20X objetivos, contraste de interferencia diferencial (DIC), y el filtro mCitrine (excitación: 495/10 nm, emisión: 525/25 nm); manipulador; amplificador de patch-clamp; digitalizador; adquisición de datos y software de análisis. <ol><li> Instalar un diodo emisor de luz (LED) con emisión de 385 nm por el microscopio en la plataforma para entregar la luz al punto focal de 1 cm de distancia en un ángulo de 45 °. Compruebe la alimentación del LED con un medidor de potencia de luz. </li></ol></li><li> Tire de pipetas de parches de electrodos de vidrio utilizando un extractor de micropipeta comercial para tener 3-6 mO resistencia pipeta. Siga las instrucciones del fabricante para configurar el extractor de micropipeta. <ol><li> Para poner a prueba la resistencia de la pipeta, primero llenar la pipeta con la solución intracelular y colocarlo en el soporte del electrodo. Sumergir la pipeta en una placa de cultivo de 35 mm llena con la solución extracelular, colocado en el microscopio platform. Sumergir un electrodo de tierra en el plato para completar un circuito. </li><li> Encienda el amplificador / digitalizador y comenzar un programa de adquisición de datos. Vigilar la resistencia de la pipeta con un protocolo de ensayo de membrana. </li></ol></li><li> Sacar un cubreobjetos de la cultura de la neurona de la incubadora y se lava una vez en la solución extracelular. El uso de grasa de vacío, mantenga pulsado el cubreobjetos en medio de una placa de cultivo de 35 mm llena con la solución extracelular fresco. </li><li> Coloque el cubreobjetos / plato en la plataforma del microscopio electrofisiología. </li><li> Utilizando las técnicas de parches de sujeción estándar, parchear una neurona con fluorescencia mCitrine 27. la actividad neuronal, grabe en la pinza de corriente Método (I-clamp). En primer lugar, ajustar el potencial de reposo de alrededor de -72 mV mediante la inyección de una pequeña corriente. A continuación, se inyecta una corriente de paso (10-200 pA) para inducir el funcionamiento continuo (5-15 Hz) de los potenciales de acción. </li><li> Manualmente o utilizando el software de adquisición de datos, el flash de un pulso (un pecadoGLE pulso de 100 ms -1 segundos de duración) de la luz LED de la neurona durante la grabación, y ver si se ven afectados los potenciales de acción. </li><li> Añadir 0,5 mM BaCl2 al baño y verificar si se recuperan los potenciales de acción. </li></ol></li></ol> 2. Incorporación Uaa en Kir2.1 y Expresión de la resultante PIRK en el cerebro de embriones de ratón in vivo <ol><li> La construcción de ADN <ol><li> Diseñar el ADN de plásmido de manera similar como en el paso 1.1. Para la expresión in vivo, utilizar un promotor fuerte como CAG (promotor de la beta-actina de pollo con potenciador de CMV). </li><li> Se purifica el ADN con un kit comercial maxiprep libre de endotoxinas de acuerdo con el protocolo del fabricante. Realizar la extracción con fenol-cloroformo, seguido de precipitación con etanol 25 para adquirir el ADN de calidad extremadamente alta (condensado de 2-5 mg / l). </li></ol></li><li> La electroporación en el útero a la embrionarias de ratón Neocórtex Nota: El techni básicaQue en el útero de la electroporación se ha descrito previamente 28. <ol><li> Anestesiar un ratón embarazada transitoria en el día embrionario 14,5 (E14.5) con pentobarbital sódico (inyección intraperitoneal, 50 g por gramo de peso corporal) o isoflurano (inhalación, 2-4%). Monitorear la profundidad anestésica mediante la comprobación de la pérdida de la conciencia y no hay respuesta a los estímulos táctiles y pellizcos de las patas. </li><li> Hacer una pequeña incisión en la línea media abdominal. exponer suavemente los cuernos uterinos con fórceps y alcance. </li><li> Inyectar aproximadamente 1 l solución de ADN (2-5 mg / l de cada plásmido, dependiendo del constructo) en el ventrículo lateral de cada camada con una pipeta de vidrio insertado a través de la pared uterina. En la mayoría de los casos, se inyecta alrededor del 60-80% de los embriones totales. </li><li> Electroporate los embriones con un electroporador (33-35 V, 50 ms de duración, intervalo de 950 ms, 4-8 pulsos). </li><li> Volver los cuernos uterinos de la cavidad abdominal para suavemente conceps y alcance. Suturar la pared muscular y la piel con sutura quirúrgica para permitir que los embriones para continuar el desarrollo. </li></ol></li><li> UAA microinyección <ol><li> Hacer una pequeña incisión en la línea media del abdomen de nuevo en E16.5, y exponer suavemente los cuernos uterinos con fórceps y alcance. </li><li> Inyectar aproximadamente 2-5 l CMN-Ala (500 mM) a un lado a electroporación o ambos lados del ventrículo lateral con una pipeta de vidrio insertado a través de la pared uterina. Para aumentar la biodisponibilidad Cmn, utilice el dipéptido CMN-Ala (CMN-alanina) para entregar Cmn in vivo 21. </li><li> Una vez más, devolver los cuernos uterinos de la cavidad abdominal con cuidado con fórceps y alcance. Suturar la pared muscular y la piel con sutura quirúrgica para permitir que los embriones para continuar el desarrollo. </li></ol></li><li> Obtener aguda del cerebro rebanadas <ol><li> Hacer 1 L de líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF) que contiene NaCl 119 mM, KCl 2,5 mM, 1,3 mM MgCl 2, CaCl 2,5 mM <sub&gt; 2, 1 mM de glucosa NaH 2 PO 4, 26,2 mM NaHCO3, y 11 mM a pH 7,3. </li><li> Tomar 200 ml ACSF y rápido de congelación a -80 ° C durante 20-30 minutos. Burbuja el resto de ACSF con 5% de CO 2: 95% de O 2 gas a temperatura ambiente. </li><li> Preparar y esterilizar instrumentos quirúrgicos para cosechar los cerebros de los embriones. También hay que preparar un cubo de hielo. </li><li> Hacer solución ~ 100 ml 4% de bajo punto de fusión de agarosa en un matraz por calentamiento en un horno de microondas. Enfriar solución durante aproximadamente 5 min antes de que comience a solidificarse. </li><li> La eutanasia del ratón horas después de la inyección 12-24 CMN-Ala de CO 2 sobredosis. Hacer grandes incisiones en el área abdominal, y diseccionar los embriones a electroporación / microinyección del útero con unas tijeras finas y pinzas. </li><li> Cosecha cerebros de los embriones con unas tijeras finas y pinzas. </li><li> Coloque cada cerebro en una placa de cultivo de 10 cm colocado en el cubo de hielo. Dividir dos hemisferios utilizando una cuchilla afilada, y coloca cada unohemisferio en el plato con el plano sagital medio tocando el fondo del plato. verter rápidamente en la solución de agarosa sobre el cerebro (alrededor de 500 l por hemisferio). </li><li> Usando una cuchilla afilada, corte cuadrado de la agarosa alrededor de un cerebro para hacer un bloque de agarosa al cerebro embebido. </li><li> El uso de adhesivo tisular, pegamento abajo de la superficie plano sagital medio del bloque de agarosa en un montaje de vibratome. Llenar la cámara vibratome con ACSF enfriado previamente cortado y 200 micras rodajas de cerebro sagital. </li><li> Incubar las rebanadas agudas en ACSF suplementado con -inositol 3 mM myo, ácido ascórbico 0,4 mM, y piruvato de sodio 2 mM a 33 ° C durante 42 min mientras se burbujeaba con 5% de CO 2: 95% de O 2 gas. </li><li> Después de 42 minutos, apague el calentador y continuar incubar las rodajas a temperatura ambiente con burbujeo. Iniciar la grabación de parches de células enteras al menos 15 minutos después de apagar el calentador. </li></ol></li><li> La grabación de la célula entera con Luz de la activación <ol><li> Preparar el intracsolución ellular que contiene 130 mM de gluconato de potasio, 4 mM MgCl 2 mM, HEPES 5, EGTA 1,1 mM, 3,4 mM Na 2 ATP, 10 mM fosfato de creatina de sodio, y 0,1 mM Na 3 GTP a pH 7,3 ajustado con KOH. </li><li> Tire de pipetas de parches de electrodos de vidrio utilizando un extractor de micropipeta comercial para tener 3-6 mO resistencia pipeta. </li><li> Configurar la plataforma de electrofisiología para la rebanada de células enteras patch clamp y superfuse la cámara de grabación con ACSF a 2 ml / min con una velocidad de bomba de perfusión. Ajuste la temperatura de la cámara de alrededor de 33 ° C. Nota: El equipo de perforación rebanada electrofisiología está equipado con una cámara de perfusión, un objetivo de inmersión en agua y un controlador de temperatura. Además, el filtro de GFP se requieren (675/130 nm de excitación:: 580/20 nm de emisión) (excitación:: 480/30 nm, emisión 535/40 nm) y el filtro mCherry. <ol><li> Instalar un LED con la emisión de 385 nm por el microscopio en la plataforma para entregar la luz al punto focal de 1 cm de distancia en unos 45 °ángulo. Compruebe la alimentación del LED con un medidor de potencia de luz. </li></ol></li><li> Recoja cuidadosamente un corte de cerebro con una pipeta de vidrio y colocar en la cámara de perfusión. Mantenga pulsada la tecla en el sector con un arpa. </li><li> Parchear una neurona con fluorescencia mCherry / GFP de la región neocortical 27. actividad PIRK registro usando método de fijación de voltaje (V-clamp). En primer lugar, mantener el potencial de membrana a -60 mV. Entonces, registrar las corrientes a potenciales fijos negativos de membrana (-100 mV) o rampas de tensión (-100 mV a 40 mV). Específicamente, dar seguimiento Kir2.1 corrientes de entrada específicos a -100 mV. </li><li> Manualmente o utilizando el software de adquisición de datos, el flash de un pulso (un pulso de 100 ms -1 segundos de duración) de la luz LED de la neurona durante la grabación, y ver si se activan las proteínas Pirk. Una vez que se activa PIRK, corrientes hacia el interior a -100 mV aumentarían significativamente. </li><li> Añadir 0,5 mM BaCl2 al baño y verificar si PIRK se inactiva de nuevo. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Para lograr foto-modulación efectiva, el paso inicial importante es decidir dónde incorporar el photoresponsive SAU en la proteína diana. La información estructural y funcional de la proteína diana es muy útil para guiar la selección de los sitios candidatos. Al mismo tiempo, el propósito de la regulación de la luz sería determinar qué sitio es el más adecuado. Después de elegir los sitios candidatos, se recomienda probar los sitios en líneas celulares de mamíferos tales como el riñón embrionario humano (HEK) para el cu...

En comparación con la estimulación eléctrica convencional, fotoestimulación ofrece una mayor resolución temporal y espacial con una interferencia mínima para el sistema fisiológico de las muestras. Desde la demostración del uso de rayos láser para estimular las neuronas en 1971 1, de muchas maneras creativas se han inventado para controlar la actividad neuronal de forma exógena con la luz. Liberación óptico de agonistas photocaged ha sido utilizado para estudiar la respuesta fisiológica de la red neuronal a ligandos 2,3,4. Esta técnica ha limitado especificidad debido a la difusión de los agonistas enjaulados. Especificidad genética se consigue mediante ectópica expresan canales opsina sensibles a la luz y bombas 5,6,7, y se ha aplicado con éxito para modular las redes neuronales seleccionadas en diversos organismos modelo. Sin embargo, sería difícil de aplicar este método para controlar ópticamente varias otras proteínas neuronales, ya que el injerto photoresponsiveness de las proteínas opsina a otras proteínas would requerir la ingeniería intenso que puede alterar las características naturales de la proteína en estudio. Químicamente la inmovilización de un ligando exógeno fotosensible a una proteína ha demostrado otra manera de controlar la funcionalidad de proteínas de los canales 8.9.10. El ligando se presenta o se retira del sitio de unión de la proteína a través de la fotoisomerización de la fracción de azobenceno. Tethering química limita la aplicación principalmente en el lado extracelular de proteínas de membrana, con exclusión de la parte intracelular y proteínas intracelulares. Photoresponsive Uaas, después de haber sido incorporado en proteínas, proporcionan una estrategia general para manipular las proteínas con la luz. En los primeros esfuerzos, ARNt acilado químicamente con Uaas photocaged con microinyecciones en oocitos de Xenopus para incorporar los Uaas en los receptores de membrana y los canales de iones 11, que han contribuido a la comprensión de sus relaciones estructura-función 12,13,14.Este enfoque de microinyección se limita principalmente a grandes ovocitos. Incorporación genética de una Uaa no pasa por el desafío técnico tRNA acilación y microinyección mediante el uso de un par de ARNt / sintetasa ortogonal, que incorpora la SAU a través de la traducción de proteínas endógenas en células vivas 15,16,17,18. Uaa incorporación en proteínas neuronales se ha demostrado en las neuronas primarias y células madre neurales 19,20. Más recientemente, photoresponsive Uaa se ha incorporado genéticamente en una proteína neuronal en el cerebro de mamíferos in vivo, por primera vez 21. Estos avances hacen que sea posible estudiar proteínas neuronales con Uaas en su ambiente celular nativo. Interiormente rectificación del canal de potasio Kir2.1 es un rectificador fuerte que pasa K + corrientes más fácilmente en que fuera de la célula, y es esencial en la regulación de procesos fisiológicos incluyendo la excitabilidad celular, el tono vascular, la frecuencia cardíaca, resal flujo final y la liberación de insulina 22. La sobreexpresión de Kir2.1 hiperpolariza el potencial de membrana de la neurona objetivo, que se hace menos excitable 23,24. Para controlar ópticamente Kir2.1 en sus células nativas, Kang et al. Incorpora genéticamente un Uaa foto-sensible en Kir2.1 expresa en células de mamíferos, las neuronas y los cerebros de embriones de ratón 21. Un breve pulso de luz era capaz de convertir la SAU en un aminoácido natural Cys, activando de este modo la proteína Kir2.1 objetivo. Cuando esto dentro rectificación de potasio (PIRK) proteína del canal de foto-inducible se expresa en neuronas de rata primarias del hipocampo, que suprime la activación neuronal en respuesta a la activación de la luz. Además, el canal PIRK se expresó en la corteza cerebral de embriones de ratón, y se midió la corriente PIRK activado por la luz en las neuronas corticales. La aplicación con éxito de la tecnología SAU en vivo en el cerebro de los mamíferos se abre la puerta para controlar ópticamente proteínas neuronalesen su ambiente nativo, lo que permitirá la disección óptica de procesos y mecanismos neuronales a nivel molecular. En este protocolo se describen procedimientos para la incorporación de genética Uaas en neuronas primarias en la cultura y en el cerebro de embriones de ratón in vivo. El photoresponsive Uaa Cmn y Kir2.1 se utilizan para ilustrar el proceso. Métodos para evaluar el éxito incorporación UAA y control óptico de la actividad de la proteína neuronal se proporcionan. Este protocolo proporciona una guía clara para que codifica genéticamente Uaas en las neuronas y en vivo, y a la regulación de la función de proteínas ópticamente neuronal a través de un Uaa fotosensible. Esperamos que este protocolo para facilitar la adopción de la tecnología in vivo Uaa de la neurociencia y estudios biológicos optogenética.

<table><tbody><tr><td>Cuberteros, Círculos, 12 mm, Grosor 0,13-0,17 mm</td><td>Carolina Biologicals</td><td>633029</td><td></td></tr><tr><td>Corning BioCoat Poly-D-Lysine</td><td>Corning Discovery Labware</td><td>354210</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Solución de glucosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8769</td><td></td></tr><tr>Iris Herramienta de <td>ciencia fina</td><td>curvada con espátula</td><td>10092-12</td><td></td></tr><tr><td>Cuchillo de disección - punta en ángulo</td> <td>finoFine Science Tool</td><td>10056-12</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX-I Suplemento</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>MITO+ Diluyente de suero</td><td>BD Biosciences</td><td>355006</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 40 &micro; m Filtro de células</td><td>Corning Life Sciences</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>BES (N,N-Bis(2-hidroxietil)-2-aminoetanosulfónico acido, N,N-Bis(2-hidroxietil)taurina)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6420</td><td></td></tr><tr><td>FUENTE DE LUZ LED &ndash; LED negro 385</td><td>Prizmatix Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarosa, bajo punto de fusión, grado analítico</td><td>Promega</td><td>V2111</td><td></td></tr></tbody></table>

control óptico de una proteína neuronal utilizando un ácido unnatural amino genéticamente codificados en las neuronas

Optical Control of a Neuronal Protein Using a Genetically Encoded Unnatural Amino Acid in Neurons

La fotoestimulación es una forma no invasiva de controlar eventos biológicos con una excelente resolución espacial y temporal. Se desean nuevos métodos para fotorregular las proteínas endógenas expresadas en su entorno nativo. Aquí, presentamos un enfoque para controlar ópticamente la función de una proteína neuronal directamente en las neuronas utilizando un aminoácido no natural (Uaa) codificado genéticamente. Mediante el uso de un par ortogonal de ARNt/aminoacil-ARNt sintetasa para suprimir el codón ámbar, un Uaa 4,5-dimetoxi-2-nitrobencil-cisteína (Cmn) fotorreactivo se incorpora de forma específica en el poro de una proteína neuronal Kir2.1, un canal de potasio rectificador hacia adentro. El voluminoso Cmn bloquea físicamente el poro del canal, lo que hace que Kir2.1 no dure. La iluminación de la luz convierte instantáneamente el Cmn en un aminoácido natural más pequeño, Cys, activando la función del canal Kir2.1. Expresamos estos canales de potasio rectificante(PIRK) p hoto-inducables enlas neuronas primarias del hipocampo de rata, y demostramos que la activación por luz de PIRK cesa la activación neuronal debido a la salida de corriente K+ a través de los canales Kir2.1 activados. Utilizando electroporación en el útero, también expresamos PIRK en el neocórtex embrionario de ratón in vivo, mostrando la activación por luz de PIRK en las neuronas neocorticales. La codificación genética de Uaa no impone restricciones sobre el tipo de proteína objetivo o la ubicación celular, y existe una familia de Uaas fotorreactivos para modular diferentes residuos de aminoácidos naturales. Por lo tanto, esta técnica tiene el potencial de aplicarse generalmente a muchas proteínas neuronales para lograr la regulación óptica de diferentes procesos en el cerebro. El protocolo actual presenta un procedimiento accesible para la incorporación intrincada de Uaa en neuronas in vitro e in vivo para lograr el fotocontrol de la actividad de las proteínas neuronales a nivel molecular.

Para genéticamente incorporar un Uaa en una proteína en las neuronas, el primer paso importante es diseñar gen apropiado construye para entregar y expresar genes de manera eficiente en las neuronas. Hay tres componentes genéticos para Uaa incorporación: (1) el gen diana con el codón de parada TAG ámbar introducido en el sitio elegido para Uaa incorporación (2) un ARNt ortogonal a reconocer la mutado codón de parada TAG, y (3) una aminoacil ortogonal -tRNA sintetasa para cargar la SAU en ...

Aquí, se presenta un procedimiento para activar selectivamente una proteína neuronal con un pulso corto de luz mediante la codificación genética de un aminoácido no natural foto-reactivo en una proteína neuronal diana expresada en neuronas en cultivo o in vivo.

Control óptico de una proteína neuronal utilizando un ácido Unnatural Amino genéticamente codificados en las neuronas

Photostimulation is a noninvasive way to control biological events with excellent spatial and temporal resolution. New methods are desired to ...

El objetivo general de este procedimiento es controlar ópticamente la función de una proteína neuronal mediante un aminoácido no natural codificado genéticamente en neuronas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre la contribución de una proteína neuronal específica a la señalización neuronal en la función cerebral con resolución espacial y temporal. La principal ventaja de esta técnica es que tiene el potencial de aplicarse a diversas proteínas neuronales para lograr la regulación óptica de varios procesos neuronales.Inicie este procedimiento sembrando neuronas hipocampales sobre cubreobjetos en una placa de 24 pocillos con 500 microlitros de medio de crecimiento, después de filtrar a través de una malla de nailon de 40 micrómetros. A continuación, incube el cultivo neuronal a 35 grados Celsius en un incubador humedecido con 5 por ciento de dióxido de carbono y 95 por ciento de aire durante 2 a 3 semanas. El día de la transfección, prepare una solución fresca de cloruro de calcio 2,5 molar en agua doblemente destilada y filtre estérilmente con un filtro de 0,22 micrómetros.A continuación, prepare BBS 2X fresco a pH 7 y filtre estérilmente mediante un filtro de 0,22 micrómetros. Después, sustituya el medio de crecimiento del cultivo por 500 microlitros de medio de transfección fresco y previamente calentado, y no deseche el medio de crecimiento antiguo. Prepare la solución de transfección inmediatamente antes de añadirla al cultivo combinando cloruro de calcio y agua doblemente destilada, agitando lentamente el tubo.Continúe agitando el tubo y agregue lentamente el ADN a la solución. A continuación, agregue el tampón BBS 2X gota a gota. La preparación del tampón BBS 2X es un paso crítico en la transfección con fosfato de calcio, y es recomendable calibrar el pH óptimo del tampón BBS 2X entre 6,90 y 7,15 para nuevos constructos de ADN o preparaciones.Luego, agregue inmediatamente 30 microlitros de la solución de transfección a cada cubreobjetos de la cultura neuronal. Mueva suavemente el recipiente de cultivo varias veces para mezclar la solución e incúbela a 35 grados Celsius durante 45 minutos a una hora. Después de aproximadamente una hora, debería observarse una capa fina de precipitados de fosfato de calcio cubriendo las neuronas.A continuación, sustituya el medio de transfección por 500 microlitros de tampón de lavado precalentado e incube a 35 grados Celsius durante 15 a 20 minutos. Los precipitados de fosfato de calcio deberían desaparecer después del lavado. Ahora, sustituya el tampón de lavado por 500 microlitros de medio de crecimiento fresco.Posteriormente, sustituya el medio de crecimiento por el medio original guardado. Luego, agregue el aminoácido no natural Cmn previamente mezclado en 50 microlitros de medio de crecimiento tibio a la cultura, lo que resulta en una concentración final de un milimolar. Incube la cultura transfectada a 35 grados Celsius durante 12 a 48 horas antes de realizar el registro.En este procedimiento, prepare las soluciones extracelular e intracelular. En nuestro montaje, el LED con emisión de 385 nanómetros está instalado junto al microscopio para dirigir la luz a un centímetro de distancia del punto focal con un ángulo de 45 grados. Luego, prepare algunas pipetas de registro utilizando un micropipeteador y un electrodo de vidrio.Posteriormente, tome una laminilla con cultivos de neuronas del incubador y enjuáguela una vez con la solución extracelular. Llene abundantemente el sistema con solución extracelular. A continuación, coloque la laminilla sobre la plataforma del microscopio de electrofisiología, utilizando técnicas estándar de registro por parche.Realice un parche en una neurona transfectada con fluorescencia M-citrina. A continuación, registre la actividad neuronal utilizando el método de fijación de corriente. Primero, ajuste el potencial de reposo a aproximadamente menos 72 milivoltios.Luego, inyecte una corriente escalonada para inducir la generación continua de potenciales de acción a cinco o 15 hercios. Durante la grabación, aplique pulsos individuales de LED a la neurona y supervise los cambios en sus potenciales de acción. A continuación, añada cloruro de bario 0,5 milimolar al baño para recuperar los potenciales de acción.En el contexto de un corte cerebral agudo, realice un parche sobre una neurona con fluorescencia de M-cherry GFP procedente de la región neocortical. Luego, registre la actividad de PIRK utilizando el método de rampa de voltaje. Específicamente, monitoree las corrientes entrantes específicas de Kir2.1 a menos 100 milivoltios.Luego, aplique pulsos individuales de LED al neutrón mientras realiza la grabación y supervise si las proteínas PIRK se activan. Una vez que PIRK se active, las corrientes entrantes a menos 100 milivoltios aumentarían significativamente. Al final, agregue cloruro de bario 0,5 milimolar al baño y verifique si PIRK se inactiva.Se muestran aquí imágenes ejemplares de cultivos neuronales sanos del hipocampo de rata. Y dos neuronas sanas que exhiben cuerpos celulares voluminosos y dendritas y axones bien definidos. Estas son las imágenes de contraste de interferencia diferencial (DIC) y de fluorescencia de cultivos de neuronas del hipocampo de rata in vitro, transfectadas para la expresión de PIRK sin CMN.En presencia de un milimolar de CMN, las neuronas transfectadas son capaces de expresar proteínas completas de PIRK M-citrina, mostrando así fluorescencia verde. Y aquí se muestra un ejemplo de un único pulso de luz, suprimiendo la actividad de una neurona del hipocampo que expresa PIRK. Estas imágenes de fluorescencia de neuronas corticales embrionarias de ratón muestran la incorporación exitosa de CMN en las proteínas GFP y Kir2.1 in vivo.En este gráfico, la activación dependiente de la luz de PIRK se indica en las corrientes registradas de neuronas neocorticales de ratón. Las implicaciones de esta técnica se extienden a la terapia de enfermedades cerebrales causadas por el mal funcionamiento de proteínas neuronales específicas, por ejemplo, Kir2.1 mutada en el síndrome de Andersen, ya que esta técnica ayuda a descubrir qué circuitos cerebrales se ven afectados por déficits de Kir2.1. Una vez dominada, esta técnica puede utilizarse para controlar con luz la función de proteínas neuronales con alta especificidad en neuronas vivas.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo incorporar aminoácidos no naturales en proteínas en neuronas para lograr el control fotoinducido sobre proteínas neuronales de interés.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Escalable neumático matrices inyector para Viral focalización de los circuitos cerebrales intactas en 3-D

Adultos nacidos en las neuronas que expresan ChR2 puede ser manipulado en los preparativos rebanada electrofisiológicos para examinar su contribución a la función olfativa de los circuitos neuronales.

Utilizando asequible Estructuras de LED para fotos-estimulación de las neuronas

Tome un cultivo de Corynebacterium glutamicum, transformado con un plásmido que lleva un gen reportero fluorescente aguas abajo del antiterminador del ácido ribonucleico o secuencia RAT, en una placa de pocillos múltiples.Durante la transcripción, el RAT-ARN forma una estructura de bucle de tallo que bloquea la ARN polimerasa, deteniendo la expresión génica reportera.El plásmido también expresa constitutivamente LicV, una proteína de fusión que comprende la proteína de unión al ARN RAT, LicT, y...

Control Optogenético de la Expresión Génica en Corynebacterium glutamicum

El reciente desarrollo de herramientas de la neurociencia, que combinan la genética y la óptica, denominada "optogenética", permite el control sobre la actividad de circuitos neuronales con un nivel sin precedentes de la resolución espacial y temporal. Aquí les ofrecemos un protocolo para la integración en la grabación vivo con la manipulación optogenética de subconjuntos definidos genéticamente las neuronas piramidales corticales y subicular prefrontales.

Un método para la alta fidelidad Optogenética control de un individuo neuronas piramidales<em&gt; En vivo</em

Este artículo describe una mejora de la Fluorometría de Voltaje-Clavija convencional (VCF) donde se usan Fluorescentes Aminoácidos No Naturales (fUAA) en lugar de tintes de maleimida, para sondar reordenamientos estructurales en canales iónicos. El procedimiento incluye inyección de ADN de ovocitos de Xenopus , coinjección de ARN / fUAA y mediciones de corriente y fluorescencia simultáneas.

Pinza de tensión Fluorometría en<em&gt; Xenopus</em&gt; Oocitos Usando Fluorescentes Aminoácidos No Naturales

Este protocolo describe una estrategia optogenética para modular la actividad de la proteína quinasa activada por mitógeno (MAPK) durante la diferenciación celular y el desarrollo embrionario de Xenopus . Este método permite la activación reversible de la vía de señalización MAPK en el cultivo de células de mamíferos y en organismos vivos multicelulares, como los embriones Xenopus , con alta resolución espacial y temporal.

Modulación reversible mediada por luz de la vía de la proteína quinasa activada por mitógeno durante la diferenciación celular y<em&gt; Xenopus</em&gt; Desarrollo embrionario

Un análisis simplista de la fluorescencia se presenta para evaluar la eficiencia de amino-acil-tRNA-sintetasa/tRNA pares no-canónico-aminoácidos (ncAAs) incorporar las proteínas expresadas en células de mamíferos. Se describe la aplicación de ncAAs estudiar receptores acoplado proteína G (GPCRs), incluida la asignación de foto-reticulación de enlace sitios bioorthogonal GPCR etiquetado en células vivas.

Optimizar la incorporación genética de química sondas en GPCRs para foto-reticulación asignación y la química de Bioorthogonal en células de mamífero vivo

Este protocolo proporciona un flujo de trabajo sobre cómo combinar artificial microRNA mediada por ARN de interferencia con optogenetics estimular específicamente botones presinápticos con menor expresión de genes selectivos dentro de circuitos neuronales intactos.

Combinando Optogenetics con microRNAs artificiales para caracterizar los efectos de Gene caída en la función presináptica en circuitos neuronales intactas

Con la manipulación optogenética de poblaciones neuronales específicas o regiones cerebrales, el comportamiento se puede modificar con alta resolución temporal y espacial en animales en movimiento libre. Mediante el uso de diferentes herramientas optogenéticas en combinación con fibras ópticas implantadas crónicamente, se puede realizar una variedad de modulaciones neuronales y pruebas de comportamiento.

Manipulación optogenética de la actividad neuronal para modular el comportamiento en ratones que se mueven libremente

El control fiable de las células de mamíferos sensibles a la luz requiere la estandarización de los métodos optogenéticos. Hacia este objetivo, este estudio describe una línea de construcción de circuitos genéticos, ingeniería celular, operación de equipos optogenéticos y ensayos de verificación para estandarizar el estudio de la expresión génica inducida por la luz utilizando un circuito genético optogenético de retroalimentación negativa como estudio de caso.

Ingeniería confiable y control de circuitos genéticos optogenéticos estables en células de mamíferos

Este protocolo describe la aplicación de un dominio de interruptor alostérico activado por luz azul (LightR) para el control espacio-temporal reversible de la actividad de las proteínas. Utilizando la tirosina quinasa Src como modelo, este estudio ofrece un protocolo elaborado para desarrollar y caracterizar Src regulado por luz (LightR-Src). Demuestra la versatilidad de este enfoque en todas las clases de enzimas.

Control espacio-temporal de la actividad proteica a través de la regulación alostérica optogenética

Aprende a controlar ópticamente proteínas neuronales utilizando aminoácidos no naturales codificados genéticamente en neuronas de hipocampo. Este método permite estudiar la función de proteínas específicas en la señalización neuronal con alta resolución espacial y temporal.

Control óptico de una proteína neuronal utilizando un ácido Unnatural Amino genéticamente codificados en las neuronas

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