Diferenciación de células madre pluripotentes humanas en precursores de células beta pancreáticas en un sistema de cultivo 2D

Este protocolo optimizado mejoró la generación de precursores de células beta pancreáticas a partir de células madre pluripotentes humanas, que pueden usarse para la terapia celular para la diabetes e investigar los mecanismos moleculares que subrayan la biogénesis de la diabetes. Esta es una técnica factible ya que se utiliza para cultivos monocapa 2D. Es fácil de aplicar y es consistente a través de múltiples líneas de células madre pluripotentes derivadas de pacientes y de control.

Estos precursores de células beta cuando se trasplantan en un paciente diabético pueden madurar en células beta secretoras de insulina y potencialmente pueden revertir la hiperglucemia. Por lo tanto, el aumento de los porcentajes de progenitores pancreáticos generados utilizando nuestro protocolo se puede utilizar para la terapia celular para la diabetes. Este protocolo mejorado se puede utilizar para estudiar el desarrollo pancreático humano temprano en individuos sanos, así como en pacientes diabéticos, lo cual es un desafío debido a la escasez de muestras de tejido.

Cuando las colonias de células madre pluripotentes humanas o hPSC hayan alcanzado una confluencia del 70 al 80%, lávelas dos veces con PBS caliente dentro de la campana de cultivo de tejidos. Luego aspire el tampón usando un aspirador de vacío portátil. A continuación, agregue el medio de diferenciación de la etapa uno que contiene CHIR-99021 a las colonias e incube la placa a 37 grados centígrados durante 24 horas.

Al día siguiente, reemplace los medios gastados con un medio de diferenciación de etapa uno sin CHIR-99021. Después de aspirar el medio gastado y lavar las células endodermas definitivas dos veces con PBS caliente, agite la placa para eliminar cualquier residuo celular. Luego fije las células agregando 4% de paraformaldehído y coloque la placa en un agitador bidimensional.

Después de la fijación, lave las células con solución salina tamponada con TRIS que contenga 0,5% de Tween y coloque la placa en el agitador. Luego permeabilice las celdas fijas agregando una cantidad generosa de PBS que contenga 0.5% Triton X-100 y vuelva a colocar la placa en el agitador. A continuación, agregue un tampón de bloqueo recién preparado a las células permeabilizadas e incube la placa durante una hora en el agitador.

Luego agregue anticuerpos primarios diluidos a las células bloqueadas y coloque la placa en el agitador a cuatro grados centígrados con una agitación suave. Al día siguiente, después de aspirar la solución primaria de anticuerpos, lave los pocillos tres veces con TBST durante 10 minutos cada una en el agitador. A continuación, agregue los anticuerpos secundarios.

Cubra la placa con papel de aluminio para protegerla de la luz y coloque la placa en el agitador a temperatura ambiente durante una hora. Luego aspire la solución de anticuerpos secundarios y lave los pocillos manchados con TBST en el agitador durante 10 minutos, manteniendo la placa cubierta con papel de aluminio. Luego, para teñir los núcleos, agregue la solución de Hoechst a los pocillos y coloque la placa en el agitador.

Después de dos o tres minutos, aspire la solución de Hoechst y enjuague los pocillos dos veces con PBS. Finalmente, agregue PBS a las células teñidas y visualice ellas usando un microscopio de fluorescencia invertida en la oscuridad. En el primer día de la etapa dos, disocie las células endodérmicas derivadas de hPSC lavándolas primero con PBS caliente y luego agregando un mililitro de solución enzimática tibia por pocillo de una placa de seis pocillos.

Coloque la placa a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante tres a cinco minutos o hasta que las células comiencen a desprenderse entre sí. Disocie las láminas separadas o la monocapa de células en los pozos, y recoja las células separadas juntas en un tubo de polipropileno de 15 mililitros utilizando medios de etapa basal. Luego gire las células hacia abajo, deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet usando un mililitro de PBS estéril.

Después de contar las celdas usando un contador automático, gire las celdas nuevamente y deseche el sobrenadante. Luego vuelva a suspender el pellet en el volumen apropiado del medio de diferenciación de la etapa dos que contiene un inhibidor de Rock. Coloque las células resuspendidas en una a 50 placas recubiertas de matriz de membrana e incubarlas a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono.

Después de 24 horas, reemplace el medio con medio de diferenciación de etapa dos sin el inhibidor de Rock. Al final de la etapa cuatro, separe las células como se demostró anteriormente y recójalas en un tubo de 15 mililitros. Luego gire las células, deseche el sobrenadante, lave las células con PBS y disocie en células individuales.

Después de contar las células con un contador de células automatizado, gire las células nuevamente y vuelva a suspender el pellet en 200 microlitros de PBS refrigerado. A continuación, agregue dos mililitros de etanol refrigerado al 80% con el tubo en un vórtice ajustado a velocidad baja a media. Cierre la tapa herméticamente y coloque el tubo ligeramente inclinado sobre el agitador a cuatro grados centígrados durante la noche.

Al día siguiente, gire las células y lave el gránulo con PBS para disociar cualquier grupo de células fijas. Luego bloquee las celdas fijas durante al menos una hora a temperatura ambiente o cuatro grados centígrados durante la noche en el agitador. Luego, para teñir los marcadores progenitores pancreáticos, distribuya 200, 000 células por condición, incluidos los controles de isotipo apropiados, los controles de anticuerpos secundarios y sin teñir en una placa inferior en V de 96 pocillos.

Luego gire la placa brevemente y voltee la placa con un movimiento rápido para desechar el sobrenadante sin perder los gránulos. A continuación, incubar las células en anticuerpos primarios durante al menos dos horas a temperatura ambiente en un agitador con agitación suave. Luego lave las células manchadas tres veces con TBST pipeteando hacia arriba y hacia abajo en los pocillos.

Centrifugar las células de nuevo, desechar el sobrenadante y añadir anticuerpos secundarios a las células. Después de una incubación de 30 minutos a temperatura ambiente, lave las células teñidas dos veces con TBST. Luego gire la placa, recoja las células teñidas en 100 microlitros de PBS en tubos de fax protegidos contra la luz y ejecute las muestras en una máquina de citometría de flujo.

En comparación con el método no optimizado, el protocolo optimizado mejoró la eficiencia de la diferenciación del progenitor pancreático al regular al alza la coexpresión de PDX 1 y NKX 6.1. En particular, la disociación de las células endodérmicas y su replacadura en la matriz de membrana fresca, junto con una mayor duración de la etapa tres, mejoró la expresión de NKX 6.1 en progenitores pancreáticos derivados de hPSC en comparación con el protocolo no disociado. Los progenitores pancreáticos generados utilizando el protocolo optimizado también aumentaron el número de células SOX9 positivas en comparación con el método no disociado.

Además, el método optimizado también generó una mayor proporción de células proliferativas positivas para NKX 6.1 que coexpresaron el marcador de proliferación Ki67. Para mejorar la eficiencia, es crucial disociar el endodermo derivado de HbA1 y luego extender la duración del tratamiento de la etapa tres con señalización amiloide FGF e inhibición de Hedgehog. La generación escalable de progenitores pancreáticos utilizando este protocolo mejorado ha facilitado estudios sobre la mejora de la eficiencia y la maduración de las células beta pancreáticas derivadas de células madre pluripotentes humanas y ha permitido el modelado de diferentes tipos de diabetes.