Name: La sensibilidad de la membrana mitocondrial interna al Na+ revela grupos de CoQ funcionales parcialmente segmentados (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-20T13:15:00.000+00:00
Duration: 5 min 27 s
Description: Aprende un método simplificado para estudiar los grupos de CoQ funcionales parcialmente segmentados en membranas mitocondriales. Esta técnica utiliza extractos mitocondriales y espectrofotometría para analizar la transferencia de electrones.

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Agradecemos al Dr. R. Martínez-de-Mena, M. M. Muñoz-Hernández, A., al Dr. C. Jiménez y al E. R. Martínez-Jiménez por su asistencia técnica. Este estudio fue apoyado por MICIN: RTI2018-099357-B-I00 y HFSP (RGP0016/2018). El CNIC cuenta con el apoyo del Instituto de Salud Carlos III (ISCIII), el Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (MCNU) y la Fundación Pro CNIC y es un Centro de Excelencia Severo Ochoa (SEV-2015-0505). Figura 2 creada con BioRender.com.

Todos los experimentos con animales se realizaron siguiendo la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y fueron aprobados por el comité de ética institucional del Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares Carlos III (CNIC), España, de acuerdo con la Directiva de la Unión Europea de 22 de septiembre de 2010 (2010/63/UE) y con el Real Decreto español de 1 de febrero de 2013 (53/2013). Se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el número de animales utilizados y su sufrimiento.
NOTA: Este ensayo comparativo para estudiar la segmentación de las piscinas de CoQ mitocondrial se describe de la siguiente manera:
1. Cuantificación de proteínas
<ol><li>Congelar y descongelar las mitocondrias aisladas26 de un hígado de ratón de tipo salvaje tres veces (es decir, membranas mitocondriales) antes de la experimentación para hacer que los orgánulos sean permeables a los sustratos de reacción.</li>
	<li>Cuantificar la cantidad de proteína de la muestra de mitocondrias aisladas mediante métodos de Bradford o ácido bicinconinico (BCA). En el caso de Bradford, agregue 2 μL de muestra en 1 ml de 1x reactivo de Bradford.</li>
	<li>Divida la muestra en cuatro submuestras de 20 μg cada una (a saber: A, B, C, D; Figura 2A).</li>
</ol>2. Medición de la actividad DE CI+CIII
NOTA: Esta parte del protocolo utiliza muestras A y B para medir la actividad de CI+CIII (Figura 2B).
<ol><li>Divida las muestras A y B en dos submuestras de 10 μg cada una (a saber, A1, A2, B1 y B2). Mezcle cada una de las submuestras en una cubeta de 1 ml con 30 μL de citt c (10 mg/ml), 10 μL de malonato de 100 ml y agregue tampón C1/C2 precalentado (Tabla 1) a 37 °C hasta 980 μL (979 μL para cubetas A2 y B2). PRECAUCIÓN: Este paso implica el uso de los reactivos tóxicos malonato y cianuro de potasio. NOTA: cyt c (10 mg/mL) debe prepararse fresco mezclando 10 mg de cyt c en 1 mL de solución de 10 mM K2HPO4 , pH ajustado a 7.2, y debe mantenerse en hielo durante todo el experimento.</li>
	<li>Añadir 10 μL de 1 M KCl en las cubetas A1 y A2, y añadir 10 μL de 1 M NaCl en las cubetas B1 y B2.</li>
	<li>Añadir 1 μL de rotenona de 1 mM en la cubeta que contiene las submuestras A2 y B2. PRECAUCIÓN: Este paso implica el uso del reactivo tóxico rotenona.</li>
	<li>Justo antes de la medición, agregue 10 μL de NADH (10 mM) en todas las cubetas. NOTA: Los 10 μL se agregan preferiblemente en el paso de la cubeta, por lo que la reacción comienza al mezclar.</li>
	<li>Mezcle la cubeta volteándola cuidadosamente tres veces. Colóquelo en el lector de cubetas de absorbancia (espectrofotómetro UV/VISJASCO).</li>
	<li>Haga clic en Medir > parámetros > General y establezca los parámetros de medición en Longitud de onda: 550 nm y Tiempo: 4 minutos de lectura; pulse los botones Aceptar e Inicio para comenzar el experimento.</li>
	<li>Al final de la medición, guarde la pendiente que comprende el aumento lineal de la absorbancia haciendo clic en Archivo y Guardar como. La pendiente también se puede recoger manualmente.</li>
</ol>3. Medición de la actividad CII+CIII
NOTA: Esta parte del protocolo utiliza muestras C y D para medir la actividad de CII+CIII (Figura 2C).
<ol><li>Divida las muestras C y D en dos submuestras de 10 μg cada una (a saber, C1, C2, D1 y D2). Mezcle cada una de las submuestras en una cubeta de 1 ml con 30 μL de citt c (10 mg/ml), 1 μL de rotenona de 1 mM y agregue tampón C1/C2 precalentado a 37 °C hasta 980 μL (970 μL para cubetas C2 y D2). PRECAUCIÓN: Este paso implica el uso de los reactivos tóxicos cianuro de potasio y rotenona. NOTA: cyt c (10 mg/mL) debe prepararse fresco mezclando 10 mg de cyt c en 1 mL de solución de 10 mM K2HPO4 , pH ajustado a 7.2, y debe mantenerse en hielo durante todo el experimento.</li>
	<li>Añadir 10 μL de 1 M KCl en las cubetas C1 y C2, y añadir 10 μL de 1 M NaCl en las cubetas D1 y D2.</li>
	<li>Añadir 1 μL de 1 mM de antimicina A en la cubeta que contiene las submuestras C2 y D2. PRECAUCIÓN: Este paso implica el uso del reactivo tóxico antimicina A.</li>
	<li>Justo antes de la medición, agregue 10 μL de succinato (1 M) en todas las cubetas. NOTA: Los 10 μL se agregan preferiblemente en el paso de la cubeta, por lo que la reacción comienza al mezclar.</li>
	<li>Mezcle la cubeta con cuidado, volteándola tres veces. Colóquelo en el lector de cubetas de absorbancia (espectrofotómetro UV/VIS).</li>
	<li>Haga clic en Medir > parámetros > General y establezca los parámetros de medición en Longitud de onda: 550 nm y Tiempo: 4 min de lectura; pulse los botones Aceptar e Inicio para comenzar el experimento.</li>
	<li>Al final de la medición, guarde la pendiente que comprende el aumento lineal de la absorbancia haciendo clic en Archivo y Guardar como. La pendiente también se puede recoger manualmente.</li>
</ol>

<ol><li>Calvo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+role+of+respiratory+supercomplexes+in+mice%3A+SCAF1+relevance+and+segmentation+of+the+Qpool%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Functional role of respiratory supercomplexes in mice: SCAF1 relevance and segmentation of the Qpool.</a> Science Advances. 6 (26), (2020).</li>
<li>Garcia-Poyatos, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaf1+promotes+respiratory+supercomplexes+and+metabolic+efficiency+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Scaf1 promotes respiratory supercomplexes and metabolic efficiency in zebrafish.</a> EMBO Reports. 21 (7), 50287(2020).</li>
<li>Lapuente-Brun, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supercomplex+assembly+determines+electron+flux+in+the+mitochondrial+electron+transport+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Supercomplex assembly determines electron flux in the mitochondrial electron transport chain.</a> Science. 340 (6140), 1567-1570 (2013).</li>
<li>Cogliati, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+super-assembly+of+respiratory+complexes+III+and+IV%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mechanism of super-assembly of respiratory complexes III and IV.</a> Nature. 539 (7630), 579-582 (2016).</li>
<li>Letts, J. A., Fiedorczuk, K., Degliesposti, G., Skehel, M., Sazanov, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+of+respiratory+Supercomplex+I%2BIII2+reveal+functional+and+conformational+crosstalk%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Structures of respiratory Supercomplex I+III2 reveal functional and conformational crosstalk.</a> Molecular Cell. 75 (6), 1131-1146 (2019).</li>
<li>Acin-Perez, R., Fernandez-Silva, P., Peleato, M. L., Perez-Martos, A., Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+active+mitochondrial+supercomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Respiratory active mitochondrial supercomplexes.</a> Molecular Cell. 32 (4), 529-539 (2008).</li>
<li>Jeon, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dynamic+substrate+pool+revealed+by+cryo-EM+of+a+lipid-preserved+respiratory+supercomplex%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+and+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">A dynamic substrate pool revealed by cryo-EM of a lipid-preserved respiratory supercomplex.</a> Antioxidants and Redox Signaling. , (2021).</li>
<li>Gu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+architecture+of+the+mammalian+respirasome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The architecture of the mammalian respirasome.</a> Nature. 537 (7622), 639-643 (2016).</li>
<li>Letts, J. A., Fiedorczuk, K., Sazanov, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+architecture+of+respiratory+supercomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The architecture of respiratory supercomplexes.</a> Nature. 537 (7622), 644-648 (2016).</li>
<li>Sousa, J. S., Mills, D. J., Vonck, J., Kuhlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+asymmetry+and+electron+flow+in+the+bovine+respirasome%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Functional asymmetry and electron flow in the bovine respirasome.</a> Elife. 5, 21290(2016).</li>
<li>Andreasson, C., Ott, M., Buttner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+orchestrate+proteostatic+and+metabolic+stress+responses%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Mitochondria orchestrate proteostatic and metabolic stress responses.</a> EMBO Reports. 20 (10), 47865(2019).</li>
<li>Berndtsson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+supercomplexes+enhance+electron+transport+by+decreasing+cytochrome+c+diffusion+distance%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Respiratory supercomplexes enhance electron transport by decreasing cytochrome c diffusion distance.</a> EMBO Reports. 21 (12), 51015(2020).</li>
<li>Bianchi, C., Genova, M. L., Parenti Castelli, G., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial+respiratory+chain+is+partially+organized+in+a+supercomplex+assembly%3A+kinetic+evidence+using+flux+control+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial respiratory chain is partially organized in a supercomplex assembly: kinetic evidence using flux control analysis.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (35), 36562-36569 (2004).</li>
<li>Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supramolecular+organization+of+respiratory+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Supramolecular organization of respiratory complexes.</a> Annual Review of Physiology. 78, 533-561 (2016).</li>
<li>Genova, M. L., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+appraisal+of+the+role+of+respiratory+supercomplexes+in+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A critical appraisal of the role of respiratory supercomplexes in mitochondria.</a> Biological Chemistry. 394 (5), 631-639 (2013).</li>
<li>Letts, J. A., Sazanov, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clarifying+the+supercomplex%3A+the+higher-order+organization+of+the+mitochondrial+electron+transport+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Clarifying the supercomplex: the higher-order organization of the mitochondrial electron transport chain.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 24 (10), 800-808 (2017).</li>
<li>Milenkovic, D., Blaza, J. N., Larsson, N. G., Hirst, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+enigma+of+the+respiratory+chain+supercomplex%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">The enigma of the respiratory chain supercomplex.</a> Cell Metabolism. 25 (4), 765-776 (2017).</li>
<li>Moe, A., Di Trani, J., Rubinstein, J. L., Brzezinski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+structure+and+kinetics+reveal+electron+transfer+by+2D+diffusion+of+cytochrome+c+in+the+yeast+III-IV+respiratory+supercomplex%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM structure and kinetics reveal electron transfer by 2D diffusion of cytochrome c in the yeast III-IV respiratory supercomplex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (11), 2021157118(2021).</li>
<li>Szibor, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioenergetic+consequences+from+xenotopic+expression+of+a+tunicate+AOX+in+mouse+mitochondria%3A+Switch+from+RET+and+ROS+to+FET%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta.+Bioenergetics%22%5BJournal%5D)">Bioenergetic consequences from xenotopic expression of a tunicate AOX in mouse mitochondria: Switch from RET and ROS to FET.</a> Biochimica et Biophysica Acta. Bioenergetics. 1861 (2), 148137(2020).</li>
<li>Guaras, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CoQH2%2FCoQ+ratio+serves+as+a+sensor+of+respiratory+chain+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">The CoQH2/CoQ ratio serves as a sensor of respiratory chain efficiency.</a> Cell Reports. 15 (1), 197-209 (2016).</li>
<li>Hernansanz-Agustin, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Na%28%2B%29+controls+hypoxic+signalling+by+the+mitochondrial+respiratory+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Na(+) controls hypoxic signalling by the mitochondrial respiratory chain.</a> Nature. 586 (7828), 287-291 (2020).</li>
<li>Vercellino, I., Sazanov, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+assembly%2C+regulation+and+function+of+the+mitochondrial+respiratory+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The assembly, regulation and function of the mitochondrial respiratory chain.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 23 (2), 141-161 (2022).</li>
<li>Acin-Perez, R., Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+function+of+the+respiratory+supercomplexes%3A+the+plasticity+model%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">The function of the respiratory supercomplexes: the plasticity model.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1837 (4), 444-450 (2014).</li>
<li>Enriquez, J. A., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coenzyme+q+and+the+respiratory+chain%3A+coenzyme+q+pool+and+mitochondrial+supercomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Syndromology%22%5BJournal%5D)">Coenzyme q and the respiratory chain: coenzyme q pool and mitochondrial supercomplexes.</a> Molecular Syndromology. 5 (3-4), 119-140 (2014).</li>
<li>Hernansanz-Agustin, P., Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+segmentation+of+CoQ+and+cyt+c+pools+by+respiratory+complex+superassembly%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Functional segmentation of CoQ and cyt c pools by respiratory complex superassembly.</a> Free Radical Biology and Medicine. 167, 232-242 (2021).</li>
<li>Fernandez-Vizarra, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mitochondria+for+biogenetical+studies%3A+An+update%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">Isolation of mitochondria for biogenetical studies: An update.</a> Mitochondrion. 10 (3), 253-262 (2010).</li>
<li>Cogliati, S., Cabrera-Alarcon, J. L., Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+and+functional+role+of+the+electron+transport+chain+supercomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">Regulation and functional role of the electron transport chain supercomplexes.</a> Biochemical Society Transactions. 49 (6), 2655-2668 (2021).</li>
<li>den Brave, F., Becker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supercomplex+formation+boosts+respiration%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Supercomplex formation boosts respiration.</a> EMBO Reports. 21 (12), 51830(2020).</li>
<li>Perez-Mejias, G., Guerra-Castellano, A., Diaz-Quintana, A., Dela Rosa, M. A., Diaz-Moreno, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochrome+c%3A+Surfing+off+of+the+mitochondrial+membrane+on+the+tops+of+Complexes+III+and+IV%5BTitle%5D)+AND+%22Computational+and+Structural+Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Cytochrome c: Surfing off of the mitochondrial membrane on the tops of Complexes III and IV.</a> Computational and Structural Biotechnology Journal. 17, 654-660 (2019).</li>
<li>Stepanova, A., Valls, A., Galkin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+monovalent+cations+on+the+kinetics+of+hypoxic+conformational+change+of+mitochondrial+complex+I%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Effect of monovalent cations on the kinetics of hypoxic conformational change of mitochondrial complex I.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1847 (10), 1085-1092 (2015).</li>
<li>Acin-Perez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+approach+to+measure+mitochondrial+respiration+in+frozen+biological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">A novel approach to measure mitochondrial respiration in frozen biological samples.</a> The EMBO Journal. 39 (13), 104073(2020).</li>
<li>Böckmann, R. A., Hac, A., Heimburg, T., Grubmüller, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+sodium+chloride+on+a+lipid+bilayer%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Effect of sodium chloride on a lipid bilayer.</a> Biophysical Journal. 85 (3), 1647-1655 (2003).</li>
<li>Cordomí, A., Edholm, O., Perez, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+ions+on+a+dipalmitoyl+phosphatidylcholine+bilayer.+a+molecular+dynamics+simulation+study%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physical+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">Effect of ions on a dipalmitoyl phosphatidylcholine bilayer. a molecular dynamics simulation study.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 112 (5), 1397-1408 (2008).</li>
</ol>

Los autores declaran que no hay conflictos de intereses.

Aunque este protocolo representa un procedimiento muy sencillo para identificar la existencia de los grupos de CoQ parcialmente segmentados, hay algunos pasos críticos a tener en cuenta. Los sustratos (es decir, NADH o succinato) se agregan preferiblemente en último lugar, ya que puede ocurrir la autooxidación de estos compuestos. El volteo de cuvette debe ser cuidadoso para evitar la formación de burbujas que puedan interferir con la lectura.
Además, la presente técnica presenta algunas limit...

El sistema de fosforilación oxidativa mitocondrial (OXPHOS) es la principal vía que impulsa la síntesis de trifosfato de adenosina (ATP), la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) y el consumo de equivalentes reductores, como nicotinamida adenina dinucleótido (NADH) o succinato, por parte de las mitocondrias. El sistema OXPHOS se compone de cinco complejos de proteínas: el Complejo I (CI) oxida el NADH y reduce la CoQ en ubiquinol (CoQH2). El Complejo II (CII) oxida el succinato en fumarato y reduce la CoQ en CoQH2. El Complejo III (CIII) oxida la CoQH2 de nuevo en CoQ, reduciendo el citocromo c (cyt c). Finalmente, el complejo IV (CIV) oxida el citt c y reduce el oxígeno al agua. Esta cadena de oxidorreducción, la llamada cadena de transporte de electrones (mETC), está acoplada al bombeo de H + a través de la IMM, lo que crea un gradiente electroquímico utilizado por el complejo V (CV) para fosforilar el difosfato de adenosina (ADP) en ATP.
Los complejos mETC pueden estar solos en el IMM o ensamblarse en estructuras cuaternarias llamadas supercomplejos. El CIV puede ensamblarse con CIII, formando el III2+IV o Q-respirasoma (ya que es capaz de respirar en presencia de CoQH2)1,2,3 o formando homodímeros u homooligomeros4. CIII puede interactuar con CI, formando el supercomplejo I+III25. Finalmente, CI también es capaz de interactuar con el Q-respirasoma, construyendo el I+III2+IV o N-respirasoma (ya que puede respirar consumiendo NADH)1,6,7,8,9,10.
CoQ y cyt c son portadores de electrones móviles encargados de transferir electrones de CI/CII a CIII, y de CIII a CIV, respectivamente. Si los supercomplejos imponen o no una restricción local funcional para estos portadores ha sido un tema de intenso debate a lo largo de las últimas dos décadas 2,7,11,12,13,14,15,16,17. Sin embargo, varios grupos independientes han demostrado que coQ y cyt c se pueden segmentar funcionalmente en grupos en el IMM. Con respecto a la CoQ, se puede segmentar funcionalmente en una agrupación específica de CoQ para IC (CoQNAD) y otra agrupación dedicada a enzimas dependientes de FAD (CoQFAD)1,7,12,18,19. Sin embargo, para diferenciar la existencia de grupos funcionales de CoQ parcialmente segmentados, se requirió la sobreexpresión de la oxidasa alternativa (AOX) y la generación de mutantes específicos de ADNmt, que pueden ensamblar IC en ausencia de CIII, 1,19,20.
El mecanismo de producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) durante la hipoxia era desconocido hasta hace poco. Ante la hipoxia aguda, IC sufre la transición activa/deactiva (A/D), que implica la disminución de su actividad de bombeo H+ NADH-CoQ oxidorreductasa. Tal disminución en el bombeo de H + acidifica la matriz mitocondrial y disuelve parcialmente los precipitados de calcio-fosfato en la matriz mitocondrial, liberando Ca2 + soluble. Este aumento de Ca2+ soluble activa el intercambiador Na+/Ca2+ (NCLX), que extruye Ca2+ a cambio de Na+. El aumento de Na+ mitocondrial interactúa con los fosfolípidos en el lado interno de la IMM, disminuyendo su fluidez y transferencia de CoQ entre CII y CIII, produciendo finalmente anión superóxido, una señal redox21. Curiosamente, la transferencia de CoQ solo disminuyó entre CII y CIII, pero no entre IC y CIII, destacando que 1) Na+ fue capaz de modular solo uno de los grupos de CoQ existentes en las mitocondrias; 2) existen grupos de CoQ funcionalmente diferenciados en el IMM. Por lo tanto, se puede utilizar un protocolo ampliamente utilizado para el estudio de las actividades enzimáticas mitocondriales para evaluar la existencia de las piscinas de CoQ mencionadas.
El protocolo actual se basa en la medición de la reducción de la cit c oxidada, el sustrato de CIII, por absorbancia en presencia de succinato (es decir, sustrato CII) o NADH (es decir, sustrato CI). La misma muestra se divide en dos, una de las cuales será tratada con KCl, y la otra con la misma concentración de NaCl. De esta manera, dado que el Na+ disminuye la fluidez de la IMM, si la CoQ existiera en un pool único en la IMM, tanto la CI+CIII como la CII+CIII disminuirían en presencia de Na+. Sin embargo, si la CoQ existiera en grupos de CoQ funcionales parcialmente segmentados, el efecto de Na+ sería mayormente (o sólo) evidente en la actividad de CII+CIII, pero no en la CI+CIII. Como se publicó recientemente21, na+ solo afecta la transferencia de CoQ entre CII y CIII (Figura 1C,D), pero no entre IC y CIII (Figura 1A,B).
Este protocolo, junto con una panoplia de técnicas, se ha utilizado para confirmar la existencia de grupos funcionales de CoQ parcialmente segmentados en el IMM, uno dedicado a CI (es decir, CoQNAD) y otro dedicado a enzimas ligadas a FAD (es decir, CoQFAD)1,3,7; una observación que, aunque se sigue debatiendo22, ha sido corroborada de forma independiente por varios grupos 7,19. Así, el superasamblaje de IC en supercomplejos impacta en la movilidad local de CoQ, facilitando su uso por el CIII dentro del supercomplejo 1,7,13,14,23,24,25.

<table><tbody><tr><td>Antimicina A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8674</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10775835001</td><td></td></tr><tr><td>Bradford</td> ensayo <td>de proteínas Bio-Rad</td><td>5000001</td><td></td></tr><tr><td>Citocromo c del corazón equino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7752</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3786</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>Ácido malónico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1296</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>NADH</td><td>Roche</td><td>10107735001</td><td></td></tr><tr><td>Cianuro de potasio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>207810</td><td></td></tr><tr><td>Rotenona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8875</td><td></td></tr><tr><td>Software Spectra Manager</td><td>JASCO</td><td>versión 2</td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotómetro</td><td>UV/VISJASCO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Succinato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>398055</td><td></td></tr></tbody></table>

la sensibilidad de la membrana mitocondrial interna al na+ revela grupos de coq funcionales parcialmente segmentados

Inner Mitochondrial Membrane Sensitivity to Na+ Reveals Partially Segmented Functional CoQ Pools

Las piscinas de ubiquinona (CoQ) en la membrana mitocondrial interna (IMM) están parcialmente segmentadas en enzimas complejas I o dependientes de FAD. Dicha subdivisión puede evaluarse fácilmente mediante un ensayo comparativo utilizando NADH o succinato como donantes de electrones en mitocondrias congeladas-descongeladas, en las que se mide la reducción del citocromo c (cyt c). El ensayo se basa en el efecto de Na+ sobre el IMM, disminuyendo su fluidez. Aquí, presentamos un protocolo para medir la actividad de la NADH-cyt c oxidorreductasa y las actividades de la succinato-cyt c oxidorreductasa en presencia de NaCl o KCl. Las reacciones, que se basan en la mezcla de reactivos en una cubeta de manera escalonada, se miden espectrofotométricamente durante 4 min en presencia de Na+ o K+. La misma mezcla se realiza en paralelo en presencia de inhibidores enzimáticos específicos para restar el cambio inespecífico en la absorbancia. La actividad de la NADH-cyt c oxidorreductasa no disminuye en presencia de ninguno de estos cationes. Sin embargo, la actividad de la oxidorreductasa de succinato-cyt c disminuye en presencia de NaCl. Este sencillo experimento destaca: 1) el efecto del Na+ en la disminución de la fluidez de la IMM y la transferencia de CoQ; 2) que el supercomplejo I + III2 protege la transferencia de ubiquinona (CoQ) de verse afectada por la disminución de la fluidez de IMM; 3) que la transferencia de CoQ entre IC y CIII es funcionalmente diferente de la transferencia de CoQ entre CII y CIII. Estos hechos apoyan la existencia de grupos de CoQ funcionalmente diferenciados en el IMM y muestran que pueden ser regulados por el entorno cambiante de Na + de las mitocondrias.

Los resultados típicos de este protocolo se representan a continuación (Figura 3). Como la absorbancia reducida de cyt c se localiza en 550 nm, todas las submuestras desinhibidas deben mostrar un aumento en la absorbancia a 550 nm. Las submuestras inhibidas muestran idealmente una pendiente de línea plana o ligeramente creciente (Figura 3). Las pendientes de las submuestras inhibidas deben restarse de las submuestras desinhibidas.
Las...

Este protocolo describe un ensayo comparativo, utilizando actividades complejas mitocondriales CI+CIII y CII+CIII en presencia o ausencia de Na+, para estudiar la existencia de grupos funcionales de CoQ parcialmente segmentados.

La sensibilidad de la membrana mitocondrial interna al Na+ revela grupos de CoQ funcionales parcialmente segmentados

Ubiquinone (CoQ) pools in the inner mitochondrial membrane (IMM) are partially segmented to either complex I or FAD-dependent enzymes. Such subdivision ...

Este protocolo destaca el papel del sodio como segundo mensajero y también muestra la existencia de piscinas de ubiquinol parcialmente diferenciadas. Esta técnica demuestra un enfoque extremadamente simple para el estudio de piscinas de ubiquinol que, de lo contrario, requiere modelos celulares muy específicos. Este enfoque se puede utilizar para el estudio de la transferencia de electrones en otras membranas, particularmente de enzimas dentro de las gotas de lípidos.Divida las muestras en cuatro submuestras de 20 microgramos cada una y etiquételas de A a D.Divida las muestras A y B en dos submuestras de 10 microgramos cada una y etiquételas como A1, A2, B1 y B2. Prepare el búfer C1/C2 como se describe en el protocolo de texto y precaliente a 37 grados centígrados. En una cubeta de un mililitro, agregue cada una de las submuestras a 30 microlitros de citocromo c y 10 microlitros de malonato. Agregue un búfer C1 / C2 para aumentar el volumen a 980 microlitros en cubetas A1 y B1 y 979 microlitros en A2 y B2. Añadir 10 microlitros de cloruro de potasio un molar en las cubetas A1 y A2 y 10 microlitros de cloruro de sodio un molar en B1 y B2. Agregue un microlitro de rotenona de un milimolar en las cubetas A2 y B2. Justo antes de la medición, agregue 10 microlitros de NADH de 10 milimolares en todas las cubetas.Voltee la cubeta tres veces y colóquela en el espectrofotómetro. En el software adjunto, haga clic en Medir y luego en Parámetros, luego vaya a General y establezca los parámetros de medición en longitud de onda de 550 nanómetros y tiempo en cuatro minutos de lectura. Haga clic en Aceptar y Comience para comenzar el experimento.Al final de la medición, guarde la pendiente que comprende el aumento lineal de la absorbancia haciendo clic en Archivo y Guardar como.Divida las muestras C y D en dos submuestras de 10 microgramos cada una y etiquételas como C1, C2, D1 y D2. Mezcle cada una de las submuestras en una cubeta de un mililitro con 30 microlitros de citocromo c y un microlitro de rotenona. Agregue un tampón C1 / C2 precalentado a 37 grados Celsius para elevar el volumen a 980 microlitros en las cubetas C1 y D1 y 970 microlitros en C2 y D2. Añadir 10 microlitros de cloruro de potasio monolar en cubetas C1 y C2 y 10 microlitros de cloruro de sodio monolar en D1 y D2. Agregue un microlitro de antimicina A de un milimolar en las cubetas C2 y D2 justo antes de la medición y 10 microlitros de succinato de un molar en todas las cubetas. Voltee la cubeta tres veces y colóquela en el espectrofotómetro.Realizar la medición y guardar la pendiente que comprende el aumento lineal de la absorbancia al final de la medición. Este protocolo se utilizó para estudiar el efecto de los iones de sodio en la reducción del citocromo c por las membranas mitocondriales sobre la adición de NADH o succinato. Las trazas de absorbancia generadas a 550 nanómetros para las muestras A y B se corrigieron para su correspondiente inhibición.Estos rastros mostraron una pendiente similar, lo que indica una actividad similar de nadH-citocromo c oxidorreductasa. Sin embargo, los rastros para las muestras C y D fueron diferentes, mostrando que la actividad de la succinato-citocromo c oxidorreductasa de la muestra C es mayor que la de la muestra D.In fin de normalizar la cantidad de cambio medido con esta técnica, se pueden realizar otros métodos, como la actividad aislada del complejo I, el complejo II o el complejo III. Usando esta técnica, estamos explorando los entornos fisiológicos en los que el sodio puede estar involucrado como un segundo mensajero.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Un protocolo espectrofluorométrico para la medición de la apertura del poro de transición de permeabilidad mitocondrial en el corazón de ratón mitocondrias aisladas se presenta aquí. El ensayo involucra la medición simultánea de las mitocondrias...

Multi-parámetro de medición de la apertura del poro de transición de permeabilidad en el corazón del ratón mitocondrias aisladas

Este protocolo describe la separación de complejos funcionales de cadenas de transporte de electrones mitocondriales (Cx) IV y sus supercomplejos utilizando electroforesis nativa para revelar información sobre su ensamblaje y estructura. El gel nativo puede someterse a inmunotransferencia, ensayos en gel y purificación por electroelución para caracterizar adicionalmente los complejos individuales.

Análisis de supercomplexes de la cadena de transporte de electrones mitocondriales con electroforesis nativa, ensayos en gel y electroelución

Aquí, presentamos dos protocolos para la medición de mitocondrial Ca2 + afluencia en mitocondrias aisladas y células cultivadas. Para mitocondrias aisladas, detallamos una placa base de lector Ca2 + importación de ensayo utilizando el Ca2 + sensible tinte verde-5N de calcio. Para las células cultivadas, se describe un método de microscopia confocal con el Ca2 + tinte Rhod-2/AM.

Análisis de la afluencia del calcio mitocondrial en las mitocondrias aisladas y células cultivadas

Aquí presentamos un protocolo para extraer, resolver e identificar los supercomplejos mitocondriales que minimizan la exposición a los detergentes y al azul de Coomassie. Este protocolo ofrece un equilibrio óptimo entre la resolución y la preservación de las actividades enzimáticas, al tiempo que minimiza el riesgo de pérdida de interacciones entre proteínas y proteínas del lábil.

Híbrido claro/azul electroforesis nativa para la separación y análisis de Supercomplejos de cadenas respiratorias mitocondriales

A pesar de los avances recientes, muchas proteínas mitocondriales de levadura aún permanecen con sus funciones completamente desconocidas. Este protocolo proporciona un método sencillo y fiable para determinar la localización submitocondrial de proteínas, que ha sido fundamental para la elucidación de sus funciones moleculares.

Evaluación de la localización de proteínas submitochondriales en levaduras en ciernes Saccharomyces cerevisiae

Este método explota la contribución del poro de transición de permeabilidad mitocondrial a la fuga de protones de baja conductancia para determinar el umbral de voltaje para la apertura de poros en ratones con síndrome de X frágil neonatal con mayor contenido de coenzima Q mitocondrial de cardiomiocitos en comparación con el control de tipo salvaje.

Evaluación de la probabilidad abierta del poro de transición de permeabilidad mitocondrial en el contexto del exceso de coenzima Q

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Los sitios de contacto mitocondrial son complejos proteicos que interactúan con las proteínas de la membrana interna y externa mitocondrial. Estos sitios son esenciales para la comunicación entre las membranas mitocondriales y, por lo tanto, entre el citosol y la matriz mitocondrial. Aquí, describimos un método para identificar candidatos que califican para esta clase específica de proteínas.

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Este protocolo presenta un flujo de trabajo para la propagación, diferenciación y tinción de células SH-SY5Y cultivadas y neuronas primarias del hipocampo de rata para la visualización y el análisis de la ultraestructura mitocondrial mediante microscopía de agotamiento de emisiones estimuladas (STED).

Uso de imágenes de células vivas de STED para visualizar la ultraestructura de la membrana interna mitocondrial en modelos de células neuronales

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Aprende un método simplificado para estudiar los grupos de CoQ funcionales parcialmente segmentados en membranas mitocondriales. Esta técnica utiliza extractos mitocondriales y espectrofotometría para analizar la transferencia de electrones.

La sensibilidad de la membrana mitocondrial interna al Na⁺ revela grupos de CoQ funcionales parcialmente segmentados

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