La sensibilidad de la membrana mitocondrial interna al Na⁺ revela grupos de CoQ funcionales parcialmente segmentados

Este protocolo destaca el papel del sodio como segundo mensajero y también muestra la existencia de piscinas de ubiquinol parcialmente diferenciadas. Esta técnica demuestra un enfoque extremadamente simple para el estudio de piscinas de ubiquinol que, de lo contrario, requiere modelos celulares muy específicos. Este enfoque se puede utilizar para el estudio de la transferencia de electrones en otras membranas, particularmente de enzimas dentro de las gotas de lípidos.

Divida las muestras en cuatro submuestras de 20 microgramos cada una y etiquételas de A a D.Divida las muestras A y B en dos submuestras de 10 microgramos cada una y etiquételas como A1, A2, B1 y B2. Prepare el búfer C1/C2 como se describe en el protocolo de texto y precaliente a 37 grados centígrados. En una cubeta de un mililitro, agregue cada una de las submuestras a 30 microlitros de citocromo c y 10 microlitros de malonato. Agregue un búfer C1 / C2 para aumentar el volumen a 980 microlitros en cubetas A1 y B1 y 979 microlitros en A2 y B2. Añadir 10 microlitros de cloruro de potasio un molar en las cubetas A1 y A2 y 10 microlitros de cloruro de sodio un molar en B1 y B2. Agregue un microlitro de rotenona de un milimolar en las cubetas A2 y B2. Justo antes de la medición, agregue 10 microlitros de NADH de 10 milimolares en todas las cubetas.

Voltee la cubeta tres veces y colóquela en el espectrofotómetro. En el software adjunto, haga clic en Medir y luego en Parámetros, luego vaya a General y establezca los parámetros de medición en longitud de onda de 550 nanómetros y tiempo en cuatro minutos de lectura. Haga clic en Aceptar y Comience para comenzar el experimento.

Al final de la medición, guarde la pendiente que comprende el aumento lineal de la absorbancia haciendo clic en Archivo y Guardar como.Divida las muestras C y D en dos submuestras de 10 microgramos cada una y etiquételas como C1, C2, D1 y D2. Mezcle cada una de las submuestras en una cubeta de un mililitro con 30 microlitros de citocromo c y un microlitro de rotenona. Agregue un tampón C1 / C2 precalentado a 37 grados Celsius para elevar el volumen a 980 microlitros en las cubetas C1 y D1 y 970 microlitros en C2 y D2. Añadir 10 microlitros de cloruro de potasio monolar en cubetas C1 y C2 y 10 microlitros de cloruro de sodio monolar en D1 y D2. Agregue un microlitro de antimicina A de un milimolar en las cubetas C2 y D2 justo antes de la medición y 10 microlitros de succinato de un molar en todas las cubetas. Voltee la cubeta tres veces y colóquela en el espectrofotómetro.

Realizar la medición y guardar la pendiente que comprende el aumento lineal de la absorbancia al final de la medición. Este protocolo se utilizó para estudiar el efecto de los iones de sodio en la reducción del citocromo c por las membranas mitocondriales sobre la adición de NADH o succinato. Las trazas de absorbancia generadas a 550 nanómetros para las muestras A y B se corrigieron para su correspondiente inhibición.

Estos rastros mostraron una pendiente similar, lo que indica una actividad similar de nadH-citocromo c oxidorreductasa. Sin embargo, los rastros para las muestras C y D fueron diferentes, mostrando que la actividad de la succinato-citocromo c oxidorreductasa de la muestra C es mayor que la de la muestra D.In fin de normalizar la cantidad de cambio medido con esta técnica, se pueden realizar otros métodos, como la actividad aislada del complejo I, el complejo II o el complejo III. Usando esta técnica, estamos explorando los entornos fisiológicos en los que el sodio puede estar involucrado como un segundo mensajero.