Name: Método para visualizar y analizar de membrana Interactuando Proteínas por Microscopía Electrónica de Transmisión (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: Aprende a visualizar proteínas de membrana extracelulares unidas a nanodiscos mediante microscopía electrónica de transmisión con tinción negativa. Este método revela interacciones proteína-membrana útiles para el desarrollo de fármacos.

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Los autores agradecen el Consejo Sueco de Investigación, Consejo del Condado de Estocolmo, y los fondos de KI por su apoyo. La expresión y purificación de MSP se llevó a cabo en el Instituto Karolinska de proteína / SciLifeLab Fondo para la Ciencia Core (http://PSF.ki.se). Los autores también desean agradecer al Dr. Pasi Purhonen Mathilda y el Dr. Sjöberg por compartir sus conocimientos técnicos y su ayuda oportuna.

1. Preparación de nanodiscos <ol><li> Expresión y purificación de la proteína de andamiaje de la membrana 8, 35 <ol><li> Expresar el MSP1E3D1 marcada con His en el E. coli BL21 (DE3) cepa T1R pRARE2 en frascos. Preparar un cultivo iniciador durante la noche de 50 ml con medio LB suplementado con 50 g / ml de kanamicina a 37 ° C. Diluir el cultivo iniciador durante la noche en 2 L de medio de caldo excelente suplementado con 50 g / ml de kanamicina. </li><li> Cultivar las células a 37 ° C hasta que la densidad óptica a 600 nm (OD 600) alcanza aproximadamente 3. inducen la expresión de la proteína con 0,5 mM isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) durante 3 horas a 18 ° C. </li><li> Preparar el tampón de lisis (100 mM Tris-HCl, pH 8,0; NaCl 100 mM; y 10% de glicerol). Añadir TCEP 1 mM inmediatamente antes del uso. </li><li> Después de 3 h de inducción a 18 ° C, recoger las células por centrifugación durante 10 min a 4.500 xgy 4 ° C. Descartar el sobrenadante, pesar las células recogidas, y les re-suspender en tampón de lisis a una razón de 2 ml de tampón de lisis por gramo de células. </li><li> Lisar las células por sonicación de impulsos (frecuencia de repetición: 4 s ON, 4 s OFF) durante 3 min a 80% de la amplitud. </li><li> Centrifugar los lisados ​​durante 20 minutos a 49.000 x g y 4 ° C. Se desecha el precipitado de esta centrifugación. </li><li> Inyectar el sobrenadante en un 5 ml Ni + columna quelante conectado a un sistema de cromatografía de líquidos automatizado preferentemente se mantiene a 4 ° C. </li><li> Antes de la etapa de elución (etapa 1.1.9), se lava la columna con tampones de 1 - 3 a continuación para eliminar todas las proteínas excepto la His-MSP. Monitorear el contenido de proteína a 280 nm para seguir el proceso de purificación; la grabación UV a 280 nm debería volver a la línea de base después de cada lavado. <ol><li> Lavar con tampón de lavado 1: 40 mM Tris-HCl, NaCl 300 mM, imidazol 10 mM, y 1% de Triton, pH 8,0. </li><li> Se lava con tampón de lavado 2: 40 mM Tris-HCl, 300 mMNaCl, imidazol 20 mM, y colato de sodio 50 mM, pH 8,0. </li><li> Lavar con tampón de lavado 3: 40 mM Tris-HCl, NaCl 300 mM, e imidazol 50 mM, pH 8,0. </li></ol></li><li> Eluir la MSP con Tris-HCl 40 mM, NaCl 300 mM, e imidazol 500 mM, pH 8,0. </li><li> Cambiar el tampón a MSP tampón estándar (20 mM Tris-HCl, pH 7,5; NaCl 100 mM; y EDTA 0,5 mM) por filtración en gel 8, 35; el rendimiento por lotes debe estar alrededor de 7 mg L-1. </li></ol></li><li> Preparación de la solución madre de fosfolípidos <ol><li> Añadir 305 l de 1-palmitoil-2-oleoil- sn -glicero-3-fosfocolina (POPC) disuelto en cloroformo a una concentración de 25 mg / ml a un vaso de precipitados de vidrio y se evapora el cloroformo mediante purga con una corriente suave de nitrógeno . Se seca la noche a la mañana de lípidos en un desecador de vacío. NOTA: Este paso se realiza para eliminar el disolvente de la lípidos, lo que deja una película delgada de lípido en la parte inferior del vaso de precipitados de vidrio.</li><li> Resuspender el pastel de lípidos en 200 l de tampón estándar de MSP que contiene colato de sodio 100 mM por agitación del tubo hasta que la solución se vuelve transparente; esto proporcionará una solución con una concentración de 50 mM POPC. NOTA: En general, la relación molar de lípido a detergente en este punto debe ser de 1: 2 (lípido: detergente) 8. Esta mezcla de lípido-detergente puede ser almacenado a -80 ° C durante casi 2 meses. </li></ol></li><li> Preparación de perlas hidrófobas para la eliminación del detergente <ol><li> Colocar 5 g de perlas (peso seco) en un tubo de 50 ml. </li><li> Lavar las perlas con 30 ml de metanol al 100% y después con 40 ml de agua ultrapura. </li><li> Lavar las perlas con 10 ml de tampón estándar MSP. Por último, almacenar los granos con 15 ml de tampón estándar MSP a 4 ° C. </li></ol></li><li> reconstitución Nanodisc <ol><li> Prescindir de 190 l de MSP1E3D1 (0,124 mM) en un tubo de microcentrífuga y añadir 61,5 l de solución madre de fosfolípidos (50 mM POPC) al mismo tubo. Incubar la mezcla de la reconstitución en hielo durante 1 h. NOTA: Este es igual a una relación molar de 1: 130 (MSP1E3D1: POPC). </li><li> Añadir perlas hidrofóbicas a una concentración de 0,5 g de perlas por ml de mezcla de la reconstitución para iniciar el proceso de autoensamblaje. Incubar en una incubadora rotativa durante 16 horas a 4 ° C. </li><li> Después de la incubación, se centrifuga durante 10 min a 13.000 xg y 4 ° C para eliminar los precipitados y agregados. Se desecha el precipitado y guardar el sobrenadante. </li><li> Equilibrar la columna de cromatografía de exclusión por tamaño (montado en un sistema de cromatografía de líquidos automatizado) con tampón estándar MSP hasta que la absorbancia a 280 nm es estable. Inyectar el sobrenadante en la columna y recoger las fracciones pico. </li><li> Medir las concentraciones de nanodiscos en las fracciones de los picos a 280 nm. Utilice el coeficiente de extinción molar de MSP1E3D1 (varepsilon = 29,910 cm -1 M -1) para el cálculo de la concentración nanodisc. Nota lanúmero de lípidos por nanodisc se puede medir mediante una combinación de lípidos radiomarcados y análisis de fosfato de 4 o por análisis de fosfato solo. </li></ol></li></ol> 2. Preparación de la proteína monotópico 5-lipoxigenasa 35 <ol><li> Preparar un cultivo iniciador durante la noche. Suplemento 50 ml de medio LB con 100 mg / ml de ampicilina. Inocular el medio con E. coli BL21 (DE3) que contiene el plásmido del gen de la 5-lipoxigenasa (ALOX5). Diluir el cultivo iniciador durante la noche en medio de expresión que contiene 42 mM Na 2 HPO 4, 24 mM KH 2 PO 4, NaCl 9 mM, 19 mM NH 4 Cl, 1 mM MgSO 4, 0,1 mM CaCl 2, 0,2% de D-glucosa, 0,1 %, 5 M FeSO 4, y 100 g / ml ampicilina. Cultivar las células hasta que la DO 600 es ~ 0,5 a 25 ° C. Inducir la expresión de proteína con IPTG 0,2 mM durante 16 h a 20 ° C 35. </li><li> Cosecha por centrifugación durante 10 min a 7.000 xg y 4 ° C y descartar el sobrenadante. Pesar la pastilla que se encuentra en la parte inferior del tubo que contiene las células recogidas y resuspender las células recogidas en tampón de lisis (100 mM Tris-HCl, pH 8,0; NaCl 100 mM; 10% de glicerol, y TCEP 1 mM) que contenía inhibidor de proteasa y 0,5 mg / ml de lisozima 35 en una proporción de 2 ml de tampón de lisis por gramo de células. </li><li> Lisar las células por tratamiento con ultrasonidos durante 5 x 15 s en 80% de la amplitud. Eliminar los restos celulares por centrifugación durante 10 min a 7.000 xg y 4 ° C. Realizar la precipitación con sulfato de amonio al 30 - 60% de saturación para precipitar las proteínas en la solución 35. Centrifugar durante 15 minutos a 16.000 x g y 4 ° C. NOTA: El sedimento 5LO puede ser congelado y almacenado a -80 ° C durante un máximo de 6 meses con rapidez. </li><li> Resuspender el precipitado con 20 ml de tampón de lisis y se centrifuga durante 15 min a 40.000 xg y 4 ° C. </li><li> Incubar el sobrenadante en<html> una columna de agarosa ATP a 4 ° C durante 30 min. Lavar la columna una vez con una columna-volumen de tampón de lisis que contiene 0,5 M NaCl. Eluir la 5LO con ATP 20 mM en tampón de lisis que contiene 10 mM FeSO 4 y 20 mg / ml de catalasa. Se realiza una cromatografía de filtración en gel para eliminar el ATP 35. NOTA: El 5LO es inestable y debe usarse inmediatamente después de la purificación. De lo contrario, se recomienda para detener en la etapa de precipitación con sulfato de amonio (véase la nota después de la etapa 2.1.3). </li></ol> 3. Preparación del complejo Nanodisc-proteína <ol><li> Preparar un volumen total de 100 l de complejo. Mezclar 0,8 M ND y 0,8 M 5LO con el mM Ca 2 + 1 presente en el tampón estándar MSP (20 mM Tris-HCl, pH 7,5; NaCl 100 mM; EDTA 0,5 mM; y 1,5 mM CaCl 2) y se incuba durante 10 min sobre hielo. NOTA: La muestra se puede almacenar durante un máximo de un mes a 4 ° C 35. </li></ol>ove_title &quot;&gt; 4. El análisis de las muestras <ol><li> Electroforesis en gel <ol><li> Electroforesis no desnaturalizante <ol><li> Mezclar 15 l de la muestra con 5 l de tampón de carga (mM BisTris 50, HCl 6 N, NaCl 50 mM, 10% (w v) de glicerol /, y 0,001% Ponceau S, pH 7,2) 49 y cargarlo en un 4 - 16% Bis-Tris gel para llevar a cabo la electroforesis. </li><li> Llenar el depósito de cátodo con tampón de luz cátodo (Bis 50 mM Tris; mM tricina 50, pH 6,8, y 0,002% de Coomassie G-250) y el depósito de ánodo con tampón (50 mM Bis Tris y Tricina 50 mM, pH 6,8) que se ejecuta. Iniciar la separación mediante el uso de un voltaje constante a 150 V. </li><li> Detener la separación electroforética cuando el frente de Coomassie alcanza el final del gel. </li><li> Tinción del gel con un protocolo estándar de azul de Coomassie. </li></ol></li><li> electroforesis desnaturalizante <ol><li> Mezclar 40 l de la muestra con 10 l de tampón de carga que contiene SDS (0,05% (w / v) azul de bromofenol; M Tris-HCl 0,2,pH 6,8; 20% (v / v) de glicerol; 10% (w / v) SDS; y 10 mM 2-mercaptoetanol) y se carga en un 4 - gel glicina Tris 20% para llevar a cabo la electroforesis. </li><li> Llenar los depósitos de cátodo y ánodo con tampón de desarrollo (mM Tris-HCl, pH 6,8 25; glicina 200 mM; y 0,1% (w / v) SDS). Iniciar la separación mediante el uso de un voltaje constante a 150 V. </li><li> Detener la separación electroforética cuando el frente de la carga de colorante alcanza el final del gel. </li><li> Tinción del gel con un protocolo estándar de azul de Coomassie. </li></ol></li></ol></li><li> Preparación de la solución de NAPT <ol><li> Disolver 1 g de sal de fosfotungstato de sodio en 50 ml de agua por agitación a temperatura ambiente para dar un 2% (w / v) de solución ácida. </li><li> Ajustar el pH a 7,4 con NaOH 1 M. Eliminar las partículas utilizando un filtro de jeringa de 0,22 micras. Almacenar la solución a temperatura ambiente oa 4 ° C. </li></ol></li><li> Preparación de la muestra para el análisis TEM <ol><li> De descarga luminosa rejillas de cobre recubiertas de carbono (400 de malla) durante 20 s a 30 mA para rendir las rejillas hidrófilos antes de la adsorción de la muestra. Colocar 3,5 l de la muestra (0,8 M con respecto a los nanodiscos) en la parrilla y se incuba durante 30 s. NOTA: El volumen aplicado puede variar entre 2,5 y 5 l, dependiendo de la concentración de la muestra. Un intervalo de concentración adecuada para nanodiscos es de 0,5 - 1 mM. </li><li> Seque solución sobrante con papel de filtro. </li><li> Inmediatamente manchar la red con una gota de 2% NAPT durante 30 s. Seque el exceso de solución y dejar la red secar al aire. </li><li> Evaluar las rejillas de TEM. Un microscopio con 120-200 keV voltaje de aceleración es suficiente para estimar el grado de apilamiento. NOTA: Para el presente protocolo, se utilizó un microscopio electrónico de transmisión calibrada, equipado con un cañón de emisión de campo de 200 keV. </li><li> Grabar las imágenes de TEM. Para las imágenes que muestran pilas largas, no procesan aún más; imágenes muestran el complejo de nanodiscos, con la proteína extrínseca, que puede contener unos pocosshort stacks, pero la mayoría de las partículas están en el complejo. Memorizar varias imágenes y estos procesos de acuerdo con los métodos estándar para la obtención de clase medias y de baja resolución, 3 modelo dimensional del complejo. NOTA: Para la recogida de datos de tinción negativa, rejillas se hicieron por lo menos en tres días diferentes. Para cada día, se realizaron incubaciones de muestras frescas (como en el paso 3.1) antes de que se aplicó la tinción negativa. </li></ol></li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El método se puede separar en tres partes: la reconstitución de nanodiscos vacíos, la preparación de complejos de proteína-nanodisc, y de la tinción negativa para el TEM de estos complejos. Cada parte se trata de forma independiente con respecto a las limitaciones de la técnica, los pasos críticos, y las modificaciones útiles. La reconstitución de nanodiscos vacías. Los pasos críticos y limitaciones en la producción y uso de nanodiscos. Para la preparación de los na...

En la investigación médica, mucha atención se centra en proteínas de membrana, ya sea intrínsecos o extrínsecos, que participan en una variedad de interacciones de lípidos. Trabajando con proteínas lípidos interactuar incluye o bien la selección de un sustituto a los lípidos, tales como detergentes, amphipols 1, o proteínas pequeñas 2, o la búsqueda de un sustituto de la membrana que mantiene la proteína soluble y activa. Sustitutos de membrana lipoico incluyen liposomas y nanodiscos (ND) 3, 4. Nanodiscos son plataformas de membrana cerca de nativos desarrollados por la ingeniería de la parte proteica, ApoA-1, de la lipoproteína de alta densidad (HDL) de origen natural en la sangre. ApoA-1 es una cadena de 243 residuos de longitud de cortos alfa-hélices anfipáticas y tiene una conformación soluble en lípidos libres. In vitro cuando en la presencia de lípidos, dos copias de la proteína ApoA-1 reordenan espontáneamente para rodear la hidrporción de la cadena de acilo ophobic de un parche bicapa lipídica 5. versiones de ingeniería de ApoA-1 generalmente se llaman proteínas de andamiaje de membrana (MSP), y un número creciente están disponibles comercialmente como plásmidos o como proteínas purificadas. Repeticiones o deleciones de los alfa-hélices de la ApoA-1 resultado en andamios proteínas de membrana 7 6 más largos o más cortos. Esto a su vez hace que sea posible formar discos de alrededor de 6 nm 7-17 nm 8 de diámetro. Hay diferentes tipos de aplicaciones para el nanodiscos 3, 9. La aplicación más utilizada es el de proporcionar un entorno de membrana casi nativo para la estabilización de una proteína de membrana 8, previamente revisados 3, 9. Un uso menos explorada-es proporcionar una superficie de membrana nanoescala para el estudio demembrana periférica proteínas 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17. Sección 1 del protocolo a continuación visualiza el procedimiento para hacer nanodiscos compuestas de fosfolípidos y proteínas de andamiaje membrana. Preparación de la muestra es un cuello de botella en la mayoría de los métodos. muestras específicas del método pueden añadir información en particular, pero también hacer comparaciones de los resultados difícil. Por lo tanto, es más simple cuando las muestras son multimodal y se pueden utilizar directamente en varios métodos diferentes. Una de las ventajas con el uso de nanodiscos es el pequeño tamaño de la nanodisc en comparación con liposomas (por ejemplo, las muestras se pueden utilizar directamente para ambos TEM y electroforesis en gel no desnaturalizante, como en el presente Protocolo). <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Las vesículas y liposomas han sido utilizados para comprender la función de la membrana de proteínas que interactúan. Para los estudios estructurales y de visualización, un ejemplo de la determinación estructural de una proteína transmembrana en liposomas está disponible 18. Sin embargo, ninguna estructura 3D de alta resolución de una proteína de membrana monotópico incrustado en una membrana del liposoma se ha publicado todavía, en lo que sabemos. Nanopartículas o anticuerpos oro puede ser utilizado para visualizar las proteínas de unión a liposomas o vesículas utilizando TEM 19. A pesar de que estas sondas son muy específicos, que podrían interferir con las proteínas de unión a la membrana por el velo del sitio de unión de membrana o por áreas de interés con las partes flexibles de enmascaramiento. Marcado con oro o proteínas de anticuerpo complejado probablemente podría ser analizado en un gel, pero esto aumentaría el costo del experimento. Aunque los liposomas son una excelente plataforma, no se puede estar seguro de que el populación tiene una relación particular de proteína por liposoma, una característica que puede ser explorado por el uso de nanodiscos 20. En un liposoma, cofactores y sustratos pueden ser atrapados en el interior soluble. Las sustancias que son solubles en la membrana compartirán el mismo destino para ambos tipos de miméticos de membrana. Sin embargo, como la zona de dos capas es más pequeño en nanodiscos, se requiere una menor cantidad de sustancia para saturar las membranas nanodisc. función de las proteínas comprensión a través de la determinación de la estructura atómica ha sido esencial para muchos campos de investigación. Los métodos para la determinación de la estructura de proteínas incluyen rayos-X 21; resonancia magnética nuclear (NMR) 22, 23; y microscopía electrónica de transmisión (TEM) 24 a temperaturas criogénicas, cryoEM. La resolución por cryoEM últimamente se ha mejorado en gran medida, debido principalmente a la utilización de electrones de directadetectores 25, 26. Las macromoléculas son imágenes en, hielo vítreo delgada 27 en un estado casi nativo. Sin embargo, debido al bajo contraste de las moléculas biológicas, se convierten en difíciles de detectar en el rango de tamaño de 100 a 200 kDa. Para muestras de tamaño adecuado, la recogida de datos se puede realizar y el método de reconstrucción de partícula única se puede aplicar para obtener una estructura 28. Sin embargo, la determinación de la estructura de la proteína por TEM es un proceso de múltiples pasos. Por lo general comienza con la evaluación de monodispersividad muestra mediante tinción negativa TEM 29 utilizando sales de metales pesados como el phosphotungsten (PT) 30 31 o uranio. La reconstrucción de un modelo de baja resolución de la macromolécula con tinción negativa se hace generalmente y puede proporcionar información importante sobre la estructura molecular 29. En paralelo,Recopilación de datos mediante cryoEM puede comenzar. Se debe tener cuidado al evaluar los datos de TEM de tinción negativa para evitar la mala interpretación de formación de artefactos. Un artefacto en particular es el efecto de la mancha PT en fosfolípidos y liposomas 32, lo que resulta en la formación de varillas largas se asemejan a las pilas de monedas, vista desde el lado 33. Tal &quot;cartucho de dinero&quot; o &quot;pilas&quot; (de aquí en adelante designado como &quot;pilas&quot;) se observaron desde el principio para el HDL de 34 años, y más tarde también para nanodiscos 35. El apilamiento y la reorganización de las membranas pueden ocurrir por muchas razones. Por ejemplo, puede ser inducida por co-factores como el cobre, que se muestran por imágenes TEM en una mancha de molibdato de amonio 36. Una fracción de los lípidos de membrana en liposomas contenía un grupo de cabeza de ácido iminodiacético imitando la formación de complejos de metal por EDTA, apilando de este modo los liposomas después de la adición de iones de cobre <shasta class = &quot;xref&quot;&gt; 36. Stacking también podría ser debido a una interacción proteína-proteína por una proteína en o sobre las bicapas lipídicas (la mancha utilizado no se menciona) 37. Se observó temprano en la formación de pila de fosfolípidos por PT; Sin embargo, el trabajo posterior se ha centrado en la eliminación o supresión de esta formación artefacto 38. En este caso, se propone un método para tomar ventaja de la nanodisc inducida por NAPT apilamiento para el estudio de las proteínas de unión a la membrana por TEM. En resumen, la unión de las proteínas nanodiscos impediría que los nanodiscos de apilamiento. Aunque las razones para el apilamiento no son claros, se propuso 39 que hay una interacción electrostática entre los fosfolípidos y el grupo fosforilo de PT, haciendo que los discos a pegarse entre sí (Figura 1A). La hipótesis detrás de nuestro protocolo es que cuando una proteína se une a una nanodisc, la mayor parte de la superficie de fosfolípido no es availa<html> ble para la interacción con el PT debido a impedimento estérico por la proteína. Esto evitaría la formación de la pila (Figura 1B). Dos conclusiones pueden extraerse. En primer lugar, la prevención de apilamiento significa que la proteína de interés se ha unido a la membrana. En segundo lugar, el complejo proteína-ND se puede tratar con los métodos de procesamiento de una sola partícula estándar 24, 40 para obtener una morfología rugosa del complejo. Por otra parte, los análisis mediante métodos como la electroforesis en gel no desnaturalizante o dispersión de luz dinámica se puede realizar. Para demostrar esta hipótesis, se utilizó la proteína de unión a membrana de 5-lipoxigenasa (5LO), que está implicado en muchas enfermedades inflamatorias 41, 42. Esta proteína de 78 kDa requiere iones de calcio para unirse a su membrana 43. Aunque esta asociación a la membrana se ha estudiado ampliamente el uso de liposomass = &quot;xref&quot;&gt; 44, 45, 46 y las fracciones de membrana 47, éstas no se pueden utilizar para el análisis de TEM y determinación de la estructura. La preparación de nanodiscos comienza mezclando MSP con lípidos se resuspendieron en el colato de sodio detergente. Después de la incubación en hielo durante 1 h, el detergente se retira lentamente de la mezcla de la reconstitución utilizando una resina adsorbente. Este tipo de material se hizo con frecuencia de forma en pequeñas perlas de poliestireno. Son relativamente hidrófobo y tienen una fuerte preferencia por la unión de detergente en comparación con los lípidos 48. Después de retirar las perlas hidrófobas y la realización de la clarificación mediante centrifugación, las nanodiscos se purifican por cromatografía de exclusión de tamaño (SEC). Los nanodiscos purificados se mezclaron con una proteína de membrana monotópico (y posibles cofactores) en una relación equimolar (o varias relaciones de valoración) y se dejan a react (15 min). El análisis por TEM se lleva a cabo mediante la aplicación de mu L-cantidades de muestra sobre, rejillas revestidas de carbono resplandor descargada y luego mediante la realización de tinción negativa con NAPT. La misma muestra de cuando las alícuotas se aplicaron a las rejillas TEM se puede utilizar para el análisis por no desnaturalizante o PAGE SDS-electroforesis en gel, así como por varios tipos de mediciones de la actividad, sin cambios importantes.

<table><tbody><tr><td>Microscopio electrónico de transmisión: JEOL2100F</td> cámara CCD <td>JEOL</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Tiez Video and Imaging Processing System GmbH, Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Descargador de luminiscencia</td><td>Baltec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rejilla TEM: malla 400</td><td>TAAB</td><td>GM016/C</td><td></td></tr><tr><td>Cromatografía de exclusión por tamaño: Agilent SEC-5</td><td>Agilent Technologies</td><td>5190-2526</td><td></td></tr><tr><td>Superdex 200 HR 10/300</td><td>GE Healthcare Ciencias de la Vida</td><td>17-5172-01</td><td></td></tr><tr><td>Plásmido: MSP1E3D1</td><td>Addgene</td><td>20066</td><td></td></tr><tr><td>Bacterias: BL21DE3</td><td>NEB</td><td>C2527H</td><td></td></tr><tr><td>Bacterias: BL21 (DE3) T1R pRARE2</td><td>Protein Science Facility, KI, Solna</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matriz de purificación: ATP agarosa</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2767</td><td></td></tr><tr><td>Matriz de purificación: HisTrap HP-5 mL</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-5247-01</td><td></td></tr><tr><td>Lípido:</td><td>Lípidos polares POPC Avanti</td><td>850457C</td><td>25 mg/mL en cloroformo</td></tr><tr><td>Perlas hidrofóbicas: Bio-Beads, Resina SM-2</td><td>Bio-Rad</td><td>1523920</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de jeringa de 13 mm: 0,2 &mu; m</td><td>Pall ciencias de la vida PN</td><td>4554T</td><td></td></tr><tr><td>Tinción: Fosfotungstato de sodio hidrato tribásico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>31648</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoetanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3148-250ML</td><td></td></tr><tr><td>Dodecil Sulfato de sodio (SDS)</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0301</td><td></td></tr><tr><td>Cóctel de inhibidores de proteasa</td><td>Sigma Aldrich</td><td>4693132001</td><td></td></tr><tr><td>TCEP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>646547</td><td></td></tr><tr><td>Detergente: Hidrato de colato de sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C6445-10G</td><td></td></tr><tr><td>Colato</td><td></td><td></td> de sodio <td>500 mM Colato de sodio. Vuelva a suspender en agua miliQ y almacene a -20 ° C.</td></tr><tr>Stock <td></td><td></td> de <td>lípidos</td><td>50 mM POPC, 100 mM de colato de sodio, 20 mM de Tris-HCl pH 7.5, 100 mM de NaCl. <bt />Almacenar a 4 & grados; C durante una semana; o Tienda -80 &deg; C durante un mes, después de purgar la solución con nitrógeno.</td></tr><tr><td>Tampón</td><td></td><td></td> estándar MSP <td>20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl, 0,5 mM EDTA. Almacenar a 4 &deg;C.</td></tr><tr><td>Tampón de ánodo de electroforesis no desnaturalizante</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BN2001</td><td>50 mM Bis-Tris, 50 mM Tricina, pH 6.8</td></tr><tr><td>Tampón de cátodo de electroforesis no desnaturalizante</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BN2002</td><td>50 mM Bis-Tris, 50 mM Tricine, pH 6.8, 0.002% Coomassie G-250</td></tr><tr><td>Electroforesis no desnaturalizante 4x Tampón de carga de muestras</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BN2003</td><td>50 mM Bis-Tris, pH 7,2, 6 N HCl, 50 mM de NaCl, 10% (p/v) de glicerol, 0,001%</td></tr><tr>Tampón <td></td><td></td> de<td>ejecución de electroforesis desnaturalizante</td> Ponceau S <td>Receta interna: 25 mM de Tris-HCl, pH 6,8, 200 mM de glicina, 0,1% (p/v) SDS</td></tr><tr><td>Electroforesis desnaturalizante 5x Tampón de carga de muestras Receta</td><td></td><td></td><td>interna: 0,05% (p/v) de Bromofenolazul, 0,2 M de Tris-HCl, pH 6,8, 20% (v/v) glicerol, SDS al 10% (p/v), 10 mM de 2-mercaptoetanol</td></tr><tr><td>Caldo</td><td></td><td></td> fantástico <td>Triptona - 12,0 g, Extracto de levadura - 24,0 g, 100 mL 0,17 M KH2PO4 y 0,72 M K2HPO4, Glicerol - 4 mL. Triptona, extracto de levadura y glicerol se prepararon a 900 mL y se esterilizaron en autoclave por separado. KH2PO4 y K2HPO4 se prepararon y esterilizaron en autoclave por separado. Ambos se mezclaron antes de usar el medio.</td></tr></tbody></table>

método para visualizar y analizar de membrana interactuando proteínas por microscopía electrónica de transmisión

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

Las proteínas monotópicas ejercen su función cuando se unen a una superficie de membrana, y tales interacciones dependen de la composición lipídica específica y de la disponibilidad de suficiente área para realizar la función. Los nanodiscos se utilizan para proporcionar una superficie de membrana de tamaño y contenido de lípidos controlados. En ausencia de proteínas extrínsecas unidas, los nanodiscos teñidos con fosfotungstato de sodio aparecen como pilas de monedas cuando se ven de lado mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM). Por lo tanto, este protocolo está diseñado para promover intencionalmente el apilamiento; En consecuencia, la prevención del apilamiento puede interpretarse como la unión de la proteína de unión a la membrana al nanodisco. En un paso más allá, las imágenes TEM de los complejos proteína-nanodisco se pueden procesar con métodos estándar de una sola partícula para producir estructuras de baja resolución como base para el trabajo de crioEM de mayor resolución. Además, los nanodiscos proporcionan muestras adecuadas para la electroforesis TEM o en gel no desnaturalizante. Para ilustrar el método, se presenta la unión inducida por Ca2+ de la 5-lipoxigenasa en nanodiscos.

El método que proponemos depende de la preparación de nanodiscos para proporcionar la superficie de la membrana para la unión monotópico membrana-proteína. Como no existe una proteína transmembrana incrustado en la bicapa lipídica nanodisc, los nanodiscos están aquí denotan como &quot;nanodiscos vacías&quot; (Figura 2A). Estos tienen un peso molecular calculado de 256 kDa para una composición de dos proteínas MSP1E3D1 andamios y alrededor de 260 moléculas de POPC <sup cl...

Muchas proteínas realizan su función cuando se unen a las superficies de las membranas. La unión de proteínas extrínsecas en membranas de nanodiscos se puede obtener indirectamente mediante microscopía electrónica de transmisión. Demostramos que el apilamiento característico (rouleau) de los nanodiscos inducido por la tinción negativa de fosfotungstato de sodio se previene mediante la unión de proteínas extrínsecas.

Método para visualizar y analizar de membrana Interactuando Proteínas por Microscopía Electrónica de Transmisión

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

El objetivo general de este procedimiento es visualizar la unión de una proteína de membrana extrínseca sobre la superficie de una membrana en nanodisco mediante microscopía electrónica de transmisión con tinción negativa, como un primer paso hacia la determinación de la estructura de alta resolución de la proteína. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en varios campos de investigación, ya que aborda actividades proteicas que ocurren en y sobre membranas celulares. La principal ventaja de esta técnica es la formación característica de estructuras apiladas en los nanodiscos cuando la proteína no puede unirse a las membranas.Estas pilas son claramente visibles mediante microscopía electrónica de transmisión. La implicación de esta técnica se extiende hacia el desarrollo de fármacos, ya que los compuestos pueden cribarse fácilmente para evaluar su capacidad de bloquear o permitir las interacciones de proteínas de membrana. Aunque este método puede proporcionar información sobre las condiciones óptimas para la unión de proteínas monotópicas a su membrana, también ofrece una estructura de baja resolución del complejo de proteína en nanodiscos.Para comenzar el procedimiento, exprese y purifique la proteína de soporte de membrana, como MSP1E3D1. A continuación, utilizando una jeringa de vidrio con una aguja de metal, dispense 305 microlitros de 25 miligramos por mililitro de POPC en cloroformo en un matraz redondo de vidrio. Evapore el cloroformo bajo un flujo suave de gas nitrógeno en una campana extractora.Seque los lípidos restantes durante la noche en un desecador al vacío. Luego, disuelva la pastilla de lípido seca en 200 microlitros de tampón estándar MSP enriquecido con 100 milimolares de colato de sodio como detergente. Agite la mezcla mediante vortex hasta que quede transparente para obtener una suspensión de 50 milimolares de POPC en tampón.A continuación, lave cinco gramos de perlas hidrófobas con 30 mililitros de metanol al 100 %, luego con 40 mililitros de agua ultrapura y finalmente con 10 mililitros de tampón estándar MSP. Almacene las perlas en 15 mililitros de tampón estándar a cuatro grados Celsius. Luego, combine 190 microlitros de una solución 0,124 milimolar de MSP1E3D1 y 61,5 microlitros de una suspensión 50 milimolar de POPC en tampón, obteniendo una relación molar de uno a 130 de MSP respecto a POPC y una concentración de colato de sodio de 25 milimolar.La proporción ideal de lípido por MSP varía según cada elección de tipo de lípido y MSP, y debe optimizarse para obtener una preparación homogénea de nanodiscos. Incube la mezcla en hielo húmedo durante una hora. Luego, agregue la solución a un tubo que contenga 0,5 gramos de granos hidrofóbicos lavados por mililitro de mezcla de reconstitución para iniciar el ensamblaje espontáneo de los nanodiscos.Incube la mezcla a cuatro grados Celsius durante 16 horas a siete u ocho rotaciones por minuto. Después de la incubación, permita que los perlas sedimenten por gravedad. Retire y almacene el sobrenadante a cuatro grados Celsius hasta que esté listo para realizar la cromatografía de exclusión por tamaño.Antes de la cromatografía de exclusión por tamaño, centrifugue la mezcla a 13.000 g durante 10 minutos a cuatro grados Celsius. Decante el sobrenadante y deseche el sedimento. Equilibre una columna de cromatografía de exclusión por tamaño con tampón estándar MSP hasta que la línea base a 280 nanómetros sea estable.Inyecte el sobrenadante en la columna y recoja el producto en fracciones de 0,5 mililitros. Mida la absorbancia de las fracciones a 280 nanómetros con un espectrofotómetro UV-vis. Calcule la concentración de nanodiscos utilizando el coeficiente de extinción molar para la MSP elegida.Para realizar la electroforesis en gel no desnaturalizante, primero mezcle 15 microlitros de la muestra con cinco microlitros del tampón de carga adecuado. Llene el tanque catódico con tampón catódico claro y el tanque anódico con tampón de corrida. Cargue la muestra en un gel Bis-Tris del 4 al 16 % y comience la corrida.Tiña el gel según las instrucciones del fabricante del gel. Para comenzar la preparación de un complejo de proteína monotópica en nanodiscos con cinco lipoxigenasa como proteína, prepare un lote de tampón estándar MSP enriquecido con cloruro de calcio 1,5 milimolar. Exprese y purifique la proteína 5LO.Prepare inmediatamente una mezcla de 100 microlitros de 0,8 micromolar de 5LO y 0,8 micromolar de nanodiscos en tampón estándar MSP enriquecido con calcio. Nuestro ejemplo de una proteína monótopa, la cinco lipooxigenasa, depende de las cantidades de calcio para unirse a la membrana. La 5LO es altamente sensible y debe usarse dentro de unas pocas horas posteriores a su preparación.Incube la mezcla en hielo durante 10 minutos. Almacene la muestra resultante del complejo proteico de nanodiscos a cuatro grados Celsius durante hasta un mes. Para comenzar la preparación para el análisis de TEM, disuelva un gramo de sal de sodio de fosfotungstato en 50 mililitros de agua ultrapura a temperatura ambiente.Ajuste el pH de la solución a 7,4 con una solución unimolar de hidróxido de sodio. Filtre la solución de fosfotungstato de sodio a través de un filtro de jeringa de 0,22 micrómetros y almacene la solución a temperatura ambiente. A continuación, realice una descarga luminiscente en una rejilla de cobre recubierta de carbono de 400 mallas durante 20 segundos a 30 miliamperios para hacer la superficie de la rejilla hidrofílica.Coloque entre 2,5 y cinco microlitros de la muestra del complejo proteico monotópico en nanodiscos sobre la rejilla y deje que la muestra repose durante 30 segundos. Luego, use papel de filtro para eliminar el exceso de solución de la rejilla. Aplique inmediatamente una gota de solución de fosfotungstato de sodio y deje que la solución repose durante 30 segundos.Elimine la solución en exceso y deje secar la rejilla al aire. Realice microscopía electrónica de transmisión con un voltaje acelerado de 120 a 200 kilovoltios. Excluya imágenes que muestren pilas largas del procesamiento posterior de imágenes.Para las imágenes seleccionadas, utilice métodos estándar de procesamiento para determinar los promedios de clase y generar un modelo tridimensional de baja resolución de la proteína monotópica en nanodiscos. Mediante este método, se prepararon nanodiscos vacíos con una relación de uno a 130 de proteínas de andamiaje de membrana respecto a lípidos. Únicamente se observó un pico principal durante la cromatografía de exclusión por tamaño y una sola banda en la electroforesis nativa azul.Cuando los nanodiscos vacíos se tratan con una solución de sal de sodio de fosfotungstato, se induce la formación de pilas. Estas pilas largas pueden observarse entonces mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM). Esta formación de pilas no se interrumpió por la inclusión de iones de calcio en la solución de nanodiscos antes de la aplicación de la solución de fosfotungstato de sodio.Cuando una proteína monotópica como la 5-lipoxigenasa se une a la superficie del nanodisco, el apilamiento se ve obstaculizado por la impedimenta estérica causada por la proteína. Ambos lados del nanodisco están disponibles para la unión, lo que permite la formación de complejos de nanodiscos con 5-LO en proporciones de uno a uno y dos a uno. La muestra de complejos de nanodiscos con 5-LO en proporción dos a uno mostró menos apilamiento que la muestra uno a uno.La unión de 5LO requiere la presencia de iones de calcio. Esto se confirmó mediante la observación de apilamiento en una mezcla de 5LO y nanodiscos sin calcio, lo que indicó que 5LO no se había unido a las superficies de la membrana. Una vez que la proteína monotópica y los nanodiscos están preparados, la evaluación de la unión de la proteína a su membrana puede realizarse en una tarde, siempre que se realice adecuadamente.Al intentar este procedimiento, es importante estimar el área de la proteína en el nanodisco para elegir la longitud correcta de MSP. Para tamaños bien compatibles, como máximo dos proteínas extrínsecas pueden unirse, una en cada lado del disco. También es importante utilizar la sal sódica de fosfotungsteno para el contraste negativo, para garantizar una apilamiento máximo, ya que la unión se confirma mediante la comparación de la ausencia de apilamientos con los largos apilamientos de una muestra sin una proteína monotópica.El uso de nanodiscos en lugar de liposomas permite emplear la dispersión dinámica de luz y la dispersión de rayos X de ángulo pequeño para responder preguntas adicionales sobre la homogeneidad, el tamaño de la muestra o la estructura molecular. La estructura tridimensional de baja resolución de una proteína de membrana monotópica unida a un nanodisco podría ser un primer paso fácilmente accesible en el camino hacia la estructura de alta resolución de esas proteínas ligadas.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

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