Método para visualizar y analizar de membrana Interactuando Proteínas por Microscopía Electrónica de Transmisión

El objetivo general de este procedimiento es visualizar la unión de una proteína de membrana extrínseca en la superficie de una membrana de nanodisco mediante microscopía electrónica de transmisión de tinción negativa como primer paso hacia la determinación de la estructura de alta resolución de la proteína. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en varios campos de investigación en lo que respecta a las actividades de las proteínas que ocurren dentro y sobre las membranas celulares. La principal ventaja de esta técnica son las características pilas de formas de nanodiscos si la proteína no puede unirse a las membranas.

Estas pilas son claramente visibles por microscopía electrónica de transmisión. La implicación de esta técnica se extiende hacia el desarrollo de fármacos, ya que los compuestos pueden ser fácilmente cribados por su capacidad para bloquear o permitir las interacciones de las proteínas de membrana. Aunque este método puede proporcionar información sobre las condiciones óptimas para la unión de proteínas monotópicas a la membrana, también proporciona una estructura de baja resolución del complejo de nanodiscos de proteínas.

Para comenzar el procedimiento, exprima y purifique la proteína del andamiaje de membrana, como MSP1E3D1. A continuación, utilizando una jeringa de vidrio con una aguja de metal, dispense 305 microlitros de 25 miligramos por mililitro de COPC en cloroformo en un matraz de vidrio de fondo redondo. Evapore el cloroformo bajo un suave chorro de gas nitrógeno en una campana extractora.

Seque el lípido restante durante la noche en un desecador al vacío. A continuación, disuelva la torta de lípidos seca en 200 microlitros de tampón estándar MSP enriquecido con colato de sodio de 100 milimolares como detergente. Agitar la mezcla hasta que esté transparente para obtener una suspensión de 50 milimolares de POPC en tampón.

A continuación, lavar cinco gramos de perlas hidrofóbicas con 30 mililitros de metanol al 100%, luego con 40 mililitros de agua ultrapura y, finalmente, con 10 mililitros de tampón estándar MSP. Guarde las perlas a menos de 15 mililitros de tampón estándar a cuatro grados centígrados. A continuación, combine 190 microlitros de una solución de 0,124 milimolares de MSP1E3D1 y 61,5 microlitros de una suspensión de 50 milimolares de POPC en tampón, lo que da como resultado una proporción de uno a 130 molares de MSP a POPC y una concentración de colato de sodio de 25 milimolares.

La proporción ideal de lípidos por MSP varía con cada elección de tipo de lípido y lente de MSP y debe optimizarse para obtener una preparación homogénea de nanodiscos. Incuba la mezcla en hielo húmedo durante una hora. A continuación, añada la solución a un tubo que contenga 0,5 gramos de frijoles hidrofóbicos lavados por mililitro de mezcla de reconstitución para iniciar el autoensamblaje del nanodisco.

Incubar la mezcla a cuatro grados centígrados durante 16 horas a siete u ocho rotaciones por minuto. Después de la incubación, deje que las perlas se asienten por gravedad. Retire y guarde el sobrenadante a cuatro grados centígrados hasta que esté listo para realizar la cromatografía de exclusión por tamaño.

Antes de la cromatografía de exclusión por tamaño, centrifugar la mezcla a 13.000 g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Decantar el sobrenadante y desechar el pellet. Equilibre una columna de cromatografía de exclusión por tamaño con tampón estándar MSP hasta que la línea de base a 280 nanómetros sea estable.

Inyectar el sobrenadante en la columna y recoger el producto en fracciones de 0,5 mililitros. Mida la absorbancia de las fracciones a 280 nanómetros con un espectrofotómetro UV vis. Calcule la concentración de nanodiscos utilizando el coeficiente de extinción molar para el MSP elegido.

Para realizar una electroforesis en gel no desnaturalizante, primero mezcle 15 microlitros de la muestra con cinco microlitros del tampón de carga adecuado. Llene el tanque de cátodo con tampón de cátodo ligero y el tanque de ánodo con tampón de funcionamiento. Cargue la muestra en un gel de 4 a 16%Bis-Tris y comience la ejecución.

Tiñe el gel según las instrucciones del fabricante del gel. Para comenzar la preparación de un complejo proteico monotópico de nanodisco con cinco lipoxigenasas como proteína, prepare un lote de tampón estándar MSP enriquecido con cloruro de calcio de 1,5 milimolares. Expresa y purifica la proteína 5LO.

Prepare inmediatamente una mezcla de 100 microlitros de 0,8 micromolares 5LO y 0,8 micromolares nanodiscos en tampón estándar MSP enriquecido con calcio. Nuestro ejemplo de una proteinasa monotópica, cinco lipoxigenasas, depende de las cantidades de calcio para unirse a la membrana. 5LO es altamente sensible y debe usarse a las pocas horas de su preparación.

Incuba la mezcla en hielo durante 10 minutos. Almacene la muestra resultante del complejo proteico nanodisco a cuatro grados centígrados durante un máximo de un mes. Para comenzar la preparación para el análisis TEM, disuelva un gramo de sal sódica de fosfotungstato en 50 mililitros de agua ultrapura a temperatura ambiente.

Ajuste el pH de la solución a 7,4 con una solución molar de hidróxido de sodio. Filtre la solución de fosfotungstato de sodio a través de un filtro de jeringa de 0,22 micrómetros y almacene la solución a temperatura ambiente. A continuación, descargue la luz de la rejilla de cobre recubierta de carbono de malla 400 durante 20 segundos a 30 miliamperios para hacer que la superficie de la rejilla sea hidrófila.

Coloque entre 2,5 y cinco microlitros de la muestra del complejo de proteínas monotópicas nanodisc en la rejilla y deje reposar la muestra durante 30 segundos. Luego use papel de filtro para secar el exceso de solución de la rejilla. Aplique inmediatamente una gota de solución de fosfotungstato de sodio y deje reposar la solución durante 30 segundos.

Seque el exceso de solución y deje que la rejilla se seque al aire. Realizar microscopía electrónica de transmisión con un voltaje acelerado de 120 a 200 kilovoltios. Excluya las imágenes que muestren pilas largas del procesamiento de imágenes posterior.

Para las imágenes seleccionadas, utilice métodos de procesamiento estándar para determinar los promedios de clase y generar un modelo 3D de baja resolución de la proteína monotópica del nanodisco. Usando este método, se prepararon nanodiscos vacíos con una proporción de uno a 130 de proteínas de andamiaje de membrana a lípidos. Solo se observó un pico importante durante la cromatografía de exclusión por tamaño y solo se observó una banda en la electroforesis en gel nativo azul.

Cuando los nanodiscos vacíos se tratan con una solución de sal de sodio de fosfotungstato, se induce el apilamiento. Estas pilas largas pueden ser observadas por TEM. Este apilamiento no se vio interrumpido por la inclusión de iones de calcio en la solución de nanodisco antes de la aplicación de la solución de fosfotungstato de sodio.

Cuando una proteína monotópica, como la cinco lipoxigenasa, se une a la superficie del nanodisco, el apilamiento se ve obstaculizado por la obstrucción esteárica de la proteína. Ambos lados del nanodisco están disponibles para la unión, lo que permite la formación de complejos de nanodiscos 5LO de uno a uno y de dos a uno. La muestra de dos a un complejo de nanodiscos 5LO exhibió menos apilamiento que la muestra uno a uno.

La unión de 5LO requiere la presencia de iones de calcio. Esto fue confirmado por la observación del apilamiento en una mezcla de 5LO y nanodiscos sin calcio, lo que indicó que el 5LO no se había unido a las superficies de la membrana. Una vez que la proteína monotópica y los nanodiscos están preparados, la evaluación de la unión de la proteína a su membrana se puede realizar en una tarde si se realiza correctamente.

Al intentar este procedimiento, es importante estimar el área de la proteína en el nanodisco para elegir la longitud correcta de MSP. Para tamaños bien adaptados, como máximo dos proteínas extrínsecas pueden unirse una a cada lado del disco. También es importante que la sal sódica del fosofotungsteno se utilice para el soporte negativo para garantizar el máximo apilamiento, ya que la unión se confirma mediante la comparación de la ausencia de pilas con las pilas largas de una muestra sin una proteína monotópica.

El uso de los nanodiscos en lugar de los liposomas permite el uso de la dispersión dinámica de la luz, la dispersión de rayos X de ángulo pequeño para responder a preguntas adicionales sobre la homogeneidad de la muestra, el tamaño o la estructura molecular. La estructura 3D de baja resolución de una proteína de membrana monotópica unida a un nanodisco podría ser un primer paso fácilmente accesible en el camino hacia la estructura de alta resolución de esas proteínas unidas.