Name: Análisis de supercomplexes de la cadena de transporte de electrones mitocondriales con electroforesis nativa, ensayos en gel y electroelución (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Aprende a analizar supercomplejos de la cadena de transporte de electrones mitocondriales mediante electroforesis nativa, ensayos en gel y electroelución. Este método preserva la integridad funcional de los complejos para estudiar su ensamblaje y dinámica bioenergética.

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Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Fundación de la American Heart Association Afiliado [12GRNT12060233] y el Centro de Investigación de Niños fuertes de la Universidad de Rochester.

<ol><li>Lenaz, G., Genova, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supramolecular+organisation+of+the+mitochondrial+respiratory+chain%3A+a+new+challenge+for+the+mechanism+and+control+of+oxidative+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Supramolecular organisation of the mitochondrial respiratory chain: a new challenge for the mechanism and control of oxidative phosphorylation.</a> Adv Exp Med Biol. 748, 107-144 (2012).</li>
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<li>Strauss, M., Hofhaus, G., Schroder, R. R., Kuhlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dimer+ribbons+of+ATP+synthase+shape+the+inner+mitochondrial+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Dimer ribbons of ATP synthase shape the inner mitochondrial membrane.</a> EMBO J. 27 (7), 1154-1160 (2008).</li>
<li>Beutner, G., Eliseev, R. A., Porter, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+of+electron+transport+chain+activity+in+the+embryonic+heart+coincides+with+the+activation+of+mitochondrial+complex+1+and+the+formation+of+supercomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Initiation of electron transport chain activity in the embryonic heart coincides with the activation of mitochondrial complex 1 and the formation of supercomplexes.</a> PloS one. 9 (11), e113330(2014).</li>
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<li>Rosca, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+mitochondria+in+heart+failure%3A+decrease+in+respirasomes+and+oxidative+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Cardiac mitochondria in heart failure: decrease in respirasomes and oxidative phosphorylation.</a> Cardiovasc Res. 80 (1), 30-39 (2008).</li>
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<li>Acin-Perez, R., Fernandez-Silva, P., Peleato, M. L., Perez-Martos, A., Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19026783">Respiratory active mitochondrial supercomplexes.</a> Molecular cell. 32 (4), 529-539 (2008).</li>
<li>Dudkina, N. V., Eubel, H., Keegstra, W., Boekema, E. J., Braun, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+a+mitochondrial+supercomplex+formed+by+respiratory-chain+complexes+I+and+III%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Structure of a mitochondrial supercomplex formed by respiratory-chain complexes I and III.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 102 (9), 3225-3229 (2005).</li>
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<li>Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue-native+gels+to+isolate+protein+complexes+from+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Blue-native gels to isolate protein complexes from mitochondria.</a> Methods Cell Biol. 65, 231-244 (2001).</li>
<li>Althoff, T., Mills, D. J., Popot, J. L., Kuhlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arrangement+of+electron+transport+chain+components+in+bovine+mitochondrial+supercomplex+I1III2IV1%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Arrangement of electron transport chain components in bovine mitochondrial supercomplex I1III2IV1.</a> EMBO J. 30 (22), 4652-4664 (2011).</li>
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<li>Wittig, I., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supramolecular+organization+of+ATP+synthase+and+respiratory+chain+in+mitochondrial+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Supramolecular organization of ATP synthase and respiratory chain in mitochondrial membranes.</a> Biochim Biophys Acta. 1787 (6), 672-680 (2009).</li>
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<li>Antonioli, P., Bachi, A., Fasoli, E., Righetti, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+removal+of+DNA+from+proteomic+samples+prior+to+two-dimensional+map+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+A%22%5BJournal%5D)">Efficient removal of DNA from proteomic samples prior to two-dimensional map analysis.</a> J Chromatogr A. 1216 (17), 3606-3612 (2009).</li>
<li>Wittig, I., Carrozzo, R., Santorelli, F. M., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+assays+in+high-resolution+clear+native+gels+to+quantify+mitochondrial+complexes+in+human+biopsies+and+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Functional assays in high-resolution clear native gels to quantify mitochondrial complexes in human biopsies and cell lines.</a> Electrophoresis. 28 (21), 3811-3820 (2007).</li>
<li>Glancy, B., Balaban, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+composition+and+function+of+red+and+white+skeletal+muscle+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Protein composition and function of red and white skeletal muscle mitochondria.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 300 (6), C1280-C1290 (2011).</li>
<li>Wittig, I., Beckhaus, T., Wumaier, Z., Karas, M., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+estimation+of+native+proteins+by+blue+native+electrophoresis%3A+principles+and+practical+hints%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Mass estimation of native proteins by blue native electrophoresis: principles and practical hints.</a> Mol Cell Proteomics. 9 (10), 2149-2161 (2010).</li>
<li>Alavian, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+uncoupling+channel+within+the+c-subunit+ring+of+the+F1FO+ATP+synthase+is+the+mitochondrial+permeability+transition+pore%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">An uncoupling channel within the c-subunit ring of the F1FO ATP synthase is the mitochondrial permeability transition pore.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 111 (29), 10580-10585 (2014).</li>
<li>Chance, B., Williams, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+enzymes+in+oxidative+phosphorylation.+IV.+The+respiratory+chain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. IV. The respiratory chain.</a> J Biol Chem. 217 (1), 429-438 (1955).</li>
<li>Zickermann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+biology.+Mechanistic+insight+from+the+crystal+structure+of+mitochondrial+complex+I%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structural biology. Mechanistic insight from the crystal structure of mitochondrial complex I.</a> Science. 347 (6217), 44-49 (2015).</li>
<li>Zhu, J., Vinothkumar, K. R., Hirst, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+mammalian+respiratory+complex+I%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of mammalian respiratory complex I.</a> Nature. 536 (7616), 354-358 (2016).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Un ETC funcional es necesario para la generación de ATP mitocondrial. Los complejos del ETC son capaces de formar dos tipos de supercomplejos: los respirasomes (Cx-I, -III, y -IV) 1 y los sintomas (Cx-V) 2 . El montaje de cada complejo es necesario para un ETC intacto, mientras que la organización de la ETC en supercomplexes se cree que aumentar la eficiencia global ETC [ 5 , 22] . No se conocen bien cómo se montan...

La energía mitocondrial en forma de ATP no sólo es esencial para la supervivencia celular, sino también para la regulación de la muerte celular. La generación de ATP por fosforilación oxidativa requiere una cadena funcional de transporte de electrones (ETC, Cx-I a IV) y ATP sintasa mitocondrial (Cx-V). Estudios recientes han demostrado que estos grandes complejos de proteínas están organizados en supercomplejos, llamados respirasomes y synthasomes 1 , 2 . Es difícil analizar la asamblea, la dinámica y la regulación de la actividad de estos complejos y supercomplejos masivos. Mientras que las mediciones del consumo de oxígeno tomadas con un electrodo de oxígeno y los ensayos enzimáticos llevados a cabo utilizando un espectrofotómetro pueden proporcionar información valiosa sobre la actividad compleja de ETC, estos ensayos no pueden proporcionar información con respecto a la presencia, tamaño y composición de subunidades del complejo proteico o supercomplejos implicados. Sin embargo, el desarrollo de azul y claro nativo (BN y CN, respectivamente) PAGE 3 ha creado una potente herramienta para revelar información importante sobre la composición compleja y el montaje / desmontaje y sobre la regulación dinámica de la organización supramolecular de estos complejos respiratorios vitales en condiciones fisiológicas y patológicas 4 . El montaje de estos complejos en supercomplejos de orden superior parece regular la estructura y función mitocondrial 5 . Por ejemplo, el montaje respirasome aumenta la eficiencia de la transferencia de electrones y la generación de la fuerza motriz del protón a través de la membrana interna mitocondrial 5 . Además, el montaje de los sintomas no sólo aumenta la eficiencia de la producción de ATP y la transferencia de equivalentes de energía al citoplasma 2 , sino que también moldea la membrana interna mitocondrial en las crestas tubulares 6 ,/ Sup&gt; 7 . Estudios de montaje supercompleto durante el desarrollo cardíaco en embriones de ratón muestran que la generación de Cx-I que contienen supercomplejos en el corazón comienza en alrededor del día embrionario 13,5 8 . Otros han demostrado que la cantidad de supercomplexos que contienen Cx-I disminuye en el corazón debido al envejecimiento o lesiones por isquemia / reperfusión 9 , 10 o pueden jugar un papel en la progresión de enfermedades neurodegenerativas 11 . Este protocolo describe métodos para gel PAGE nativo que puede usarse para investigar el montaje y la actividad de los complejos ETC y supercomplejos. El peso molecular aproximado de los supercomplejos mitocondriales puede evaluarse separando los complejos proteicos en geles de poliacrilamida CN o BN. CN PAGE también permite la visualización de la actividad enzimática de todos los complejos mitocondriales directamente en el gel (ensayos en gel;IGA) 12 . Este trabajo demuestra la actividad de respirasomes resaltando la capacidad de Cx-I para oxidar NADH a través de IGA y la presencia de synthasomes debido a la actividad de hidrolización de ATP de Cx-V por IGA. Los múltiples complejos y supercomplejos que contienen Cx-I y Cx-V también pueden demostrarse transfiriendo las proteínas sobre membranas de nitrocelulosa y realizando inmunotransferencia. La ventaja de este enfoque es que BN o CN PAGE generalmente separa complejos proteicos basados ​​en su tamaño fisiológico y composición; La transferencia a una membrana conserva este patrón de bandas. Análisis de complejos de proteínas en un BN o CN PAGE también se puede hacer utilizando 2D-PAGE (véase Fiala et al 13 para una demostración) o por centrifugación de densidad de sacarosa [ 14 , 15] . Para analizar más a fondo una banda específica, puede ser extirpada de la BN PAGE, y las proteínas de este complejo de proteínas pueden ser purificadasD electroelutándolos bajo condiciones nativas. La electroelución nativa puede realizarse en pocas horas, lo que podría hacer una diferencia significativa en la difusión pasiva (tal como se utiliza en la Referencia 16) de proteínas desde un gel al tampón circundante. En resumen, estos métodos describen varios enfoques que permiten la caracterización adicional de los supercomplexos de alto peso molecular de las membranas mitocondriales.

<table><tbody><tr><td>Cámara de minigel Protean II</td><td>Biorad</td><td>1658004</td><td>Set completo para verter y ejecutar electroforesis de mini-gel</td></tr><tr><td>Maxi-gel Protean XL</td><td>Biorad 1653189</td><td></td><td>Set completo para verter y ejecutar electroforesis de maxi-gel</td></tr><tr><td>Generador de degradados, Hoefer SG15</td><td>VWR</td><td>95044-704</td><td>Vertido de degradados de minigel</td></tr><tr><td>Creador de degradados, maxi-gel</td><td>VWR</td><td>GM-100</td><td>Maxi-gel de vertido gradientes</td></tr><tr><td>Kit de transferencia</td><td>Biorad</td><td>1703930</td><td>Conjunto completo para la transferencia húmeda de proteínas a membranas</td></tr><tr><td>Electroeluter modelo 422</td><td>Biorad</td><td>1652976</td><td>Electroelución de proteínas a partir de páginas nativas o SDS Placas</td></tr><tr><td>de vidrio</td><td>Biorad</td><td>1653308</td><td>Placas cortas</td></tr><tr><td>Placas de vidrio</td><td>Biorad</td><td>1653312</td><td>Placas espaciadoras</td></tr><tr><td>Placas de vidrio</td><td>Biorad</td><td>1651823</td><td>Placas interiores Placas</td></tr><tr><td>de vidrio</td><td>Biorad</td><td></td><td>1651824 Placas exteriores Fuente de</td></tr><tr><td>alimentación</td><td>Biorad</td><td>1645070</td><td>Fuente de alimentación adecuada para electroforesis nativa</td></tr><tr><td>ECL-Western&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>32209</td><td>Sustrato de quimiolumniscense</td></tr><tr><td>SuperSignal-West</td><td>Dura Thermo Scientific</td><td>34075</td><td>Sustrato de quimiolumniscense mejorado</td></tr><tr><td>Película/película de autorradiografía</td><td>GE Health Care</td><td>28906845</td><td>Documentación de Western blots Procesador de</td></tr><tr><td>película CP1000</td><td>Agfa</td><td>NC0872640</td><td></td></tr><tr><td>Canon Power Shot 640&nbsp;</td><td>Canon</td><td>NA</td><td>Toma de fotografías para documentar geles, membranas y manchas.</td></tr><tr><td>Parasol de cámara Canon Power Shot 640&nbsp;</td>Cámara blindada <td>Canon</td><td></td><td>para fotos tomadas en una mesa de luz</td></tr><tr><td>Acrilamida/bisacrilamida</td><td>Biorad</td><td>1610148</td><td>solución premezclada al 40%</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma</td><td>G7403</td><td></td></tr><tr><td>SDS (dodecil sulfato de sodio)</td><td>Invitrogen</td><td>15525-017</td><td></td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td>Tampón</td></tr><tr><td>Tricine</td><td>Sigma</td><td>T0377</td><td></td></tr><tr><td>Desoxiquelato de sodio</td><td>Sigma</td><td>D66750</td><td>Detergente</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Sigma</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma</td><td>M1254</td><td>Tampón</td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Sigma</td><td>I15513</td><td>Tampón</td></tr><tr><td>Lauril maltósido</td><td>Sigma</td><td>D4641</td><td>Detergente</td></tr><tr><td>Coomassie G250</td><td>Biorad</td><td>161-0406</td><td></td></tr><tr><td>Ácido aminohexanoico</td><td>Sigma</td><td>O7260</td><td></td></tr><tr><td>Nativo&nbsp; kit de peso molecular</td><td>GE Cuidado de la salud&nbsp;</td><td>17-0445-01 Kit de</td><td>calibración de alto peso molecular para electroforesis nativa.</td></tr><tr><td>Nombre</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentarios</td></tr><tr><td>NADH</td><td>Sigma</td><td>N4505</td><td></td></tr><tr><td>Nitroblue tetrazolio</td><td>Sigma</td><td>N6639</td><td></td></tr><tr><td>Tris HCl</td><td>Sigma</td><td>T3253</td><td></td></tr><tr><td>ATP&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Lead(II) nitrato (Pb(NO3)2):</td><td>Sigma</td><td>228621</td><td></td></tr><tr><td>Oligomicina</td><td>Sigma</td><td>O4876</td><td></td></tr><tr><td><fuerte> Nombre</td><td>Company</strong</td><td>>Número de catálogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Ponceau S</td><td>Sigma</td><td>P3504</td><td></td></tr><tr><td>anti-ATP5A</td><td>Abcam</td><td>ab14748</td><td>anticuerpo contra la subunidad ATP sintasa ATP5A</td></tr><tr><td>anti-NDUFB6</td><td>Abcam</td><td>ab110244</td><td>anticuerpo contra la subunidad Cx-1 NDUFB6</td></tr><tr><td>anti-VDAC</td><td>Calbiochem</td><td>529534</td><td>anticuerpo contra el VDAC</td></tr><tr><td>ECL anticuerpo ligado a HRP</td><td>GE Health Care</td><td>NA931V</td><td>anticuerpo secundario contra ATP5A, NDUFB6 y VDAC</td></tr><tr><td>Reactivo bloqueante</td><td>Biorad</td><td>170-6404</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>cloruro de sodio</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>cloruro de potasio</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentarios</td></tr><tr><td>Silver staining Kit</td><td>Invitrogen</td><td>LC6070</td><td></td></tr></tbody></table>

análisis de supercomplexes de la cadena de transporte de electrones mitocondriales con electroforesis nativa, ensayos en gel y electroelución

Analyzing Supercomplexes of the Mitochondrial Electron Transport Chain with Native Electrophoresis, In-gel Assays, and Electroelution

La cadena de transporte de electrones mitocondriales (ETC) transduce la energía derivada de la descomposición de varios combustibles en la moneda bioenergética de la célula, ATP. El ETC se compone de 5 complejos masivos de proteínas, que también se agrupan en supercomplejos llamados respirasomes (CI, C-III y C-IV) y synthasomes (CV) que aumentan la eficiencia del transporte de electrones y la producción de ATP. Se han utilizado varios métodos durante más de 50 años para medir la función ETC, pero estos protocolos no proporcionan información sobre el ensamblaje de complejos individuales y supercomplejos. Este protocolo describe la técnica de electroforesis en gel de gel de poliacrilamida nativa (PAGE), un método que fue modificado hace más de 20 años para estudiar la estructura compleja de ETC. La electroforesis nativa permite la separación de los complejos ETC en sus formas activas, y estos complejos pueden entonces estudiarse usando inmunotransferencia, ensayos en gel (IGA) y purificación por electroelución. Combinando el reLos resultados de PAGE PAGE nativo con los de otros ensayos mitocondriales, es posible obtener una imagen completa de la actividad ETC, su ensamblaje dinámico y desmontaje, y cómo esto regula la estructura y función mitocondrial. Este trabajo también discutirá las limitaciones de estas técnicas. En resumen, la técnica de PAGE nativo, seguida de immunoblotting, IGA y electroelución, presentada a continuación, es una poderosa manera de investigar la funcionalidad y composición de los supercomplexos mitocondriales ETC.

Para visualizar supercomplexos mitocondriales, se utilizaron mitocondrias recién aisladas de ratones 17 , 18 . Los supercomplejos mitocondriales son sensibles a ciclos repetidos de congelación y descongelación, lo que conduce a su desintegración, aunque esto puede ser tolerable para algunos investigadores. Si la congelación es necesaria para el almacenamiento, para asegurar mejores resultados, las muestras no deben someterse a má...

Este protocolo describe la separación de complejos funcionales de cadenas de transporte de electrones mitocondriales (Cx) IV y sus supercomplejos utilizando electroforesis nativa para revelar información sobre su ensamblaje y estructura. El gel nativo puede someterse a inmunotransferencia, ensayos en gel y purificación por electroelución para caracterizar adicionalmente los complejos individuales.

Análisis de supercomplexes de la cadena de transporte de electrones mitocondriales con electroforesis nativa, ensayos en gel y electroelución

The mitochondrial electron transport chain (ETC) transduces the energy derived from the breakdown of various fuels into the bioenergetic currency of the ...

El objetivo general de la electroforesis nativa en combinación con ensayos en gel, inmunotransferencia y electroelución nativa es preservar y analizar el ensamblaje de los supercomplejos mitocondriales. Este método puede ayudar a responder cómo los complejos proteicos de la cadena de transporte de electrones mitocondrial se ensamblan en supercomplejos dependiendo de muchos factores, incluidas las necesidades bioenergéticas y las condiciones fisiológicas y patológicas. La principal ventaja de esta técnica es que, si se realiza adecuadamente, se mantiene la integridad fisiológica y la funcionalidad de los supercomplejos mitocondriales durante todo el prolongado proceso de aislamiento.Este método también puede aplicarse para estudiar la dinámica del ensamblaje de supercomplejos y para analizar complejos proteicos en la membrana plasmática, así como en otras membranas intracelulares. Al prepararse para ensayos en gel, es absolutamente fundamental que todas las partes utilizadas para la electroforesis nativa no estén contaminadas con detergentes, ya que contribuirán a la desintegración de los supercomplejos mitocondriales. Corte una o más bandas de un gel nativo transparente y transfier

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En este video, te mostramos cómo los complejos de la cadena respiratoria mitocondrial de las células madre embrionarias humanas pueden ser analizadas utilizando en ensayos de actividad gel.

Sondeo de la actividad mitocondrial complejo en células estaminales embrionarias humanas

En este video, demostramos una técnica electroforética, llamada PAGE nativa azul, para el análisis de complejos de proteínas respiratorias mitocondriales en su estado plegado nativo y funcionalmente activo. El tinte aniónico azul de Coomassie hace que los complejos de proteínas se carguen negativamente, lo que permite la separación en función del tamaño y la estructura.

Electroforesis en gel de poliacrilamida nativa azul: una técnica de separación no desnaturalizante para el análisis de complejos de cadenas respiratorias mitocondriales intactos

Este protocolo muestra el análisis de los complejos de la cadena respiratoria mitocondrial por electroforesis en gel de poliacrilamida nativo azul. Aquí se describe el método aplicado a las células humanas cultivadas.

Análisis de complejos de cadena respiratoria mitocondrial en células humanas cultivadas usando electroforesis en Gel de poliacrilamida nativo azul e Immunoblotting

Aquí presentamos un protocolo para extraer, resolver e identificar los supercomplejos mitocondriales que minimizan la exposición a los detergentes y al azul de Coomassie. Este protocolo ofrece un equilibrio óptimo entre la resolución y la preservación de las actividades enzimáticas, al tiempo que minimiza el riesgo de pérdida de interacciones entre proteínas y proteínas del lábil.

Híbrido claro/azul electroforesis nativa para la separación y análisis de Supercomplejos de cadenas respiratorias mitocondriales

El genoma mitocondrial de levadura de Baker codifica ocho polipéptidos. El objetivo del protocolo actual es etiquetarlos todos ellos y posteriormente visualizarlos como bandas separadas.

Etiquetado y visualización de productos de expresión del genoma mitocondrial en la levadura de Panadero Saccharomyces cerevisiae

La preparación de muestras enriquecidas con mitocondrias a partir de tejidos sólidos archivados previamente congelados permitió a los investigadores realizar evaluaciones funcionales y analíticas de las mitocondrias en diversas modalidades experimentales. Este estudio demuestra cómo preparar preparaciones enriquecidas con mitocondrias a partir de tejido cardíaco congelado y realizar evaluaciones analíticas de las mitocondrias.

Medición de complejos de transferencia de electrones mitocondriales en tejido cardíaco previamente congelado de la descendencia de cerda: un modelo para evaluar los cambios bioenergéticos mitocondriales inducidos por el ejercicio

Este protocolo describe una técnica para el análisis de supercomplejos respiratorios cuando solo se dispone de pequeñas cantidades de muestras.

Aislamiento de mitocondrias para el análisis de supercomplejos mitocondriales a partir de muestras de pequeños tejidos y cultivos celulares 

Este artículo describe un método para evaluar las interacciones y ensamblajes de proteínas integrales de membrana in vitro con varios factores asociados en un entorno proximal de lípidos.

El uso de andamios liposomas para reconstituir las interacciones proteína-proteína-lípidos proximal In Vitro

Bibliotecas de exhibición bacteriana Biopanning es una técnica probada para el descubrimiento de los reactivos de la afinidad del péptido, una alternativa robusta a los anticuerpos. El método de ordenación semi automatizado en este documento ha aerodinamizado biopanning para disminuir la ocurrencia de falsos positivos. Aquí ilustramos el proceso de pensamiento y técnicas aplicadas en evaluar a los candidatos y la minimización de análisis aguas abajo.

Biopanning semi-automatizado de bibliotecas de exhibición bacteriana péptido afinidad reactivo descubrimiento y análisis de los aislamientos que

El objetivo de este protocolo es espectrofotometría monitor plasma trans membrana transporte de electrones utilizando aceptadores del electrón extracelular y analizar las interacciones enzimáticas que pueden ocurrir con estos aceptadores del electrón extracelular.

Medición de transporte de electrones membrana Trans-Plasma por C2C12 miotubos

Aprende a analizar supercomplejos de la cadena de transporte de electrones mitocondriales mediante electroforesis nativa, ensayos en gel y electroelución. Este método preserva la integridad funcional de los complejos para estudiar su ensamblaje y dinámica bioenergética.

Análisis de supercomplexes de la cadena de transporte de electrones mitocondriales con electroforesis nativa, ensayos en gel y electroelución (Video) | JoVE Journal

Análisis de supercomplexes de la cadena de transporte de electrones mitocondriales con electroforesis nativa, ensayos en gel y electroelución

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