Análisis de supercomplexes de la cadena de transporte de electrones mitocondriales con electroforesis nativa, ensayos en gel y electroelución

El objetivo general de la electroforesis nativa en combinación con ensayos en gel, inmunotransferencia y electroelución nativa es preservar y analizar el ensamblaje de los supercomplejos mitocondriales. Este método puede ayudar a responder cómo los complejos proteicos de la cadena de transporte de electrones mitocondrial se ensamblan en supercomplejos dependiendo de muchos factores, incluidas las necesidades bioenergéticas y las condiciones fisiológicas y patológicas. La principal ventaja de esta técnica es que, si se realiza adecuadamente, se mantiene la integridad fisiológica y la funcionalidad de los supercomplejos mitocondriales durante todo el prolongado proceso de aislamiento.

Este método también puede aplicarse para estudiar la dinámica del ensamblaje de supercomplejos y para analizar complejos proteicos en la membrana plasmática, así como en otras membranas intracelulares. Al prepararse para ensayos en gel, es absolutamente fundamental que todas las partes utilizadas para la electroforesis nativa no estén contaminadas con detergentes, ya que contribuirán a la desintegración de los supercomplejos mitocondriales. Corte una o más bandas de un gel nativo transparente y transfiera estas a un recipiente etiquetado.

Para realizar el ensayo de complejo-1, combine 10 mililitros de tampón de ensayo con 25 miligramos de tetrazolio azul nítrico y 100 microlitros de NADH al 10 miligramos por mililitro. Añada esto a la banda del gel nativo transparente resecada o al área de interés. Siga el desarrollo de las bandas azules tras una agitación suave en un agitador durante al menos tres minutos.

Luego, fije el gel en 10 a 20 mililitros de solución de ácido acético o lávelo con Tris 5 milimolar pH 7,4 para detener la reacción. Tome fotografías para documentación. Para realizar el ensayo del complejo 5, obtenga un gel, una banda o un área de interés de un gel nativo azul o nativo claro.

Incube la muestra durante dos horas con agitación suave en 10 a 20 mililitros de tampón de ensayo, con o sin cinco microgramos por mililitro de oligomicina, a temperatura ambiente. Tras la incubación, reemplace el tampón con 14 mililitros de tampón de ensayo fresco. Luego agregue, en orden, 190 microlitros de sulfato de magnesio uno molar, 27,28 miligramos de nitrato de plomo, 60 miligramos de ATP y 75 microlitros de oligomicina.

Incube con agitación suave y observe un precipitado blanco, ya que las bandas en los geles tratados con oligomicina producirán bandas independientes del complejo 5. Fije el gel en un fijador a base de metanol porque las soluciones ácidas disolverán el precipitado de plomo. Fotografíe los resultados y continúe con la transferencia proteica e inmunotransferencia, como se describe en el protocolo del texto.

El día de la electroelución, coloque un frito en la parte inferior de cada tubo de vidrio que vaya a utilizarse. Si es necesario, coloque el tubo de vidrio en tampón de elución y empuje el frito desde el interior hacia el fondo del tubo. Introduzca el tubo de vidrio con el frito en el módulo del Electro-Eluter.

Humedece la arandela con el tampón de elución y desliza el tubo de vidrio en su lugar. Asegúrate de que las partes superiores de los tubos de vidrio queden alineadas con la arandela. Cierra las arandelas vacías con tapones.

A continuación, coloque una tapa de membrana húmeda en la parte inferior del adaptador de silicona y llene el adaptador con tampón de elución. Pipetee lentamente el tampón y el adaptador hacia arriba y hacia abajo para eliminar cualquier burbuja de aire alrededor de la membrana de diálisis. Deslice el adaptador lleno de tampón hacia la parte inferior del tubo de vidrio.

Luego, retire todas las burbujas que aparezcan en el embudo dentro del tubo de vidrio. Llene cada tubo de vidrio con el tampón de elución. Coloque las bandas cortadas de la BN-PAGE en los tubos de vidrio.

Corte las piezas grandes en trozos más pequeños. Asegúrese de que la altura del relleno dentro del tubo de vidrio sea de aproximadamente un centímetro. Luego, coloque todo el módulo dentro del tanque.

Agregue aproximadamente 600 mililitros de tampón de elución frío al tanque. Asegúrese de que las tapas adaptadoras de silicona queden sumergidas en el tampón. Coloque una barra de agitación en el fondo del tanque antes de eluir las proteínas durante cuatro horas a 350 voltios en una cámara fría.

Una vez finalizada la elución, retire el módulo Electro-Eluter del tanque de tampón y colóquelo en un fregadero o recipiente. Si se utilizó un tapón, retírelo para vaciar la cámara superior de tampón. Elimine el tampón de cada tubo de vidrio y deséchelo.

Asegúrese de que el adaptador de silicona permanezca en su lugar y de que el líquido debajo del filtro no se altere ni agite. Luego, retire cuidadosamente el adaptador de silicona junto con la tapa de la membrana desde la parte inferior del tubo de vidrio. Pipetee el contenido de la tapa de silicona hacia un microtubo.

Con otros 200 microlitros de tampón de elución, enjuague el tapón de silicona y agréguelos al microtubo. Repita este procedimiento para todos los tubos de vidrio. Preserve los tapones de membrana reutilizables colocándolos en tampón de elución que contenga 0,5 miligramos por mililitro de azida sódica, y refrigérelos.

Los supercomplejos de mitocondrias cardíacas se visualizan aquí mediante ensayos en gel. Se utilizan carriles del gel nativo transparente para ensayos en gel de los complejos 1 y 5. La especificidad de la señal puede evaluarse utilizando inhibidores, como el oligomicina para la ATP sintasa.

Los ensayos en gel proporcionan información sobre el tamaño de un complejo proteico, con actividad del complejo-1 o complejo-5, pero no sobre su composición. La electroforesis nativa azul muestra bandas de complejos proteicos que pueden ser resecadas para electroelución. Tras la electroelución, el eluato se utiliza para análisis posteriores, como ensayos en gel, tinción de plata de las proteínas eluidas mediante electroforesis nativa o desnaturalizante, e inmunotransferencia.

Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en tres días si se lleva a cabo correctamente. Estos tres días incluyen el aislamiento de mitocondrias, la realización de una electroforesis nativa azul maxi durante la noche y el inmunotransferencia. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar e identificar supercomplejos mitocondriales utilizando electroforesis nativa, ensayos en gel y electroelución.

Al realizar este procedimiento, es importante recordar que los supercomplejos mitocondriales son frágiles. Se debe minimizar la congelación y descongelación de las muestras. La electroforesis nativa y la electroelución deben realizarse sobre hielo o en cámara fría.

Las implicaciones de estas técnicas van más allá de definir la composición física de cada supercomplejo. Dado que los supercomplejos se capturan en su forma nativa, se pueden realizar ensayos funcionales. Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología mitocondrial reevaluaran la comprensión de la actividad del transporte de electrones mitocondriales y sus consecuencias para los pacientes con enfermedades mitocondriales.

Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como HPLC, espectroscopía de masas, microscopía electrónica o registro de parches para responder preguntas adicionales, como la composición molecular, la estructura o las propiedades electrofisiológicas de los complejos proteicos aislados.