Análisis de supercomplexes de la cadena de transporte de electrones mitocondriales con electroforesis nativa, ensayos en gel y electroelución

El objetivo general de la electroforesis nativa en combinación con ensayos en gel, inmunotransferencia y electroelución nativa es preservar y analizar el ensamblaje de supercomplejos mitocondriales. Este método puede ayudar a responder cómo los complejos proteicos de la cadena de transporte de electrones mitocondrial se ensamblan en supercomplejos dependiendo de muchos factores, incluidas las necesidades bioenergéticas y las condiciones fisiológicas y patológicas. La principal ventaja de esta técnica es que, si se realiza correctamente, la integridad fisiológica y la funcionalidad de los supercomplejos mitocondriales se conservan durante todo el largo proceso de aislamiento.

Este método también se puede aplicar para estudiar la dinámica del ensamblaje de supercomplejos y para analizar complejos de proteínas en la membrana plasmática, así como en otras membranas intracelulares. Al prepararse para los ensayos en gel, es absolutamente crítico que todas las piezas utilizadas para la electroforesis nativa no estén contaminadas por detergentes, ya que contribuirán a la desintegración de los supercomplejos mitocondriales. Corte uno o más carriles de un gel nativo transparente y transfiéralos a un recipiente etiquetado.

Para realizar el ensayo del complejo 1, combine 10 mililitros de tampón de ensayo con 25 miligramos de tetrazolio azul nitro y 100 microlitros de 10 miligramos por mililitro de NADH. Agregue esto al carril de gel nativo transparente extirpado o al área de interés. Siga el desarrollo de las bandas azules después de agitar suavemente en un balancín durante al menos tres minutos.

Luego, fije el gel en 10 a 20 mililitros de solución de ácido acético o lave en Tris pH 7.4 de cinco milimolares para detener la reacción. Tome fotografías para documentación. Para realizar el ensayo del complejo 5, obtenga un gel, un carril o un área de interés de un gel nativo azul o nativo transparente.

Incubar la muestra durante dos horas con agitación suave en 10 a 20 mililitros de tampón de ensayo, más o menos cinco microgramos por mililitro de oligomicina a temperatura ambiente. Después de la incubación, reemplace el tampón con 14 mililitros de tampón de ensayo fresco. Luego agregue, en orden, 190 microlitros de sulfato de magnesio molar, 27,28 miligramos de nitrato de plomo, 60 miligramos de ATP y 75 microlitros de oligomicina.

Incube con agitación suave y observe si hay un precipitado blanco, ya que las bandas de los geles tratados con oligomicina darán bandas dependientes que no sean del complejo 5. Fije el gel en un fijador a base de metanol porque las soluciones ácidas disolverán el precipitado de plomo. Fotografíe los resultados y siga con la transferencia de proteínas y la inmunotransferencia, como se describe en el protocolo de texto.

El día de la electroelución, coloque una frita en el fondo de cada tubo de vidrio que se vaya a utilizar. Si es necesario, coloque el tubo de vidrio en un tampón de elución y empuje la frita desde el interior hasta el fondo del tubo. Empuje el tubo de vidrio con la frita en el módulo del electroelutor.

Humedece el ojal con tampón de elución y desliza el tubo de vidrio en su lugar. Asegúrese de que la parte superior de los tubos de vidrio esté nivelada con el ojal. Cierre los ojales vacíos con tapones.

A continuación, coloque una tapa de membrana húmeda en la parte inferior del adaptador de silicona y llene el adaptador con tampón de elución. Pipetee lentamente el tampón y el adaptador hacia arriba y hacia abajo para eliminar las burbujas de aire alrededor de la membrana de diálisis. Deslice el adaptador lleno de tampón hasta el fondo del tubo de vidrio.

Luego, retire todas las burbujas que aparezcan en la frita dentro del tubo de vidrio. Llene cada tubo de vidrio con el tampón de elución. Coloque las bandas extirpadas del BN-PAGE en los tubos de vidrio.

Corta los trozos grandes en trozos más pequeños. Asegúrese de que la altura de llenado dentro del tubo de vidrio sea de aproximadamente un centímetro. Luego, coloque todo el módulo en el tanque.

Agregue aproximadamente 600 mililitros de tampón de elución fría al tanque. Asegúrese de que las tapas adaptadoras de silicona estén sumergidas en el tampón. Coloque una barra agitadora en el fondo del tanque antes de eluir las proteínas durante cuatro horas a 350 voltios en una habitación fría.

Una vez completada la elución, retire el módulo Electro-Eluter del tanque intermedio y colóquelo en un fregadero o tazón. Si se utilizó un tapón, retírelo para drenar la cámara tampón superior. Retire el tampón de cada tubo de vidrio y deséchelo.

Asegúrese de que el adaptador de silicona permanezca en su lugar y que el líquido debajo de la frita no se altere ni se agite. Luego, retire con cuidado el adaptador de silicona, junto con la tapa de membrana de la parte inferior del tubo de vidrio. Pipetee el contenido de la tapa de silicona en un microtubo.

Con otros 200 microlitros de tampón de elución, enjuague la tapa de silicona y agréguela al microtubo. Repita este proceso para todos los tubos de vidrio. Conserve las tapas de membrana reutilizables colocándolas en un tampón de elución que contenga 0,5 miligramos por mililitro de azida de sodio y refrigérelas.

Los supercomplejos de las mitocondrias del corazón se visualizan aquí mediante ensayos en gel. Los carriles del gel nativo transparente se utilizan para ensayos en gel para el complejo-1 y el complejo-5. La especificidad de la señal puede evaluarse mediante el uso de inhibidores, como la oligomicina para la ATP-sintasa.

ensayos en gel proporcionan información sobre el tamaño de un complejo proteico, con actividad de complejo 1 o complejo 5, pero no sobre su composición. El gel nativo azul muestra bandas de complejos proteicos que se pueden extirpar para la electroelución. Después de la electroelución, el eluido se utiliza para análisis posteriores, como ensayos en gel, tinción de plata de las proteínas eluidas mediante electroforesis nativa o desnaturalizante y Western blot.

Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en tres días si se realiza correctamente. Estos tres días incluyen el aislamiento de las mitocondrias, la realización de una maxiloforesis nativa azul durante la noche y la inmunotransferencia. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar e identificar supercomplejos mitocondriales mediante electroforesis nativa, ensayos en gel y electroelución.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar que los supercomplejos mitocondriales son frágiles. La congelación y descongelación de las muestras debe reducirse al mínimo. La electroforesis nativa y la electroelución deben realizarse en hielo o en cámara frigorífica.

Las implicaciones de estas técnicas van más allá de la definición de la composición física de cada supercomplejo. Debido a que los supercomplejos se capturan en su forma nativa, se pueden realizar ensayos funcionales. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología mitocondrial reevaluaran la comprensión de la actividad de transporte de electrones mitocondrial y sus consecuencias para los pacientes con enfermedades mitocondriales.

Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la HPLC, la espectroscopia de masas, la microscopía electrónica o la fijación de parches para responder a preguntas adicionales como la composición molecular, la estructura o las propiedades electrofisiológicas de los complejos de proteínas aislados.