La visualización de la función respiratoria mitocondrial utilizando citocromo C Oxidasa / Succinato Deshidrogenasa (COX / SDH) de doble etiquetado Histoquímica

El objetivo general de este procedimiento es permitir la visualización directa de las deficiencias de enzimas respiratorias mitocondriales en secciones de tejido fresco congelado. Esto se logra recolectando primero secciones de criostato del órgano de interés. El segundo paso del procedimiento es realizar la química de Cox Histo, a la que sigue la química de SDH Histo.

Finalmente, las secciones de tejido se deshidratan, se montan y se deslizan la cubierta. En última instancia, los resultados pueden mostrar la cantidad de disfunción mitocondrial a través de la cantidad de tinción azul celular. Hi.Today vamos a hablar de la técnica HISTOQUÍMICA de doble marcaje de Cox SCH.

Y aunque este método se puede aplicar para estudiar las enfermedades mitocondriales, también puede proporcionar información sobre el envejecimiento y los trastornos relacionados con la edad. Después de extraer el cerebro de un animal que ha sido sacrificado de acuerdo con el permiso ético, congélelo rápidamente en hielo seco. El pañuelo congelado se puede mantener a menos 80 grados centígrados, envuelto en papel de aluminio hasta que esté listo para seccionar.

Prepare el tejido para la criosección colocando el cerebro en un mandril de criostato y rodeándolo con compuesto de inclusión. Coloque rápidamente el mandril en el criostato y recoja secciones de 14 micras a menos 21 grados Celsius. Descongele las secciones en los portaobjetos con un bloque calefactor y luego deje que los portaobjetos se sequen a temperatura ambiente durante una hora.

Coloque los portaobjetos en una cámara de tinción de portaobjetos con tiras de papel mojadas. Debido a que los tiempos de reacción son importantes en este ensayo, se recomienda procesar un máximo de 10 portaobjetos por experimento bajo una cubierta química. Prepare la incubación, medio que contenga dab y citocromo C en PBS y vórtice.

Agregue rápidamente dos microgramos de CDE bovinos al medio y mezcle bien por vórtice. Para romper todos los granos de CDE que aún funcionan debajo del capó, aplique de 150 a 200 microlitros de medio de incubación a cada portaobjetos usando la punta de la pipeta para distribuir uniformemente en todas las secciones. Incubar los portaobjetos durante 40 minutos a 37 grados centígrados.

Después de 40 minutos, retire el medio de incubación de los portaobjetos. Lave los portaobjetos cuatro veces en PBS durante 10 minutos cada vez. Después de lavar los portaobjetos, devuélvalos a la cámara de tinción de portaobjetos con tiras de papel mojadas que funcionan debajo de una cubierta química.

Prepare la solución de NBT en PBS, teniendo cuidado de proteger el PMS del vórtice de luz, la solución aplique rápidamente de 150 a 200 microlitros de la solución de NBT a cada portaobjetos utilizando la punta de la pipeta para distribuir uniformemente en todas las secciones. Incubar los portaobjetos durante 40 minutos a 37 grados centígrados después de 40 minutos, retire el exceso de solución de los portaobjetos. Lave los portaobjetos cuatro veces en PBS durante 10 minutos cada vez.

Deshidrate los portaobjetos durante dos minutos cada uno en las siguientes concentraciones secuenciales de etanol. 70%70%95%95%y 99,5%Finalmente, espere 10 minutos en un paso adicional del 99,5%. Coloque las diapositivas en xileno durante 10 minutos, monte con LAN y aplique cubreobjetos.

Deje que los portaobjetos se sequen durante la noche o al menos una o dos horas en un área ventilada aquí. Secciones cerebrales de tipo salvaje y envejecimiento prematuro. MT. Los ratones mutadores de ADN se marcaron secuencialmente para las actividades COX y SDH.

La actividad normal de Cox, indicada por la tinción de color marrón oscuro, se observa en el hipocampo de los ratones de tipo salvaje. Las deficiencias de Cox indicadas por la tinción azul se revelaron en el hipocampo de ratones mutadores de ADN MT a las 12 y 46 semanas. Hubo una disminución adicional en la actividad de Cox a las 46 semanas de edad en ratones mutadores M-T-D-N-A, lo que sugiere una exacerbación generalizada de la disfunción de la cadena respiratoria.

Los tiempos de incubación inadecuados de 10 y 25 minutos dieron como resultado una deposición reducida del producto de la reacción del dab marrón. Los tiempos de incubación más cortos permitieron la formación del producto final azul Foran durante la incubación de SDH, lo que sugiere engañosamente la presencia de células con deficiencias de COX y deslizamiento de la cubierta. Los portaobjetos durante la incubación de COX también dieron lugar a una formación y deposición inexactas del producto de la reacción DAB.

Aunque las actividades de Cox y SDH se pueden etiquetar individualmente como se muestra aquí, el etiquetado secuencial ha demostrado ser ventajoso para localizar células con disfunción mitocondrial. Un ejemplo de un control de especificidad para las actividades de COX y SDH en el cerebro de un ratón de tipo salvaje muestra un etiquetado negativo. Por lo tanto, no olvide que trabajar con los productos químicos en el etiquetado doble de Cox SCH es el protocolo químico es extremadamente peligroso y las precauciones como usar ropa de laboratorio adecuada y una mascarilla que funcione debajo del capó químico, y también desechar el medio de incubación deben realizarse cada vez que realice este ensayo.