Avance de imágenes de alta resolución de ensamblajes de virus en líquido y hielo

Aquí se describen los protocolos para preparar conjuntos de virus adecuados para el análisis de EM líquido y crio-EM a nanoescala utilizando microscopía electrónica de transmisión.

El interés en la microscopía electrónica líquida se ha disparado en los últimos años, ya que ahora podemos visualizar en los procesos en tiempo real a nanoescala. Un mejor conocimiento de estas estructuras flexibles puede ayudarnos a desarrollar nuevos reactivos para combatir patógenos emergentes como el SARS-CoV-2. Ver proteínas en un ambiente fluido ayuda a imitar los sistemas biológicos y nos da la oportunidad de observar las proteínas de una manera más dinámica.

Y este experimento le mostrará nuevas técnicas sobre cómo usar y visualizar proteínas tanto en hielo vítreo como en ambientes líquidos. Los resultados recientes incluyen información dinámica de vacunas candidatas en terapias basadas en anticuerpos fotografiadas en líquido. Las aplicaciones correrelativas de líquidos y crioelectroEM avanzan nuestra capacidad de visualizar la dinámica molecular, proporcionando un contexto único para la salud y la enfermedad humanas.

Los lectores que emplean tecnologías TEM o crio-EM convencionales pueden considerar implementar flujos de trabajo de EM líquida para proporcionar nuevas observaciones dinámicas de sus muestras de una manera que complemente sus estrategias actuales. Los sistemas de electroelectroterapia líquida disponibles comercialmente pueden proporcionar flujo, mezcla, estímulos electroquímicos y control de temperatura, que son esenciales para muchas aplicaciones de imágenes en tiempo real. El método sándwich de microchip presentado aquí describe una forma simple de nivel de entrada para ver primero las muestras en líquido antes de dar el salto a un sistema comercial más complejo para experimentos in situ.

Para comenzar, limpie los microchips de nitruro de silicio incubando cada chip en 150 mililitros de acetona durante dos minutos, seguido de la incubación en 150 mililitros de metanol durante dos minutos. Deje que las virutas se sequen en un flujo de aire laminar. Limpie con plasma las virutas secas utilizando un instrumento de descarga incandescente que funcione en condiciones estándar durante 45 segundos utilizando gas argón.

A continuación, cargue un microchip de base seca en la punta del portamuestras y agregue alrededor de 0,2 microlitros de la muestra al chip base. Después de incubar durante uno o dos minutos, coloque el chip superior en el chip base húmedo que contiene la muestra. Coloque el conjunto para formar un recinto herméticamente sellado que se mantenga en su lugar mecánicamente mediante tres tornillos de latón.

Bombee la punta a 10 a menos seis torr usando una estación de bombeo seco turbobombeada. El soporte ahora está listo para ser insertado en el TEM. Limpie con plasma los microchips y las rejillas de carbono utilizando un instrumento de descarga luminosa durante 45 segundos.

Y agregue alrededor de dos microlitros de muestra a un microchip descargado de brillo colocado en un paquete de gel. Retire el exceso de solución con papel de filtro o una pipeta e incube durante uno o dos minutos. Luego agregue la rejilla de carbono descargada de brillo al microchip húmedo que contiene la muestra.

Plante el conjunto utilizando un solo portamuestras de inclinación a temperatura ambiente para formar un recinto herméticamente cerrado. Como alternativa, utilice clips de rejilla de cargador automático y coloque el conjunto sándwich en el clip C inferior. Coloque el clip superior en la parte superior del conjunto y utilice la herramienta de sujeción estándar para sellar el conjunto.

La muestra ahora está lista para ser insertada en el TEM. Examine las muestras colocadas en cargadores automáticos en condiciones criogénicas o a temperatura ambiente. Para imágenes electromagnéticas líquidas, cargue el portamuestras en el TEM equipado con una pistola de emisión de campo y opere a 200 kilovoltios.

Encienda la pistola y ajuste la altura eucéntrica de la platina del microscopio con respecto a la muestra utilizando la función wobbler, inclinando la muestra de menos 15 grados a más 15 grados en la columna. Este procedimiento ajusta la etapa en la dirección Z para acomodar el grosor de la muestra y ayuda a garantizar un aumento preciso durante la grabación de imágenes. Grabe imágenes como películas enmarcadas largas o imágenes individuales utilizando el paquete de software de recopilación de datos en serie, implementando rutinas de imágenes automatizadas.

Adquiera imágenes en condiciones de baja dosis con aumentos que van desde 28, 000X a 92, 000X y 40 cuadros por segundo. Ajuste los tiempos de exposición para minimizar el daño del haz a la muestra y use un rango de desenfoque de menos uno a cuatro micrómetros con el aumento especificado. Si se encuentra una solución espesa, utilice valores de desenfoque más altos o seleccione una región de interés diferente.

Asegúrese de que la solución esté presente en las muestras durante toda la sesión de imágenes enfocando el haz de electrones en un área de sacrificio que no se utiliza para la recopilación de datos hasta que se forman burbujas. Analice películas en busca de partículas de SARS-CoV-2 utilizando el programa RELION-3.0.8 o cualquier otro software de procesamiento de imágenes. Realice la corrección de movimiento utilizando el programa MotionCor2.

Una vez corregido, extraiga las partículas utilizando la herramienta de selección automática en el paquete de software del programa. Los tamaños típicos de caja son 330 píxeles para muestras líquidas y 350 píxeles para muestras de hielo. Calcule las reconstrucciones iniciales utilizando la simetría C1 con la rutina de modelo inicial 3D del programa y las opciones de modelo ab initio en el paquete de software de procesamiento de datos.

Luego realice protocolos de refinamiento en el software de procesamiento de datos. Examine los resultados utilizando un paquete de software de análisis de estructura molecular mientras evalúa los cambios dinámicos. Aquí se muestra una comparación de las estructuras de EM líquida y crio-EM en el subtipo tres del virus adenoasociado o AAV.

Las imágenes representativas muestran la estructura de AAV en la solución y en hielo. Aquí se muestran las vistas rotacionales de la subunidad AAV VP1 extraída de las estructuras líquidas y de hielo. Estas imágenes representan los valores dinámicos en las estructuras líquidas generadas utilizando la función de mapa de transformación en el software de análisis de estructura molecular.

Las estructuras promedio de múltiples ensamblajes de virus muestran cambios conformacionales con un cambio de diámetro de casi el 5% medido utilizando datos EM. Aquí se muestra una imagen de ensamblajes subvirales de SARS-CoV-2 aislados de fracciones séricas de pacientes con COVID-19. Estas burbujas blancas indican la presencia de líquido en la muestra.

Aquí se muestra una reconstrucción EM de estos ensamblajes subvirales con densidades radiales coloreadas a cinco cortes nanométricos a través del mapa. La imagen representativa describe el análisis de partículas de doble capa de rotavirus preparadas en hielo vítreo utilizando la técnica del sándwich de microchip. El uso de detergentes, glicerol, polietileno, glicoles y altos niveles de azúcares debe minimizarse o evitarse para imágenes electromagnéticas líquidas.

Estos reactivos pueden introducir artefactos, crear burbujeo excesivo, productos de hidrólisis y radicales libres debido al daño del haz. El uso de estos protocolos permitirá a los científicos poder estudiar procesos dinámicos con detalle atómico. Y esto abarca múltiples campos de la ciencia, incluida la medicina, las ciencias de la vida y la investigación de materiales.

Los protocolos presentados aquí describen cómo las herramientas de vanguardia pueden proporcionar un medio emocionante para visualizar macromoléculas biológicas a través de nuevos ojos. El campo de la microscopía electrónica líquida puede elevar la forma en que estudiamos estos nuevos virus que representan una amenaza para la salud humana, tal vez incluso contribuyendo a nuestras medidas de preparación para pandemias.