Name: Estructura del VIH-1 Asambleas cápside por crio-microscopía electrónica y reconstrucción iterativa helicoidal del espacio real (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 38 s
Description: Aprende a obtener estructuras tridimensionales de ensamblajes helicoidales mediante criomicroscopía electrónica y reconstrucción iterativa en espacio real. Este protocolo detallado utiliza ensamblajes de cápside del VIH-1 como modelo.

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Los autores desean agradecer al Dr. Zhao y Gongpu Ke Danxia de apoyo técnico. Agradecemos a los Dres. Edward Egelman y Grigorieff Niko para compartir su software de procesamiento de imágenes. Reconocemos también el personal que apoya la Biología Estructural crio-ME instalaciones y cluster Beowulf y la red de la Universidad de la Escuela de Medicina de Pittsburgh. Este trabajo fue apoyado por GM082251 y GM085043.

1. Congelados-hidratados EM preparación de la muestra Dado que el VIH-1 proteína de la cápside (CA) 9 asambleas son estables sólo en sal (NaCl 1M) de amortiguación, lo que contribuye el ruido de fondo fuerte en la crio-ME imágenes, se utiliza una dilución rápida y la espalda del lado del método secante para reducir transitoriamente la sal concentración en la preparación de la red de congelados-hidratados EM. <ol><li> Descarga luminiscente del carbono lado de R2 de malla 200 / 1 mallas de cobre en Quantifoil 25mA durante 25 segundos. </li><li> Use un nebulizador para que la humedad en la cámara del medio ambiente, una de fabricación casera émbolo gravedad manual, al 80%. </li><li> En el FEI Vitrobot émbolo dewar, etano líquido frío con nitrógeno líquido. Monte el dewar caída del punto de congelación en el émbolo de la gravedad manual. </li><li> Aplicar 2,5 l de solución pre-ensamblados CA en el lado de carbono de la red, que se monta en unas pinzas, y la carga de las pinzas en el émbolo con el lado de carbono de la red de espaldas a usted. </li><li> Añadir 3 l de tampón de dilución baja de sal (NaCl 100 mM) a la parte de atrás de la parrilla e inmediatamente secar la parte de atrás de la parrilla con un trozo de papel de filtro. La superficie de toda la espalda de la parrilla debe estar en estrecho contacto con el papel de filtro durante aproximadamente 6 segundos, antes de retirar el papel de filtro. Inmediatamente caída de la red en etano líquido después de quitar el papel de filtro. </li><li> Quite las pinzas del émbolo y rápida transferencia de la red en una caja de almacenamiento de red. </li></ol> 2. Crio-microscopía electrónica de CA asambleas tubular <ol><li> La carga de la red congelados-hidratados en un operativo FEI Polara microscopio de electrones G2 en 200kV y equipado con una cámara Gatan 4Kx4K CCD. </li><li> En dosis bajas-el modo de búsqueda, con un aumento de ~ 200x y con una dosis &lt;0.001e - / A 2, pantalla de toda la parrilla de las zonas con hielo adecuado y guardar las posiciones de estas áreas en un fichero de escenario. </li><li> Recordar las posiciones de guarda y la pantalla más estas áreas con un aumento de 3.900 x en bajas dosis, el modo de búsqueda. Seleccione las áreas con una capa uniforme y delgada de hielo que contienen bien separados, largos tubos en los agujeros, para la recolección de datos. Guardar la ubicación de estas áreas en un archivo de la segunda etapa. </li><li> Cambiar a modo de exposición con un aumento de 59.000 x, la inserción de 100 micras de apertura el objetivo, y ajustar la estigmatización objetivo y la intensidad del haz de una dosis de ~ 15 e - / 2 por la exposición. </li><li> Volver al modo de baja dosis de búsqueda, pasar a una posición guardada e identificar y centro de un tubo de buen uso de la cámara CCD. Cambiar al modo de enfoque, ajuste el enfoque, y establecer un valor de desenfoque, m normalmente entre 0,5 a 2,5. Cambiar al modo de exposición, establezca un tiempo de exposición de 0.3 a 0.5 segundos, para una dosis de 15 e - / A 2, y recoger una imagen. Las imágenes se recogen en una cámara de placa, y las películas deben dejarse en reposo durante 10 segundos antes de que la foto está tomada. </li><li> Pasar a la siguiente posición guardada y repita el paso 5 para recoger más imágenes. </li><li> Las películas se desarrollan con toda su fuerza D19 durante 12 minutos y digitalizadas utilizando una Nikon Super Coolscan 9000 ED Escáner en un tamaño de píxel de 6.35 micras. El formato de archivos de imagen TIFF es. </li></ol> 3. Helicoidal de indexación Un objeto helicoidales pueden ser indexados por dos parámetros: el fin de Bessel, n, y el número de capa de línea, l. Cada línea de la capa en la transformada de Fourier, que se caracteriza por (n, l), corresponde a un conjunto de líneas en la red la superficie del objeto helicoidal denota por (h, k) los índices, usando la notación de una red en 2D. Para cualquier (h, k), una línea de capa (n hk, l hk) es una combinación lineal de dos vectores básicos (n = 10, L 10) y (n 01, l 01), que son los valores de n y l las dos principales líneas de capa (1, 0) y L (0, 1). se puede obtener a partir de la altura de la línea de capa medida a lo largo del eje Z en la transformada de Fourier. El valor de n se puede estimar mediante la siguiente ecuación 10 πRr ≈ ≈ 1,1 J n | n | -0,9 .....................( 1) donde J n es la función de Bessel, que determina la intensidad de la línea n º capa, r es el radio del objeto helicoidal, y R es el radio de la amplitud máxima de la línea de la capa. El número de línea de capa, l, se relaciona con n por la regla de selección 11 l = tn + um ....................( 2) donde T y U son constantes de la hélice. Para cualquier hélice dada, puede haber unidades exactamente u exactamente (o muy cerca) t complete vueltas. <ol><li> Caja con un tubo relativamente recto y largo con un diámetro uniforme con el programa de EMAN 12 helixboxer y guardar la imagen en formato de MRC. </li><li> Determinar la distancia de repetición helicoidal, c, utilizando un programa basado en la correlación cruzada, tales como "imgccf ', en el paquete de MRC 13. </li><li> Calcular la transformada de Fourier con una longitud de caja nueva que es una parte integral de la distancia de repetición, c. </li><li> Elija dos líneas principales que definen la capa de dos vectores básicos de red de superficie (1,0) y (0,1). </li><li> Medir el radio del tubo, r, y la altura y el radio de las dos líneas principales en la capa transformada de Fourier, l 10, R 10, L 01 ​​R 01, respectivamente (Fig. 1). </li><li> Calcular n n 10 y 01 de acuerdo a la ecuación (1). </li><li> Dado que los valores n son sólo estimaciones, unas cuantas combinaciones de n 10 y 01 n se ponen a prueba en pasos posteriores (véase el paso 4.2) para encontrar el correcto uso de la simetría helicoidal IHRSR paquete de programas. </li><li> Calcular la simetría tornillo descrita por dos números reales: la rotación entre las subunidades (Δφ) y el aumento axial (Δz) de la hélice de una estrella (n = 1). Teniendo en cuenta l 10, l 01, n 10, y los valores de n 01, U y T se puede obtener mediante pruebas de un rango de valores m (por ejemplo, -50 &lt;m &lt;50) de acuerdo con la regla de selección. Por último, Δφ y Δz se calculan utilizando Δφ = 360 t / u, y Δz = c / u. </li></ol> 4. La reconstrucción tridimensional <ol><li> Segmentación de partículas <ol><li> Abrir una micrografía que contiene partículas de helicoidal, con el boxeador programa gráfico, que es un programa en el paquete de EMAN. </li><li> Corte helicoidal de la partícula en superposición de los segmentos. En el panel de control de Boxer, elegir el modo de hélice y establecer los parámetros para el boxeo: el tamaño de la caja debe ser más grande que el diámetro de la partícula y el valor de "Olap" debe ser aproximadamente el 90% del tamaño de la caja. </li><li> Después de hacer clic izquierdo en cada extremo de la partícula helicoidal, Boxer se generará automáticamente una serie de cuadros de partículas a lo largo de la longitud de la hélice. </li><li> Guardar los segmentos de caja, así como sus coordenadas. </li></ol></li><li> Inicial de la reconstrucción en 3D utilizando programas IHRSR <ol><li> Invertir el contraste de las imágenes de la crio-ME y aplicar filtros de paso bajo 14 (opcional) antes de su procesamiento con el verdadero método iterativo helicoidal reconstrucción del espacio (IHRSR). </li><li> Abra la interfaz gráfica del programa de IHRSR escribiendo "generador". Proporcionar la interfaz gráfica con toda la información de la pila de partículas en caja, incluyendo el nombre y la ruta de la pila, el número de imágenes en la pantalla, los valores de los parámetros de simetría, etc Haga clic en el botón "Finalizar" para crear el guión de la reconstrucción, b25.spi. </li><li> Use un cilindro macizo o hueco, como una referencia inicial y permitir que el procedimiento para el ciclo hasta que no haya cambios en la simetría de tornillo definida, que ocurre generalmente después de algunos ciclos. El derecho de simetría helicoidal debe dar una forma estable de reconstrucción convergente. La reconstrucción generado en el último ciclo se utilizará como referencia inicial para un mayor refinamiento. IHRSR realiza la reconstrucción 3D utilizando programas de SPIDER. </li></ol></li><li> Reconstrucción con refinamiento iterativo 15 La reconstrucción 3D generada por IHRSR ahora se utiliza como referencia inicial para el refinamiento adicional. Durante el refinamiento, la simetría helicoidal se fija en Δφ y Δz, que se determinan a partir del procedimiento IHRSR. <ol><li> Determinar el desenfoque y el astigmatismo presentes en la micrografía utilizando programas CTFFIND3 y CTFTILT 16. </li><li> Multiplicar los segmentos de partículas por el uso de programas CTF SPIDER 17. La operación denominada FT en la sala de SPIDER se utiliza para calcular la transformada de Fourier (FFT) de la imagen 2D. A partir de entonces, la FFT se multiplica por los valores de CTF, determinado en los pasos anteriores, utilizando la operación denominada MU dentro del conjunto de SPIDER. El valor obtenido se transformó inversa hacia atrás para formar una nueva imagen (CTF-corregido) en el espacio real con la operación de SPIDER, FT de nuevo. </li><li> Realizará comparaciones de proyección mediante la comparación de las proyecciones de los volúmenes de referencia con la CTF-corregido imágenes usando multi-referencia de alineación. La variación en el ángulo de inclinación fuera del avión se limita a + / -10 ° y se tomaron muestras en pasos de 1 °. Introducir restricciones, como los coeficientes de correlación, en el plano ángulos cercanos a 0 º o 180 º, y limitada X turnos, para los parámetros de alineación de cada segmento. Incluir en la reconstrucción sólo aquellos segmentos que satisfacen las restricciones. </li><li> Después de cada ciclo iterativo refinamiento, una reconstrucción en 3D se genera mediante la proyección de vuelta y se divide por la suma sobre el CTF2. </li><li> Imponer la simetría helicoidal para generar un volumen simetrizada. El refinamiento iterativo se termina cuando no hay mejora en la resolución de la nueva reconstrucción en 3D se produce. </li><li> El procesamiento de imágenes SPIDER paquete se utiliza para la mayoría de los pasos de refinamiento. Una serie de operaciones son controladas por los scripts de araña, que son creados por el usuario los archivos de control de proceso por lotes que contienen secuencias de las operaciones y valores de los parámetros. La reconstrucción final se calcula utilizando los programas de SPIDER suite. </li></ol></li></ol> 5. Los resultados representativos: Un solo de VIH-1 CA A92E tubo (Fig. 1a) estaba en caja y su transformada de Fourier (fig. 1b) se calculó para la indexación helicoidal. Para las líneas de la capa (1, 0) y (0, 1), l 10 = 28, l 01 = 37, R 10 = 55, R 01 = 44. Teniendo en cuenta un radio de tubo de 211.57Å, nos aproxima n 10 =- 12, n 01 = 11 (en este caso, la imparcialidad estaba predeterminado). Con una distancia de repetición de 5195.48Å, la simetría del tornillo del tubo se determinó como Δz = 6.8093Å, Δφ = 328,88 °. Δz y Δφ se perfeccionaron a 7.1321Å y 328,86 ° utilizando IHRSR (Fig. 2a) y la reconstrucción inicial se muestra en la figura. 2b. La reconstrucción final (Fig. 3), después de refinamiento iterativo, la mejora del mapa de densidad de manera significativa a partir del modelo inicial calculada con IHRSR (Fig. 2b). <img src="/files/ftp_upload/3041/3041fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Indexación del VIH-1 CA tubo helicoidal. (A) Un solo por VIH-1 CA de tubo de imagen A92E. Barra de escala, 30 nm. (B) La transformada de Fourier de la sonda se muestra en (A). Los índices helicoidal (n = 10 =- 12, n = 01 11) se indican. Los puntos de punta de flecha a la línea de capa a una resolución de 23 bis. <img src="/files/ftp_upload/3041/3041fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Una reconstrucción inicial con IHRSR. (A) Tornillo de la determinación de la simetría de cada ciclo iterativo. Δφ y Δz, a partir de los valores iniciales, coinciden en los valores estables después de 10 ciclos iterativos refinamiento. (B) El primer mapa 3D de la densidad después de 10 ciclos iterativos. <img src="/files/ftp_upload/3041/3041fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. El mapa de densidad de 3D después de que el refinamiento iterativo. (AC) El mapa de densidad de los tubos de CA se muestra como tres rebanadas ortogonal: paralelo al eje del tubo y cerca de la superficie (A), perpendicular al eje del tubo (B), y en paralelo ya través del eje del tubo (C) . Las barras de escala, 10 nm. (D) la representación de la superficie de la mapa de densidad de contornos 3D en 1.8s adjuntando volumen de 100%.

<ol><li>Frank, J., Radermacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+reconstruction+of+single+particles+negatively+stained+or+in+vitreous+ice%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional reconstruction of single particles negatively stained or in vitreous ice.</a> Ultramicroscopy. 46, 241-262 (1992).</li>
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</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Se presenta un conjunto de protocolos para proporcionar un método directo para obtener las estructuras 3D de los objetos helicoidales. Utilizando los procedimientos descritos, hemos adquirido una estructura 3D del VIH-1 de la Asamblea cápside de un único tubo de imagen (176 segmentos). Estructuras superiores de resolución se puede lograr mediante la inclusión de más datos de la imagen. Hay varios puntos críticos para la recolección de datos óptimo y análisis: En primer lugar, durante la preparación de una muestra de la crio-ME, la solución de la muestra debe ser borrado, dejando una capa uniforme y delgada de solución que es ligeramente más grueso que el tamaño de la muestra. Hay varias maneras de secar la muestra. De las células bacterianas y las muestras tubulares, como el VIH-1 de la Asamblea CA, borrando de un solo lado, sobre todo de la parte posterior del lado, es el más apropiado. En segundo lugar, la imparcialidad de la hélice debe ser determinado, ya que esto no se puede hacer mediante la indexación de hélice o de reconstrucción. Una práctica común es usar hielo-grabado, seguido por el Rotary sombra 18 para determinar la lateralidad. Imparcialidad también se puede determinar después de la reconstrucción cuando la resolución del mapa de densidad es suficientemente alta, los modelos 3D atómica de los componentes individuales deben encajar muy bien en el mapa de densidad cuando se supone correcta imparcialidad. De lo contrario, la imparcialidad contrario se debe asumir. En tercer lugar, un filtro de Wiener se debe utilizar durante el procesamiento de imágenes, tanto la fase de corrección y amplitud, para reducir la amplificación de ruido. Dado que la CTF a partir de una sola imagen siempre tiene cruces por cero, parte de la información en el espacio recíproco se ha perdido. Por lo tanto, es necesario disponer de datos de múltiples conjuntos de proyección incluido para la reconstrucción 3D, imágenes en cada uno de los valores de desenfoque diferentes.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre </td><td> Fuente </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Glow-100X dispositivo de descarga </td><td> Glow-100X dispositivo de descarga </td><td></td></tr><tr><td> Tecnai Polara F30 microscopio con una pistola de campo de emisión </td><td> FEI, Hillsboro, OR </td><td></td></tr><tr><td> Gatan 4K x 4K CCD de la cámara </td><td> Gatan, Pleasanton, CA </td><td></td></tr><tr><td> Sumérgete de congelación dispositivo </td><td></td><td> De fabricación casera manual de émbolo gravedad </td></tr><tr><td> Quantifoil R2 / 1 200 mallas de carbono holely-rejillas de cobre </td><td> Quantifoil Micro Herramientas, Jena, Alemania </td><td></td></tr><tr><td> EM software EMAN </td><td> <a href="http://blake.bcm.edu/EMAN/">http://blake.bcm.edu/EMAN/</a> </td><td></td></tr><tr><td> EM software IHRSR </td><td> <a href="http://people.virginia.edu/~ehe2n/">http://people.virginia.edu/ ~ ehe2n /</a> </td><td> Programas disponibles de Edward H. Egelman </td></tr><tr><td> EM software Araña </td><td> <a href="http://www.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html">http://www.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html</a> </td><td></td></tr><tr><td> MRC basado en software de procesamiento de hélice </td><td> <a href="http://www.riken.jp/biostrmech/index.html">http://www.riken.jp/biostrmech/index.html</a> </td><td> Programas disponibles de Koji Yonekura </td></tr><tr><td> CTFFIND3/CTFTILT y el espacio real de software refinamiento helicoidal </td><td> <a href="http://emlab.rose2.brandeis.edu/software">http://emlab.rose2.brandeis.edu/software</a> </td><td></td></tr></tbody></table>

estructura del vih-1 asambleas cápside por crio-microscopía electrónica y reconstrucción iterativa helicoidal del espacio real

Structure of HIV-1 Capsid Assemblies by Cryo-electron Microscopy and Iterative Helical Real-space Reconstruction

Crio-microscopía electrónica (crio-ME), en combinación con el procesamiento de imágenes, es una herramienta cada vez más potentes para la determinación estructural de complejos de proteínas macromoleculares y asambleas. De hecho, la microscopía electrónica de partículas solo una y dos dimensiones (2D) cristalografía de electrones se han convertido en dos metodologías relativamente de rutina y un gran número de estructuras se han solucionado con estos métodos. Al mismo tiempo, procesamiento de imágenes y de tres dimensiones (3D) la reconstrucción de los objetos helicoidales se ha desarrollado rápidamente, sobre todo, el proceso iterativo helicoidal real espacio de reconstrucción (IHRSR) Método 3, que utiliza solo las herramientas de análisis de partículas en conjunción con simetría helicoidal. Muchas entidades de función biológica en formas filamentosas o helicoidal, como los filamentos de actina 4, 5 microtúbulos, las fibras amiloides 6, virus del mosaico del tabaco 7, 8 y flagelos bacterias, y, debido a un mapa de densidad 3D de una entidad helicoidal se puede lograr a partir de una sola proyección la imagen, en comparación con la gran cantidad de imágenes necesarios para la reconstrucción 3D de un objeto no helicoidal, con el método IHRSR, el análisis estructural de tales asambleas helicoidal flexible y desordenada es ahora una meta alcanzable. En este artículo de vídeo, que proporciona protocolos detallados para la obtención de un mapa de densidad 3D de un conjunto de proteínas helicoidales (VIH-1 cápside 9 es nuestro ejemplo), incluyendo protocolos para la preparación de muestras crio-ME, dosis bajas de recolección de datos de la crio-ME, la indexación de los patrones de difracción helicoidal, y procesamiento de imágenes y reconstrucción 3D utilizando IHRSR. En comparación con otras técnicas, la crio-ME ofrece la conservación óptima de muestras en condiciones casi nativo. Las muestras se insertan en una capa delgada de hielo vítreo, mediante la congelación rápida, y la imagen en los microscopios electrónicos en la temperatura del nitrógeno líquido, bajo condiciones de baja dosis para minimizar el daño por radiación. Las imágenes de muestra se obtienen en condiciones casi nativo a expensas de la señal de baja y de bajo contraste en las micrografías registrado. Afortunadamente, el proceso de reconstrucción helicoidal ha sido en gran parte automatizado, con la excepción de la indexación del patrón de difracción helicoidal. Aquí se describe un enfoque de índice de estructura helicoidal y determinar simetrías helicoidal (parámetros helicoidales) a partir de microfotografías digitales, un paso esencial para la reconstrucción 3D helicoidal. En pocas palabras, se obtiene un primer mapa 3D de la densidad por el método de IHRSR. Este mapa inicial se iterativamente refinados mediante la introducción de restricciones para los parámetros de alineación de cada segmento, por lo tanto el control de sus grados de libertad. Nuevas mejoras se consigue mediante la corrección de la función de transferencia de contraste (CTF) de la microscopía electrónica (corrección de la amplitud y fase) y mediante la optimización de la simetría helicoidal de la asamblea.

Este artículo describe un método para obtener una imagen tridimensional (3D), estructura de las moléculas helicoidales ensamblados con crio-microscopía electrónica. En este protocolo, el uso de conjuntos de la cápside del VIH-1 para ilustrar el procedimiento detallado de reconstrucción 3D para el logro de un mapa de densidad por el método iterativo helicoidal reconstrucción del espacio real.

Estructura del VIH-1 Asambleas cápside por crio-microscopía electrónica y reconstrucción iterativa helicoidal del espacio real

La criomicroscopía electrónica (cryo-EM), combinada con el procesamiento de imágenes, es una herramienta cada vez más potente para la determinación estructural de proteínas macromoleculares...

El objetivo general de este procedimiento es proporcionar un método para obtener una estructura tridimensional de moléculas ensambladas de heli mediante microscopía electrónica criogénica. El protocolo comienza con la preparación de la muestra para microscopía electrónica criogénica utilizando un método de dilución rápida y retención por el lado opuesto para reducir transitoriamente la concentración de sal durante la preparación de la rejilla de microscopía electrónica congelada e hidratada. Este proceso asegura la estabilidad de la proteína mientras reduce el ruido de fondo y mejora la relación señal-ruido durante la recolección de datos con baja dosis en microscopía electrónica criogénica que sigue posteriormente a la recolección de datos.Se completa el indexado helicoidal de los patrones de difracción. Luego se realiza el procesamiento de imágenes, seguido de la reconstrucción tridimensional en el espacio real, lo que da como resultado el mapa de densidad final de la cápside del VIH-1 o del tubo de CA. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque existen varios puntos críticos para una recolección y análisis óptimos de los datos.Por ejemplo, en el caso del VIH, se ensamblan estructuras tubulares de cápside que solo se forman en una solución fuente molar al reducir rápidamente la concentración de sal sin afectar la estructura. Es fundamental obtener imágenes de alta calidad mediante microscopía crioelectrónica. Dada una imagen de un tubo, resulta muy difícil determinar qué acciones realizar para indexar un tubo crítico y qué software podría considerarse para realizar la reconstrucción tridimensional.Este video proporciona un enfoque detallado y sencillo para obtener una reconstrucción 3D de objetos físicos y podría utilizarse como referencia para su experimento. Demostraré el procedimiento junto con la Dra. Puja. Ambos somos investigadores postdoctorales del Laboratorio del Dr. Para preparar los ensamblajes de la proteína del capsido del VIH para microscopía criogénica, comience por aplicar un tratamiento de descarga de corona en el lado de carbono de rejillas de cobre de malla 200, a 25 miliamperios durante 25 segundos.Utilice un nebulizador para elevar la humedad al 80 % en la cámara ambiental, que es un émbolo de gravedad manual casero. Mientras tanto, enfríe etano líquido en un émbolo de botella de vidrio con nitrógeno líquido y monte el dispositivo de congelación por inmersión en el émbolo de gravedad manual. A continuación, use pinzas para cerrar las pinzas firmemente sobre el borde de la rejilla.Aplique 2,5 microlitros de una solución proteica preensamblada sobre el lado de carbono de la rejilla. Luego, coloque la pinza sobre el émbolo con el lado de carbono de la rejilla orientado hacia afuera. Añada tres microlitros de tampón de dilución con baja salinidad al lado posterior de la rejilla.Presione inmediatamente la rejilla con un trozo de papel de filtro en el mismo lado. Mantenga toda la superficie posterior de la rejilla en contacto estrecho con el papel de filtro durante aproximadamente seis segundos. Después de retirar el papel de filtro, sumerja inmediatamente la rejilla en etano líquido.Finalmente, retire la pinza del émbolo y transfiera rápidamente la rejilla a una caja de almacenamiento de rejillas. Comience la microscopía electrónica criogénica cargando la rejilla con congelación por hidratación en un microscopio electrónico FEI Polara G2, operando a 200 kilovoltios y equipado con una cámara CCD Gatan de 4K por 4K.En el modo de búsqueda con dosis baja, agregue una magnificación de aproximadamente 200 x. Examine toda la cuadrícula en busca de áreas con hielo adecuado. Guarde las posiciones de estas áreas en un archivo de etapa.Recupere las posiciones guardadas y examine además estas áreas. Aumente la magnificación a 3.900 x en el modo de búsqueda con dosis baja. Seleccione las áreas con una capa de hielo uniforme y delgada para la recopilación de datos, caracterizadas por contener tubos largos suspendidos sobre un agujero.Guarde todas las áreas en un archivo de segunda etapa. Cambie al modo de exposición. Añada una magnificación de 59.000 x e inserte una abertura objetiva de 100 micrómetros.Luego ajuste el astigmatismo del objetivo y la intensidad del haz para una dosis de aproximadamente 15 electrones por angstrom cuadrado por exposición. Regrese al modo de búsqueda con baja dosis y muévase a una posición guardada. Identifique y centre un buen tubo.Usando la cámara CCD, cambie al modo de enfoque, ajuste el enfoque y establezca un valor de desenfoque normalmente entre 0,5 y 2,5 micrómetros. Luego cambie al modo de exposición y establezca un tiempo de exposición de 0,3 a 0,5 segundos para una dosis de 15 electrones por angstrom cuadrado. Recolecte las imágenes en una cámara de placas, permitiendo que las películas se estabilicen durante 10 segundos antes de tomar la exposición.Tras la recopilación de las imágenes, pase a la siguiente posición guardada y repita este proceso para obtener más imágenes. Revele las películas con D 19 al 100 % durante 12 minutos. Luego digitalice las imágenes utilizando un escáner Nikon Super cool scan 9,000 ED con un tamaño de píxel de 6,35 micrómetros.Un objeto helicoidal puede indexarse mediante dos parámetros: el orden de Bessel N y el número de línea de capa L en la transformada de Fourier de la red superficial de un objeto helicoidal. Cada línea de capa se caracteriza por N y L y corresponde a un conjunto de líneas en la red superficial, indicadas por los índices H y K.Para comenzar el indexado helicoidal, utilice el programa Helix boxer de Iman para delimitar un tubo relativamente largo y recto con diámetro uniforme y guarde la imagen en formato MRC. Luego, mida el radio del tubo utilizando el programa boxer de Iman. Determine la distancia de repetición HEL mediante un programa basado en correlación cruzada, como I-M-G-C-C-F del paquete MRC.Luego, calcule el vestíbulo. Transforme con una nueva longitud de caja que sea un múltiplo entero de la distancia de repetición. A continuación, elija dos líneas de capa principales que definan dos vectores de red superficiales básicos: uno cero y cero uno, en unidades de píxeles de la FFT.Determine los números de líneas de capas, así como los radios de amplitud máxima para las dos líneas de capas principales en la transformada de Fourier. Dados los números de líneas de capas y los valores de los órdenes de Bessel para las dos líneas de capas principales, se pueden obtener la rotación entre subunidades y el ascenso axial de la hélice uniestelar utilizando la regla de selección descrita en el procedimiento escrito. Estos dos números reales describen la simetría helicoidal del tubo.La reconstrucción 3D comienza con la segmentación de partículas utilizando el programa Iman Boxer. Después de abrir una micrografía que contiene partículas helicoidales, corte una partícula en segmentos superpuestos en el panel de control de Boxer. Seleccione el modo helicoidal y configure los parámetros para el encuadre.El tamaño de la caja debe ser mayor que el diámetro de la partícula y el valor para OLA debe ser aproximadamente el 90 % del tamaño de la caja. Después de hacer clic en cualquiera de los extremos del marcador de partículas, se generará automáticamente una serie de cajas de partículas a lo largo de la longitud de la hélice, guardando los segmentos delimitados así como sus coordenadas. El siguiente paso consiste en realizar una reconstrucción tridimensional inicial utilizando el método de reconstrucción en el espacio real helicoidal iterativo I-H-R-S-R antes de procesar con I-H-R-S-R.Invierta el contraste de las imágenes de microscopía electrónica criogénica y aplique un filtro PASO BAJO. Luego, abra la interfaz gráfica del programa I-H-R-S-R escribiendo «generator». Proporcione a la interfaz gráfica toda la información sobre la pila de partículas delimitadas, incluyendo el nombre y la ruta de la pila, el número de imágenes en la pila y los valores de los parámetros de simetría.Haga clic en el botón de finalizar para crear el script de reconstrucción. B 25 SP. Utilizo un cilindro sólido o hueco como referencia inicial y permito que el procedimiento se repita hasta que no haya cambios en la simetría de tornillo definida, lo cual generalmente ocurre después de algunos ciclos. Una simetría helicoidal derecha debería proporcionar una reconstrucción estable y convergente.La reconstrucción generada en el último ciclo se utilizará como una referencia inicial para un refinamiento adicional. Finalmente, realice la reconstrucción 3D con refinamiento iterativo utilizando el mapa de densidad 3D generado por I-H-R-S-R como referencia inicial para un refinamiento adicional durante el proceso. La simetría helicoidal se fija en la rotación entre subunidades y el ascenso axial, que se determinan a partir del procedimiento I-H-R-S-R.A continuación, determine el desenfoque y el astigmatismo presentes en la micrografía utilizando los programas CTF find three y CTF tilt, empleando programas spider denominados FT y mu multiplicar segmentos de partículas por la función de transferencia de contraste. Abreviado CTF, realice coincidencia de proyecciones comparando proyecciones de los volúmenes de referencia con las imágenes corregidas por CTF mediante alineación de múltiples referencias. La variación en el ángulo de inclinación fuera del plano se limita a más o menos 10 grados y se muestrea en pasos de un grado; introduzca restricciones como coeficientes de correlación elevados para ángulos en el plano cercanos a cero grados o 180 grados y desplazamientos X limitados.Para los parámetros de alineamiento de cada segmento, incluya en la reconstrucción solo aquellos segmentos que cumplan con las restricciones. Después de cada ciclo de refinamiento iterativo, se genera una reconstrucción 3D mediante retroproyección y se divide por un valor sobre el CTF al cuadrado para imponer la simetría helicoidal y generar un volumen con simetrías. El refinamiento iterativo finaliza cuando no se produce ninguna mejora adicional en la resolución de la nueva reconstrucción 3D.Se recortó un ensamblaje de cápside de VIH-1, un tubo de 92 e, y se calculó su transformada de Fourier para indexar la hélice: los dos radios, los números de líneas de capa y los radios de amplitud máxima para las líneas de capa uno cero y cero uno se determinaron. Luego se calcularon valores extremos de -12 y 11 para uno cero y cero uno, respectivamente, con una distancia de repetición de 5195,48 angstroms. La simetría helicoidal del tubo se determinó como delta Z igual a 6,81 angstroms y delta cinco igual a 328,88 grados; delta Z y delta cinco se refinaron a 7,13 angstroms y 328,86 grados utilizando I-H-R-S-R, y se generó una reconstrucción inicial tras 10 ciclos iterativos.La reconstrucción final tras el refinamiento iterativo mejoró significativamente el mapa de densidad respecto al modelo inicial calculado con I-H-R-S-R. El mapa de densidad de los tubos de ensamblaje de la cápside se muestra como tres cortes ortogonales paralelos al eje del tubo y cercanos a la superficie, perpendiculares al eje del tubo y paralelos y a través del eje del tubo. La estructura mostrada resulta de la representación superficial del mapa de densidad 3D contorneado a 1.8 Sigma, que encierra el 100 % del volumen.Después de ver este video, debería tener una muy buena comprensión de cómo obtener una estructura 3D de una molécula ensamblada por medio de microscopía electrónica criogénica.

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