Estructura del VIH-1 Asambleas cápside por crio-microscopía electrónica y reconstrucción iterativa helicoidal del espacio real

El objetivo general de este procedimiento es proporcionar un método para obtener una estructura tridimensional de moléculas ensambladas de heli mediante microscopía electrónica criogénica. El protocolo comienza con la preparación de la muestra para microscopía electrónica criogénica utilizando un método de dilución rápida y retención por el lado opuesto para reducir transitoriamente la concentración de sal durante la preparación de la rejilla de microscopía electrónica congelada e hidratada. Este proceso asegura la estabilidad de la proteína mientras reduce el ruido de fondo y mejora la relación señal-ruido durante la recolección de datos con baja dosis en microscopía electrónica criogénica que sigue posteriormente a la recolección de datos.

Se completa el indexado helicoidal de los patrones de difracción. Luego se realiza el procesamiento de imágenes, seguido de la reconstrucción tridimensional en el espacio real, lo que da como resultado el mapa de densidad final de la cápside del VIH-1 o del tubo de CA. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque existen varios puntos críticos para una recolección y análisis óptimos de los datos.

Por ejemplo, en el caso del VIH, se ensamblan estructuras tubulares de cápside que solo se forman en una solución fuente molar al reducir rápidamente la concentración de sal sin afectar la estructura. Es fundamental obtener imágenes de alta calidad mediante microscopía crioelectrónica. Dada una imagen de un tubo, resulta muy difícil determinar qué acciones realizar para indexar un tubo crítico y qué software podría considerarse para realizar la reconstrucción tridimensional.

Este video proporciona un enfoque detallado y sencillo para obtener una reconstrucción 3D de objetos físicos y podría utilizarse como referencia para su experimento. Demostraré el procedimiento junto con la Dra. Puja. Ambos somos investigadores postdoctorales del Laboratorio del Dr. Para preparar los ensamblajes de la proteína del capsido del VIH para microscopía criogénica, comience por aplicar un tratamiento de descarga de corona en el lado de carbono de rejillas de cobre de malla 200, a 25 miliamperios durante 25 segundos.

Utilice un nebulizador para elevar la humedad al 80 % en la cámara ambiental, que es un émbolo de gravedad manual casero. Mientras tanto, enfríe etano líquido en un émbolo de botella de vidrio con nitrógeno líquido y monte el dispositivo de congelación por inmersión en el émbolo de gravedad manual. A continuación, use pinzas para cerrar las pinzas firmemente sobre el borde de la rejilla.

Aplique 2,5 microlitros de una solución proteica preensamblada sobre el lado de carbono de la rejilla. Luego, coloque la pinza sobre el émbolo con el lado de carbono de la rejilla orientado hacia afuera. Añada tres microlitros de tampón de dilución con baja salinidad al lado posterior de la rejilla.

Presione inmediatamente la rejilla con un trozo de papel de filtro en el mismo lado. Mantenga toda la superficie posterior de la rejilla en contacto estrecho con el papel de filtro durante aproximadamente seis segundos. Después de retirar el papel de filtro, sumerja inmediatamente la rejilla en etano líquido.

Finalmente, retire la pinza del émbolo y transfiera rápidamente la rejilla a una caja de almacenamiento de rejillas. Comience la microscopía electrónica criogénica cargando la rejilla con congelación por hidratación en un microscopio electrónico FEI Polara G2, operando a 200 kilovoltios y equipado con una cámara CCD Gatan de 4K por 4K.

En el modo de búsqueda con dosis baja, agregue una magnificación de aproximadamente 200 x. Examine toda la cuadrícula en busca de áreas con hielo adecuado. Guarde las posiciones de estas áreas en un archivo de etapa.

Recupere las posiciones guardadas y examine además estas áreas. Aumente la magnificación a 3.900 x en el modo de búsqueda con dosis baja. Seleccione las áreas con una capa de hielo uniforme y delgada para la recopilación de datos, caracterizadas por contener tubos largos suspendidos sobre un agujero.

Guarde todas las áreas en un archivo de segunda etapa. Cambie al modo de exposición. Añada una magnificación de 59.000 x e inserte una abertura objetiva de 100 micrómetros.

Luego ajuste el astigmatismo del objetivo y la intensidad del haz para una dosis de aproximadamente 15 electrones por angstrom cuadrado por exposición. Regrese al modo de búsqueda con baja dosis y muévase a una posición guardada. Identifique y centre un buen tubo.

Usando la cámara CCD, cambie al modo de enfoque, ajuste el enfoque y establezca un valor de desenfoque normalmente entre 0,5 y 2,5 micrómetros. Luego cambie al modo de exposición y establezca un tiempo de exposición de 0,3 a 0,5 segundos para una dosis de 15 electrones por angstrom cuadrado. Recolecte las imágenes en una cámara de placas, permitiendo que las películas se estabilicen durante 10 segundos antes de tomar la exposición.

Tras la recopilación de las imágenes, pase a la siguiente posición guardada y repita este proceso para obtener más imágenes. Revele las películas con D 19 al 100 % durante 12 minutos. Luego digitalice las imágenes utilizando un escáner Nikon Super cool scan 9,000 ED con un tamaño de píxel de 6,35 micrómetros.

Un objeto helicoidal puede indexarse mediante dos parámetros: el orden de Bessel N y el número de línea de capa L en la transformada de Fourier de la red superficial de un objeto helicoidal. Cada línea de capa se caracteriza por N y L y corresponde a un conjunto de líneas en la red superficial, indicadas por los índices H y K.

Para comenzar el indexado helicoidal, utilice el programa Helix boxer de Iman para delimitar un tubo relativamente largo y recto con diámetro uniforme y guarde la imagen en formato MRC. Luego, mida el radio del tubo utilizando el programa boxer de Iman. Determine la distancia de repetición HEL mediante un programa basado en correlación cruzada, como I-M-G-C-C-F del paquete MRC.

Luego, calcule el vestíbulo. Transforme con una nueva longitud de caja que sea un múltiplo entero de la distancia de repetición. A continuación, elija dos líneas de capa principales que definan dos vectores de red superficiales básicos: uno cero y cero uno, en unidades de píxeles de la FFT.

Determine los números de líneas de capas, así como los radios de amplitud máxima para las dos líneas de capas principales en la transformada de Fourier. Dados los números de líneas de capas y los valores de los órdenes de Bessel para las dos líneas de capas principales, se pueden obtener la rotación entre subunidades y el ascenso axial de la hélice uniestelar utilizando la regla de selección descrita en el procedimiento escrito. Estos dos números reales describen la simetría helicoidal del tubo.

La reconstrucción 3D comienza con la segmentación de partículas utilizando el programa Iman Boxer. Después de abrir una micrografía que contiene partículas helicoidales, corte una partícula en segmentos superpuestos en el panel de control de Boxer. Seleccione el modo helicoidal y configure los parámetros para el encuadre.

El tamaño de la caja debe ser mayor que el diámetro de la partícula y el valor para OLA debe ser aproximadamente el 90 % del tamaño de la caja. Después de hacer clic en cualquiera de los extremos del marcador de partículas, se generará automáticamente una serie de cajas de partículas a lo largo de la longitud de la hélice, guardando los segmentos delimitados así como sus coordenadas. El siguiente paso consiste en realizar una reconstrucción tridimensional inicial utilizando el método de reconstrucción en el espacio real helicoidal iterativo I-H-R-S-R antes de procesar con I-H-R-S-R.

Invierta el contraste de las imágenes de microscopía electrónica criogénica y aplique un filtro PASO BAJO. Luego, abra la interfaz gráfica del programa I-H-R-S-R escribiendo «generator». Proporcione a la interfaz gráfica toda la información sobre la pila de partículas delimitadas, incluyendo el nombre y la ruta de la pila, el número de imágenes en la pila y los valores de los parámetros de simetría.

Haga clic en el botón de finalizar para crear el script de reconstrucción. B 25 SP. Utilizo un cilindro sólido o hueco como referencia inicial y permito que el procedimiento se repita hasta que no haya cambios en la simetría de tornillo definida, lo cual generalmente ocurre después de algunos ciclos. Una simetría helicoidal derecha debería proporcionar una reconstrucción estable y convergente.

La reconstrucción generada en el último ciclo se utilizará como una referencia inicial para un refinamiento adicional. Finalmente, realice la reconstrucción 3D con refinamiento iterativo utilizando el mapa de densidad 3D generado por I-H-R-S-R como referencia inicial para un refinamiento adicional durante el proceso. La simetría helicoidal se fija en la rotación entre subunidades y el ascenso axial, que se determinan a partir del procedimiento I-H-R-S-R.

A continuación, determine el desenfoque y el astigmatismo presentes en la micrografía utilizando los programas CTF find three y CTF tilt, empleando programas spider denominados FT y mu multiplicar segmentos de partículas por la función de transferencia de contraste. Abreviado CTF, realice coincidencia de proyecciones comparando proyecciones de los volúmenes de referencia con las imágenes corregidas por CTF mediante alineación de múltiples referencias. La variación en el ángulo de inclinación fuera del plano se limita a más o menos 10 grados y se muestrea en pasos de un grado; introduzca restricciones como coeficientes de correlación elevados para ángulos en el plano cercanos a cero grados o 180 grados y desplazamientos X limitados.

Para los parámetros de alineamiento de cada segmento, incluya en la reconstrucción solo aquellos segmentos que cumplan con las restricciones. Después de cada ciclo de refinamiento iterativo, se genera una reconstrucción 3D mediante retroproyección y se divide por un valor sobre el CTF al cuadrado para imponer la simetría helicoidal y generar un volumen con simetrías. El refinamiento iterativo finaliza cuando no se produce ninguna mejora adicional en la resolución de la nueva reconstrucción 3D.

Se recortó un ensamblaje de cápside de VIH-1, un tubo de 92 e, y se calculó su transformada de Fourier para indexar la hélice: los dos radios, los números de líneas de capa y los radios de amplitud máxima para las líneas de capa uno cero y cero uno se determinaron. Luego se calcularon valores extremos de -12 y 11 para uno cero y cero uno, respectivamente, con una distancia de repetición de 5195,48 angstroms. La simetría helicoidal del tubo se determinó como delta Z igual a 6,81 angstroms y delta cinco igual a 328,88 grados; delta Z y delta cinco se refinaron a 7,13 angstroms y 328,86 grados utilizando I-H-R-S-R, y se generó una reconstrucción inicial tras 10 ciclos iterativos.

La reconstrucción final tras el refinamiento iterativo mejoró significativamente el mapa de densidad respecto al modelo inicial calculado con I-H-R-S-R. El mapa de densidad de los tubos de ensamblaje de la cápside se muestra como tres cortes ortogonales paralelos al eje del tubo y cercanos a la superficie, perpendiculares al eje del tubo y paralelos y a través del eje del tubo. La estructura mostrada resulta de la representación superficial del mapa de densidad 3D contorneado a 1.8 Sigma, que encierra el 100 % del volumen.

Después de ver este video, debería tener una muy buena comprensión de cómo obtener una estructura 3D de una molécula ensamblada por medio de microscopía electrónica criogénica.