Estructura del VIH-1 Asambleas cápside por crio-microscopía electrónica y reconstrucción iterativa helicoidal del espacio real

El objetivo general de este procedimiento es proporcionar un método para obtener una estructura tridimensional de moléculas heliensambladas utilizando criomicroscopía electrónica. El protocolo comienza con la preparación de la muestra de EM criogénico utilizando un método de dilución rápida y transferencia posterior para reducir transitoriamente la concentración de sal al preparar la rejilla EM hidratada congelada. Este proceso garantiza la estabilidad de la proteína, al tiempo que reduce el ruido de fondo y mejora la relación señal-ruido durante la recopilación de datos de dosis baja de cryo EM que sigue a la recopilación de datos.

Se completa la indexación helicoidal de los patrones de difracción. A continuación, se realiza el procesamiento de la imagen, seguido de una reconstrucción 3D en el espacio real, que da como resultado el mapa de densidad final de la cápside o tubo de CA del VIH. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque hay varios puntos críticos para una recopilación y análisis de datos óptimos.

Por ejemplo, en el caso del VIH, los ensamblajes tubulares de una cápside que solo se forman en una solución de origen molar reducen rápidamente la concentración de sal sin afectar la estructura. Es fundamental obtener imágenes crioelectromagnéticas de alta calidad. Dada una imagen de tubo, es muy difícil aprender qué hacer para indexar un tubo crítico y qué software podría considerarse para realizar la reconstrucción 3D.

Este vídeo proporciona un enfoque detallado y sencillo para obtener una reconstrucción en 3D de objetos físicos y podría utilizarse como referencia para su experimento. Voy a demostrar el procedimiento con el Dr. Puja. Ambos somos postdoctorados del Dr.Laboratory Para preparar el VIH uno, los ensamblajes de proteínas de la cápside para la criomielitis comienzan por resplandor, descargando el lado de carbono de 200 rejillas de cobre de malla por debajo de 25 miliamperios durante 25 segundos.

Use un nebulizador para llevar la humedad al 80% en la cámara ambiental, que es un émbolo de gravedad manual casero. Mientras tanto, el etano líquido frío en un agitador de émbolo de botella de vitro con nitrógeno líquido monta el hacedor de congelación por inmersión en el émbolo de gravedad manual. A continuación, utilice pinzas para sujetar las pinzas cerradas en el borde de la rejilla.

Aplique 2,5 microlitros de una solución de proteína preensamblada en el lado de carbono de la rejilla. A continuación, cargue las pinzas en el émbolo con el lado de carbono de la rejilla hacia fuera. Agregue tres microlitros de tampón de dilución de baja sal en la parte posterior de la rejilla.

Seca inmediatamente la rejilla con un trozo de papel de filtro del mismo lado. Mantenga toda la superficie posterior de la rejilla en estrecho contacto con el papel de filtro durante aproximadamente seis segundos. Después de quitar el papel de filtro, sumerja inmediatamente la rejilla en etano líquido.

Finalmente, retire las pinzas del émbolo y transfiera rápidamente la rejilla a una caja de almacenamiento de rejilla. Comience la criomicroscopía electrónica cargando la rejilla hidratada congelada en un microscopio de dos electrones polar G de FEI. Funciona a 200 kilovoltios y está equipado con una cámara CCD gatin 4K by 4K.

En el modo de búsqueda de dosis baja, agregue un aumento de aproximadamente 200 x. Examine toda la cuadrícula en busca de áreas con hielo adecuado. Guarde las posiciones de estas áreas en un archivo de escenario.

Recuerde las posiciones guardadas y evalúe aún más estas áreas. Añada un aumento de 3.900 x en el modo de búsqueda de dosis baja. Seleccione las áreas con capa delgada uniforme de hielo para la recolección de datos, que se caracterizan por contener tubos largos suspendidos sobre un orificio.

Guarde todas las áreas en un archivo de segunda etapa. Cambia al modo de exposición. Añada un aumento de 59.000 x e inserte una apertura de objetivo de 100 micrómetros.

A continuación, ajuste el estigmatismo objetivo y la intensidad del haz para obtener una dosis de aproximadamente 15 electrones por angstrom al cuadrado por exposición. Regrese al modo de búsqueda de dosis baja y muévase a una posición guardada. Identifica y centra un buen tubo.

Con la cámara CCD, cambie al modo de enfoque, ajuste el enfoque y establezca un valor de desenfoque normalmente entre 0,5 y 2,5 micrómetros. A continuación, cambie al modo de exposición y establezca un tiempo de exposición de 0,3 a 0,5 segundos para una dosis de 15 electrones por angstrom cuadrado. Recoja las imágenes en una cámara de placa, permitiendo que las películas se asienten durante 10 segundos antes de tomar una exposición.

Después de la recopilación de imágenes, desplácese a la siguiente posición guardada y repita este proceso para recopilar más imágenes. Revele las películas en D 19 con toda su fuerza durante 12 minutos. A continuación, digitalice las imágenes con un escáner Nikon Super cool scan 9.000 ED con un tamaño de píxel de 6,35 micrómetros.

Un objeto helicoidal se puede indexar mediante dos parámetros. El orden de Bessel N y el número de línea de capa L en la transformada forer de la red de superficie de un objeto helicoidal. Cada línea de capa se caracteriza por N y L y corresponde a un conjunto de líneas en la red de superficie denotadas por los índices H y K.

Para comenzar la indexación helicoidal, utilice el programa Helix boxer de Iman para encajonar un tubo relativamente largo y recto con un diámetro uniforme y guarde la imagen en formato MRC. A continuación, mida el radio del tubo utilizando el programador de Iman. Determine la distancia de repetición HEL utilizando un programa basado en correlación cruzada como I-M-G-C-C-F en el paquete MRC.

A continuación, calcule el vestíbulo. Transforme con una nueva longitud de cuadro que sea una integral de la distancia de repetición. A continuación, elija dos líneas de capa principales que definan dos vectores de celosía de superficie básicos, uno cero y cero uno en unidades de píxel FFT.

Determine los números de línea de capa, así como los radios de amplitud máxima para las dos líneas de capa principales en la transformada de Fourier. Dados los números de línea de capa y los valores de los órdenes de Bessel para las dos líneas de capa principales, la rotación entre subunidades y la elevación axial de la hélice de una estrella se pueden obtener utilizando la regla de selección descrita en el procedimiento escrito. Estos dos números reales describen la simetría del tornillo del tubo.

La reconstrucción 3D comienza con la segmentación de partículas utilizando el programa Iman. Boxeador. Después de abrir una micrografía que contiene partículas helicoidales, corte una partícula en segmentos superpuestos en el panel de control del boxeador. Elija el modo helix y configure los parámetros para el boxeo.

El tamaño de la caja debe ser mayor que el diámetro de la partícula y el valor de OLA debe ser aproximadamente el 90% del tamaño de la caja. Después de la izquierda, al hacer clic en cualquiera de los extremos de la caja de partículas, se generará automáticamente una serie de cajas de partículas a lo largo de la longitud de la hélice, guarde los segmentos en caja, así como sus coordenadas. El siguiente paso es realizar la reconstrucción 3D inicial utilizando el método iterativo de reconstrucción helicoidal del espacio real I-H-R-S-R antes del procesamiento con I-H-R-S-R.

Invierta el contraste de las imágenes crio-EM y aplique el filtrado LOWPASS. A continuación, abra la interfaz gráfica del programa I-H-R-S-R escribiendo generator. Proporcione a la interfaz gráfica toda la información de la pila de partículas en caja, incluido el nombre y la ruta de la pila, el número de imágenes en la pila y los valores de los parámetros de simetría.

Haga clic en el botón Finalizar para crear el script de reconstrucción. B 25 SP. Utilizo un cilindro sólido o hueco como referencia inicial y dejo que el procedimiento se repita hasta que no haya cambios en la simetría del tornillo definida, lo que generalmente ocurre después de unos pocos ciclos. Una simetría helicoidal recta debería proporcionar una reconstrucción convergente estable.

La reconstrucción generada en el último ciclo se utilizará como referencia inicial para un mayor refinamiento. Por último, realice la reconstrucción 3D con refinamiento iterativo utilizando el mapa de densidad 3D generado por I-H-R-S-R como referencia inicial para el refinamiento adicional durante el refinamiento. La simetría helicoidal se fija en la rotación entre las subunidades y la elevación axial, que se determinan a partir del procedimiento I-H-R-S-R.

A continuación, determine el desenfoque y el astigmatismo presentes en la micrografía utilizando los programas CTF find three y CTF tilt utilizando programas de araña denominados FT y mu para multiplicar segmentos de partículas mediante la función de transferencia de contraste. CTF abreviado realiza la coincidencia de proyecciones comparando las proyecciones de los volúmenes de referencia con las imágenes corregidas por CTF mediante la alineación de referencias múltiples. La variación en el ángulo de inclinación fuera de plano se limita a más o menos 10 grados y el muestreo en pasos de un grado introduce restricciones como altos coeficientes de correlación en ángulos planos cercanos a cero grados o 180 grados y desplazamientos X limitados.

Para los parámetros de alineación de cada segmento, incluya en la reconstrucción solo aquellos segmentos que satisfagan las restricciones. Después de cada ciclo de refinamiento iterativo, se genera una reconstrucción 3D utilizando retroproyección y dividida por algunos sobre el CTF al cuadrado imponen la simetría helicoidal para generar un volumen de simetrías. El refinamiento iterativo finaliza cuando no se produce ninguna mejora adicional en la resolución de la nueva reconstrucción 3D.

Se encajonó un solo conjunto de cápside VIH uno, un tubo de 92 e, y se calculó su transformada de Fourier para la indexación helicoidal de los dos radios, se determinaron los números de línea de capa y los radios de amplitud máxima para las líneas de capa uno cero y cero uno. A continuación, se calcularon los valores finales de menos 12 y 11 para un cero y un cero uno respectivamente con una distancia de repetición de 5195,48 angstroms. La simetría del tornillo del tubo se determinó como delta Z igual a 6,81 angstroms y delta cinco igual a 328,88 grados, delta Z y delta cinco se refinaron a 7,13 angstroms y 328,86 grados utilizando I-H-R-S-R y se generó una reconstrucción inicial después de 10 ciclos iterativos.

La reconstrucción final después del refinamiento iterativo mejoró significativamente el mapa de densidad con respecto al modelo inicial calculado con I-H-R-S-R. El mapa de densidad de los tubos de ensamblaje de la cápside se muestra como tres cortes ortogonales paralelos al eje del tubo y cerca de la superficie, perpendiculares al eje del tubo y paralelos y a través del eje del tubo. La estructura mostrada es el resultado de la representación de la superficie del mapa de densidad 3D contorneado a 1,8 Sigma que encierra el 100% del volumen.

Después de ver este video, debería tener una muy buena comprensión de cómo obtener una estructura 3D de una molécula ensamblada aliada utilizando microscopía electrónica de cuervo.