Name: Enhanced reducido Representación bisulfito secuenciación para la Evaluación de la metilación del ADN en la Resolución Base Par (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 47 s
Description: Aprende a generar bibliotecas de secuenciación para análisis de metilación del ADN con resolución de par de bases mediante digestión enzimática y conversión bisulfito. Este método permite detectar patrones de metilación cuantitativos en regiones ricas en CG con alta cobertura.

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Agradecemos a todos los autores del informe original de ERRBS. Agradecemos a Mame Fall por su asistencia técnica. Agradecemos al Núcleo de Epigenómica de la Facultad de Medicina Weill Cornell por sus servicios técnicos y asistencia. El trabajo contó con el apoyo de una beca Judah Folkman de la Fundación Sass, una K08CA169055 del NCI y ASH-AMFDP12005 a FGB, R01HG006798 y R01NS076465 de los NIH, fondos de Irma T. Hirschl y Monique Weill-Caulier Charitable Trusts y STARR Consortium (I7-A765) para CEM, y una subvención LLS SCORE (7006-13) para AMM.

Todos los procedimientos ejecutados son aprobados por la Escuela de Medicina Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión de la Universidad de Indiana y siguen Instituto Nacional de Salud directrices. 1. Técnica quirúrgica <ol><li> Mantenga una técnica aséptica durante este procedimiento mediante el uso de guantes estériles, instrumentos, y un campo quirúrgico estéril de acuerdo con las directrices del NIH 25. Esterilizar las herramientas antes de comenzar la cirugía mediante autoclave (véase la Tabla de específico Reactivos / Equipo para la lista completa). Utilice un esterilizador de perlas de vidrio para esterilizar las herramientas durante la operación. </li></ol> 2. Anestesia y Preparación <ol><li> Anestesiar al ratón en una caja de la anestesia con una mezcla de 0,9 L / min de oxígeno y 2,5% de isoflurano usando un sistema de vaporizador de isoflurano veterinaria. Asegúrese de que el ratón no responde a los cambios en la posición del cuerpo antes de sacarlo de la caja. </li><li> Aplicar pomada oftálmica al mouLos ojos de sí para protegerlos de la desecación. </li><li> Cambie el flujo de gas de la caja para el cono de la nariz. Coloque el ratón en ángulo recto en su lado izquierdo en una almohadilla de cubierta climatizada con una almohadilla quirúrgica y papel absorbente banco con su nariz y la boca en el interior del cono. Monitorear continuamente el ritmo respiratorio del ratón y la velocidad y ajustar los niveles de isoflurano según sea necesario (entre 2,5-3% isoflurano) para mantener un nivel adecuado de anestesia, y usar el pellizco reflejo dedo para confirmar la sedación total. </li></ol> 3. Abordaje quirúrgico <ol><li> Alinear y centrar el estereoscopio con el campo quirúrgico. Ajuste el cono de la nariz y la cinta hacia abajo para que se coloca a lo largo del borde del campo visual. </li><li> Con el ratón acostado en su lado izquierdo, con cinta adhesiva el borde de la oreja derecha al cono de nariz, la exposición del área detrás de la oreja donde se realizará la incisión. Asegúrese de que la vena auricular posterior se desplaza horizontalmente a través de la oreja. Tenga en cuenta que la colocación correcta de tque los animales y la grabación de la oreja son cruciales para encontrar rápidamente el nervio facial. </li><li> Humedezca la piel en y detrás de la oreja con etanol al 70% y afeitar el sitio quirúrgico utilizando una hoja de afeitar o bisturí. Pre-humedecer la piel hace que el afeitado más fácil en esta localización anatómica. </li><li> Limpiar la piel con una solución de yodo, tales como lavado quirúrgico Betadine (7,5% de povidona-yodo), seguido por etanol al 70%. Repita esta limpieza dos veces más para desinfectar a fondo el área. </li><li> Para determinar dónde hacer la incisión, traza la vena auricular posterior de la oreja caudalmente a la zona posterior a la protuberancia oído. Usando tijeras de primavera, hacer una incisión de 4 mm 2 - 3 mm posterior a la protuberancia. </li><li> Diseccionar a través de la grasa subcutánea y la máscara con disección roma. Evite el corte directo con las tijeras porque los vasos sanguíneos o tejido muscular podrían dañarse fácilmente. </li><li> Si se produce sangrado, aplique presión en el sitio de la cirugía con un hisopo de algodón estérildurante al menos 30 seg. Si se produce la pérdida de fluido significativa, inyectar el ratón por vía intraperitoneal con hasta 0,5 ml de solución salina al 0,9% estéril usando una aguja G 25 o 27. </li><li> Utilice varios hitos clave, el nervio espinal accesorio, canal auditivo, y anterior del músculo digástrico (descrito más adelante), para localizar el nervio facial. Diseccionar alrededor de estos puntos de referencia hasta que se visualizan las ramas del nervio facial. El nervio aparecerá como una estructura de sólido blanco significativa cuando se revela y una capa de fascia se adhiere a las estructuras subyacentes. <ol><li> Encuentra el nervio espinal accesorio, que viaja de la porción caudal del cráneo para inervar el músculo trapecio, una vez que la grasa subcutánea y la fascia se han diseccionado. El nervio facial es profundo en el nervio espinal accesorio. </li><li> Encuentra el conducto auditivo cartilaginoso que se ve de color blanco nacarado y se puede ver rostral al nervio facial. </li><li> Encontrar el vientre muscular del músculo digástrico anterior que se encuentra en la parte superior de y caudal al nervio facial. </li></ol></li><li> Cuando se visualizan las principales ramas del nervio facial, rastrearlos dorsal para encontrar su origen en el agujero estilomastoideo. Utilizando pinzas de punta fina Dumont # 5/45 para mantener el lugar de la cirugía abierta, avanzar en las puntas de las tijeras de primavera siguientes trayectoria del nervio, a continuación, mueva las pinzas dorsal para mantener el área recién abierta avanzada. </li><li> Visualice el tronco del nervio facial con el cigomático, bucal, y las ramas mandibulares marginales en este punto. NOTA: La rama temporal se encontrará más cerca del agujero. Las ramas del nervio mandibular marginal en sus partes superior e inferior más cerca de la mandíbula, por lo tanto aquellas ramas nerviosas no serán visibles en este nivel. <ol><li> Si se realiza un corte transversal del nervio, estabilizar el nervio suavemente con las pinzas de punta fina y cortar el nervio con las tijeras de primavera. Evite aplicar demasiada tracción en el nervio con las pinzas para evitar avulsing el nervio del tronco cerebral. Empujarlos tocones de distancia el uno del otro, o cortar y eliminar una porción del nervio distal para asegurar que no se produzca ninguna reconexión. </li><li> Si la realización de una lesión por aplastamiento, utilice Dumont # 5/45 pinzas para comprimir el nervio durante 30 segundos usando una presión constante para cortar todos los axones, repita este flechazo en un segundo ángulo perpendicular al primer sitio de aplastamiento. Evite aplicar cantidades variables de presión durante la aglomeración 30 segundos, de lo contrario el daño será inconsistente entre los animales. </li></ol></li></ol> 4. Cierre y Recuperación <ol><li> Vuelva a colocar la grasa y los músculos de las estructuras subyacentes. </li><li> Aproximar los bordes de la incisión y cerrar la herida usando un clip herida 7,5 mm. Las suturas o pegamento también son aceptables para el cierre de la herida. Analgésicos posquirúrgicas se pueden proporcionar en este momento. </li><li> Retire la cinta de la oreja del ratón. Apague el flujo isoflurano y permitir que el ratón para respirar oxígeno puro durante 30 segundos a 1 minuto. Place el ratón en una jaula vacía, sin ropa de cama para recuperarse de la anestesia. </li><li> Cuando se recupera el ratón, examine su comportamiento en busca de signos de confirmación de la parálisis facial. Los bigotes se paralizaron y en ángulo hacia la mejilla, la nariz se produce una desviación, y el ojo no parpadeará en respuesta a un soplo de aire. </li><li> Animales Casa en conjunto después de la cirugía si son de sexo femenino. Evite de ratones machos de forma conjunta, ya que son más agresivos y tienden a retirar por la fuerza clips de la herida de su cagemate, lo cual lleva a la infección. Proporcionar analgésicos posquirúrgicas en este momento, si es necesario. </li><li> Monitorear los ratones una vez al día durante varios días después de la operación para asegurarse de que no hay infección u otra complicación se produce después de la operación. Retire los clips de la herida 7-10 días después de la cirugía si no han caído por su propia cuenta. </li><li> Aplicar lubricante pomada ocular al ojo afectado diariamente para prevenir complicaciones de la córnea, o bien hasta que el reflejo del parpadeo del ojo es recubierta o hasta la eutanasia. </li></ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses a revelar.

Los datos de resolución rendimientos pares de bases del protocolo presentado de metilación de citosina en regiones genómicas biológicamente relevantes. El protocolo escrito como está optimizado para 50 ng de material de partida, sin embargo, puede ser adaptada para manejar una amplia gama de material de entrada (5 ng o más) 26. Esto requerirá ajustes de algunos de los pasos del protocolo como se ve en la Tabla 6. Las bibliotecas ERRBS son susceptibles de secuenciación final emparejado y aún más la cobertura genómico también se puede lograr mediante secuenciación lee más de 51 ciclos. Secuenciación multiplexada ofrecerá un protocolo de menor costo por muestra, sin embargo, esto se traducirá en una cobertura reducida por sitio CpG representado en los datos (Figura 5 y Tabla 8), y no producir suficiente profundidad de cobertura para realizar análisis que requieren una alta cobertura por CpG sitio (por ejemplo, como se describe por Landan et al. 33). Por último, este protocolo (o cualquier protoco basada en bisulfitol) no puede distinguir entre metil-citosina y-hidroximetil citosina 46,47. Sin embargo, los datos generados se pueden integrar con otro protocolo de resultados 48,49 para delinear las diferentes modificaciones, y otras modificaciones de citosina recientemente reportaron 50, en caso de ser de su interés. Aparecerán bibliotecas de alta calidad, como se muestra en la Figura 3A-C, y una vez combinado para la secuenciación produce una traza como se muestra en la Figura 3G (trazo rojo) que representa contribuciones molares iguales de ambas fracciones de la biblioteca. Insuficiencia preparación de la biblioteca puede resultar de cualquier etapa durante el procedimiento. Si se procesa ADN degradado que se traducirá en las bibliotecas que no están enriquecidas en fragmentos MspI y por lo tanto en la cobertura bajo CpG utilizando los parámetros de secuenciación descritos en este protocolo. Si una enzima no es funcional o inadvertidamente excluidos de una de las reacciones, el protocolo no dió la biblioteca esperado. Si el rea ligaduracción es ineficiente, adaptadores están en una concentración mayor de lo esperado, y / o la concentración de cebadores usado es un reactivo limitante para los pasos de amplificación final, se puede producir el fracaso de la biblioteca. El exceso de adaptadores (visto como picos en ~ 150 pb en los resultados del bioanalizador; Figura 3D-F) en la biblioteca también interferirá con la secuenciación debido al agrupamiento indiscriminado de la biblioteca y el exceso de adaptadores. Mientras que tales una biblioteca puede secuenciar aparentemente normalmente, una porción significativa de la lee será secuencias meramente adaptador. Si se observan exceso de adaptadores en una biblioteca, lo mejor es repetir la preparación de la biblioteca si el material está disponible utilizando material de entrada óptima al adaptador proporciones cuantitativas. Finalmente, para asegurar la amplificación por PCR eficiente de las bibliotecas, las fracciones de la biblioteca inferiores y superiores se mantienen como muestras separadas a lo largo de la conversión de bisulfito y etapas de enriquecimiento de PCR. De no hacerlo, se obtiene la eficacia diferencial de amplificación durante la PCR reacción de fracciones superiores e inferiores (como se ve en la Figura 3G traza azul) y el potencial de representación desigual de la respectiva loci genómico cubierto en cada fracción de la biblioteca durante la secuenciación. El usuario puede optar por incluir un paso de PCR cuantitativa inmediatamente después de la conversión de bisulfito para su posterior titulación de ciclos de PCR óptimos necesarios para amplificar las bibliotecas se generan. ERRBS protocolo de preparación de biblioteca tiene varios pasos clave en el que se recomiendan reactivos específicos. En la etapa de reparación de extremo, el uso de una mezcla de dNTP de cuatro nucleótidos permite extremo reparación de cualquiera de los productos que no contienen el voladizo CG, tales como las resultantes de MspI actividad estrella enzimática y los fragmentos de ADN cortados presentes en la muestra de ADN original. Esto se traduce en una mejor representación CpG en los resultados. En la etapa de ligación es fundamental para utilizar una ligasa alta concentración (2.000.000 unidades / ml) y los adaptadores metilados para asegurar que el Reacti ligaduraen es eficiente y que la conversión de bisulfito no influye en las secuencias esenciales para la alineación de datos precisa de adaptador. En la etapa de PCR, usando una polimerasa capaz de amplificar fragmentos de ADN ricas en GC tratado con bisulfito es necesario para alta especificidad. Por último, para asegurar la eliminación del exceso de adaptadores y cebadores, purificación SPRI talón (por ejemplo: Agencourt AMPure XP) se recomienda en lugar de ensayos basados ​​en columnas para la ligadura y aislamientos de productos de PCR. Con el fin de generar datos de alta calidad, es importante para asegurar la conversión de bisulfito eficiente. El control presentado ofrece al usuario la capacidad de determinar la eficiencia de conversión antes de la secuenciación. Como alternativa, un ADN no humanos tales como ADN lambda se puede utilizar como un control interno (pico-in). Debido a las diferencias en las especies, este tipo de control puede incluirse directamente en la secuenciación de aguas abajo (por ejemplo, tal como se utiliza por Yu, et al. 34). Sin embargo, si el punto de I-ins utilizado, no puede ser utilizado para determinar la eficiencia de conversión antes de la secuenciación de la biblioteca amplificada a menos única e independientemente secuenciado antes de la secuenciación biblioteca. Los tipos de conversión determinados se basan en el estado de metilación en sitios no CpG. Esto puede no ser apropiado para el uso en el contexto de alta metilación de citosina en contexto no CpG (por ejemplo células madre embrionarias) y muestras paralelas o otros medios de evaluación de la eficiencia de conversión puede ser utilizado para este propósito. Hay algunas advertencias a la dirección que son exclusivos de la secuenciación de las bibliotecas ERRBS. Las tres primeras bases de las fracciones de la biblioteca secuenciados son casi uniformemente no aleatoria debido a la sitio de corte reconocimiento MspI (C ^ CGG; véase la Figura 4B, C). Esto resulta en la posibilidad de pérdida de datos importantes debido a la baja calidad lee resultante de una mala localización grupo a pesar de la aparente alta densidad racimo durante la secuenciación. Para superar esta barrera,incluir una biblioteca de alta complejidad en un carril independiente (control PhiX u otro tipo de biblioteca) como un carril de control dedicado. Bibliotecas de alta complejidad tienen extremos que contienen una representación equilibrada de A, C, T y G en los primeros cuatro bases secuenciadas. Carriles de control adecuados incluyen bibliotecas tales como ARN-ss, chip-ss, la secuenciación del genoma, o un control ofrecido por el fabricante de la máquina de secuenciación (por ejemplo v3 control PhiX). Cuando designado como un carril de control para la respectiva ejecución de secuenciación, puede servir como base para la generación de la matriz que se utiliza durante los primeros cuatro bases de secuenciación para detectar posiciones de racimo. La mayor calidad lee capturado elevará la cobertura media por CpG sitio por 5,2 (n = 4). Alternativamente, esta dificultad técnica también se puede superar utilizando un enfoque de secuenciación oscuro como se ha descrito previamente 23. Otros criterios de secuenciación siguen procedimientos operativos estándar por los protocolos del fabricante. Por último, la cobertura por CpG ccalzas para el análisis de datos será guiada por el usuario y, en parte, por las cuestiones biológicas de interés. Umbral de cobertura de 10x proporciona un enfoque de análisis de alta cobertura, sin embargo este umbral se puede bajar debería que ser de interés. Una discusión completa de análisis de datos ERRBS está más allá del alcance de este artículo, sin embargo, diferencialmente citosinas metiladas y regiones pueden determinarse utilizando herramientas de código abierto 31,51-53. Consideraciones de análisis adicionales y enfoques han sido bien descritos 54,55, y se anima al lector a buscar en la literatura para herramientas más adecuadas para el análisis planificado. En comparación con otros métodos publicados, ERRBS ofrece un protocolo de cuatro días que, cuando se lleva a cabo ya que los rendimientos descritos altas tasas de reproducibilidad. Se ha validado en comparación con el estándar de oro MassARRAY EpiTYPER 26 años, es rentable para datos de alta cobertura, y es adaptable a diversos materiales de entradacantidades (favorables para el procesamiento de muestras clínicas y otros tipos de células de baja frecuencia) y enfoques de secuenciación. Se ofrece una resolución de pares de bases en loci biológicamente relevante y se puede utilizar en los análisis de integración con otras técnicas de perfilado factor de transcripción de todo el genoma de unión, remodelación de la cromatina, marcas epigenéticas y otras modificaciones de citosina de interés. El uso de datos ERRBS en tales estudios puede contribuir a un enfoque molecular amplia y permitir para alta análisis dimensionales en el estudio de modelos biológicos y enfermedades humanas.

La metilación del ADN en citosina (5-metilcitosina) es una marca epigenética crítico en células de mamífero para una variedad de procesos biológicos, incluyendo, pero no limitado a la impresión, la inactivación del cromosoma X, el desarrollo, y la regulación de la expresión génica 1-8. El estudio de los patrones de metilación del ADN en los trastornos malignos y otros ha determinado los patrones específicos de la enfermedad y ha contribuido a la comprensión de la patogénesis de la enfermedad y los posibles descubrimientos de biomarcadores 9-17. Hay muchos protocolos que interrogan el epigenoma de estado de metilación del ADN. Estos se pueden dividir en basado afinidad, la enzima de restricción-basan, y ensayos basados ​​conversión-bisulfito que utilizan microarrays o plataformas de secuenciación de aguas abajo. Además, hay algunos protocolos que unen estas categorías generales incluyendo, pero no limitado a, análisis de restricción combinado bisulfito de 18 y representación reducida bisulfito de secuenciación (RRB 19). </p&gt; RRB fue descrito originalmente por Meissner et al. 19,20. El protocolo introdujo un paso para enriquecer regiones genómicas ricas en GC, seguido por secuenciación de bisulfito, lo que resultó en datos de resolución de pares de bases cuantitativa que es rentable 21,22. Las regiones ricas en GC son el blanco de la enzima de restricción MspI (C ^ CGG), y la metilación de citosina se resuelve mediante la conversión de bisulfito de citosinas (desaminación de citosinas no modificados a uracilo), seguido de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). RRB cubrieron la mayoría de los promotores de genes y las islas CpG en una fracción de la secuencia requerida para todo un genoma; sin embargo RRBs tenían cobertura limitada de costas CpG y otras regiones intergénicas de relevancia biológica. Varios grupos han publicado actualizado protocolos RRBs desde el informe original que mejorar en la metodología y cobertura resultante de estas regiones genómicas 23-25. Enhanced Representación reducido bisulfito Sequferencias (ERRBS) incluye modificaciones de preparación de biblioteca y una alineación de datos alternativa de aproximación 26 cuando se compara con los RRB. ERRBS resultó en un mayor número de CpG representadas en los datos generados y el aumento de la cobertura de todas las regiones genómicas interrogado 26. Este método ha sido utilizado para resolver los patrones de metilación del ADN en paciente humano y de otros especímenes de animales 26-30. El protocolo descrito ERRBS ofrece detalles sobre todos los pasos necesarios para la terminación y los datos se generó utilizando ADN humano representante (muestras se obtuvieron a partir de informes anteriores, las muestras de pacientes de-identificado 31, y una muestra de médula ósea CD34 + a partir de un donante humano normal). El protocolo incluye un proceso de selección de tamaño automático, lo que reduce el tiempo de procesamiento por muestra y permite una mayor precisión en la selección de tamaño de la biblioteca. El protocolo combina una serie de técnicas de biología molecular establecidas. ADN de alto peso molecular se digiere wITH una enzima de restricción insensible a metilación (MspI), seguido de la reparación final, A-tizón, y ligación de adaptadores metilados. Selección del tamaño de los fragmentos ricos en GC es seguido por la conversión de bisulfito y la amplificación PCR antes de la secuenciación. Conversión de bisulfito se ha descrito previamente 32 y revisión detallada de análisis y aplicaciones de datos está más allá del alcance de este trabajo, sin embargo se incluyen recomendaciones y referencias para el uso de los lectores. El protocolo se puede realizar en cuatro días y es susceptible de pequeña entrada (50 ng o menos) las cantidades de material. El protocolo ya que los rendimientos descritos de datos con alta cobertura por sitio CpG suficiente no sólo para las determinaciones diferenciales sitio de metilación y la región, sino también para la detección de polimorfismo epigenética como se describe por Landan, et al. 33.

<table><tbody><tr><td>MspI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0106M</td><td>100.000 unidades/ml</td></tr><tr><td>NEBuffer 2</td><td>New England Biolabs</td><td>B7002S</td><td>Tampón de reacción para la enzima MspI; paso del protocolo 1.2</td></tr><tr><td>Solución de fenol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4557</td><td>Equilibrado con 10&nbsp; mM Tris HCl, pH&nbsp; 8.0; Consulte las instrucciones de seguridad y manejo en http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p4557</td></tr><tr><td>Cloroformo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2432</td><td>Consulte las instrucciones de seguridad y manejo en http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/c2432</td></tr><tr><td>Glucógeno</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1767</td><td>19-22 mg/ml</td></tr><tr><td>NaOAc</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7899</td><td>3 M, pH 5,2</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td>200 proof, para biología molecular</td></tr><tr><td>Tampón EB</td><td>Qiagen</td><td>19086</td><td>10 mM Tris-Cl, pH 8,5</td></tr><tr><td>tris(hidroximetil)aminometano (Tris)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td>preparar una solución de 1 M, pH 8,5</td></tr><tr><td>Tris- Etilendiaminoácido tetraacético (TE)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9285</td><td>Diluir a 1x solución tampón según las recomendaciones</td></tr> <tr><td>del fabricanteT4 Tampón de reacción de ADN ligasa</td><td>New England Biolabs</td><td>B0202S</td> Concentración <td>10x</td></tr><tr><td>Mezcla de solución de trifosfato desoxinucleótido (dNTP)</td><td>New England Biolabs</td><td>N0447L</td><td>10 mM cada nucleótido</td></tr><tr><td>ADN polimerasa T4</td><td>New England Biolabs</td><td>M0203L</td><td>3.000 unidades/ml</td></tr><tr><td>ADN polimerasa I, fragmento grande (Klenow)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0210L</td><td>5.000 unidades/ml</td></tr><tr><td>Polinucleótido quinasa T4</td><td>New England Biolabs</td><td>M0201L</td><td>10.000 unidades/ml</td></tr><tr><td>QIAquick PCR Kit de purificación</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>Se utiliza para la purificación de productos de ADN en el paso del protocolo 2.3</td></tr><tr><td>2'-desoxiadenosina 5'-trifosfato (dATP)</td><td>Promega</td><td>U1201</td><td>100 mM</td></tr><tr><td>Klenow Fragment (3'&rarr; 5' exo-)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0212L</td><td>5.000 unidades/ml</td></tr><tr><td>MinElute PCR Kit de purificación</td><td>Qiagen</td><td>28004</td><td>Se utiliza para la purificación de productos de ADN en el paso del protocolo 3.3</td></tr><tr><td>T4 ADN ligasa</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202M</td><td>2.000.000 unidades/ml</td></tr><tr><td>Adaptador de metilación Oligo Kit</td><td>Illumina</td><td>ME-100-0010</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td>Se utiliza en secciones de protocolo que implementan pasos de purificación de perlas magnéticas (pasos 4.3 y 8.2). Equilibre a temperatura ambiente antes de usar.</td></tr><tr><td>Casetes de gel Pippin Prep, 2% de agarosa, sin colorantes</td><td>Sage Science</td><td>CDF2010</td><td>con estándares internos</td></tr><tr><td>Certificado Low Range Ultra Agarose</td><td>Bio-Rad</td><td>161-3106</td><td></td></tr><tr><td>Tampón Tris-Borato-EDTA (TBE)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4415</td><td></td></tr><tr><td>Solución de bromuro de etidio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1510</td><td>10 mg/ml</td></tr><tr><td>50 pb Escalera de ADN</td><td>NEB</td><td>N3236S</td><td></td></tr><tr><td>Escalera de ADN de 100 bp</td><td>NEB</td><td>N3231S</td><td></td></tr><tr><td>Tinte de carga de gel, naranja (6x)</td><td>NEB</td><td>B7022S</td><td></td></tr><tr><td>Bisturí&nbsp; Cuchilla&nbsp; No.&nbsp; 11</td><td>Fisher Scientific</td><td>3120030</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Kit de extracción de gel</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Kit de metilación del ADN EZ</td><td>Zymo Research</td><td>D5001</td><td>Utilizado en el paso del protocolo 6.2</td></tr><tr><td>Kit de metilación-relámpago del ADN EZ</td><td>Zymo Research</td><td>D5030</td><td>Alternativa para el paso 6.2</td></tr><tr><td>Estándar universal de ADN humano metilado</td><td>Zymo Research</td><td>D5011</td><td>Se utiliza como control de conversión de bisulfito</td></tr><tr><td>Sistema de PCR de alta fidelidad FastStart</td> Kit de ensayo de alta sensibilidad <td>de Roche</td><td>03553426001</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA</td><td>Life Technologies</td><td>Q32854</td><td>Un ensayo de cuantificación de ADN basado en fluorescencia; utilizado en los pasos del protocolo 1.1, 9.1 y 10.1</td></tr><tr><td>Imán DynaMag-2 Life</td><td>Technologies</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Kit de ADN de alta sensibilidad</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>2100 Bioanalizador</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PhiX Control v3</td><td>Illumina</td><td>FC-110-3001</td><td></td></tr><tr><td>HiSeq 2500</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pippin Prep</td><td>Sage Science</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qubit 2.0 Fluorímetro</td><td>Life Technologies</td><td>Q32872</td><td></td></tr><tr><td>TruSeq SR Cluster Kit v3-cBot-HS</td><td>Illumina</td><td>GD-401-3001</td><td></td></tr><tr><td>TruSeq SBS Kit v3-HS</td><td>Illumina</td><td>FC-401-3002</td><td></td></tr><tr><td>TruSeq Preparación de muestras de ARN</td><td>Illumina</td><td>RS-122-2001</td><td>Adaptadores con código de barras utilizados para bibliotecas de multiplexación; Consulte Archivo complementario para el protocolo de multiplexación.</td></tr><tr><td>Microcentrífuga</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mezclador</td><td></td><td></td><td></td>de vórtice</tr><tr><td>Calentador de bloque seco Termociclador</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Baño de agua Sistema</td><td></td><td></td><td></td></tr> de <tr><td>electroforesis de</td><td></td><td></td><td></td>gel</tr><tr><td>Fuente de alimentación de electroforesis Documento</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>de gel</td><td></td><td></td></tr><tr>Transiluminador <td></td><td></td><td></td><td>de luz UV o azul</td></tr></tbody></table>

enhanced reducido representación bisulfito secuenciación para la evaluación de la metilación del adn en la resolución base par

Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing for Assessment of DNA Methylation at Base Pair Resolution

ADN mapeo patrón de metilación se estudia en gran medida en los tejidos normales y enfermos. Una variedad de métodos se han establecido para interrogar a los patrones de metilación de citosina en las células. Representación reducida de toda la secuenciación del genoma de bisulfito fue desarrollado para detectar pares de bases patrones de metilación de citosina resolución cuantitativos en loci genómica GC-ricos. Esto se logra mediante la combinación del uso de una enzima de restricción seguido por la conversión de bisulfito. Enhanced representación reducida bisulfito de secuenciación (ERRBS) aumenta el loci genómico biológicamente relevante cubierto y se ha utilizado para perfil de metilación de citosina en el ADN de humano, ratón y otros organismos. ERRBS inicia con la restricción de la digestión enzimática de ADN para generar fragmentos de bajo peso molecular para uso en la preparación de la biblioteca. Estos fragmentos se someten a la construcción de bibliotecas estándar para la secuenciación de próxima generación. Bisulfito de conversión de citosinas no metiladas antes de la última amplificatide paso permite la resolución de base cuantitativa de los niveles de metilación de citosina en loci genómicos cubierto. El protocolo puede ser completada dentro de cuatro días. A pesar de baja complejidad en los primeros tres bases secuenciadas, bibliotecas ERRBS producen datos de alta calidad cuando se utiliza un carril de control de secuencia designada. Análisis de la cartografía y la bioinformática se realiza entonces y produce datos que se puede integrar fácilmente con una variedad de plataformas en todo el genoma. ERRBS puede utilizar pequeñas cantidades de material de entrada por lo que es factible para procesar las muestras clínicas humanas y aplicable en una amplia gama de aplicaciones de investigación. El video producido demuestra los pasos críticos del protocolo ERRBS.

Secuenciación de bisulfito de representación reducida mejorada es un método para la preparación de bibliotecas de secuenciación para el análisis de metilación del ADN basado en la digestión de enzimas de restricción combinada con la conversión de bisulfito de citosina. Este protocolo requiere 50 ng de material de partida y produce datos de resolución de pares de bases en regiones genómicas ricas en GC.

Enhanced reducido Representación bisulfito secuenciación para la Evaluación de la metilación del ADN en la Resolución Base Par

DNA methylation pattern mapping is heavily studied in normal and diseased tissues. A variety of methods have been established to interrogate the cytosine ...

El objetivo general de este procedimiento es generar bibliotecas de secuenciación para la resolución de pares de bases D-N-A-C-P-G, análisis de metilación basado en la digestión de enzimas de restricción combinada con citosina por conversión de sulfitos. Esto se logra realizando primero la digestión de una enzima de restricción MSP de ADN de alta calidad, seguida de la reparación final, una cola y ligadura de adaptadores metilados. El siguiente paso es realizar la conversión de sulfito en fragmentos seleccionados de tamaño y luego mediante conversión de sulfito.Los fragmentos se amplifican mediante PCR. El paso final es realizar el control de calidad y la secuenciación, seguido de la visualización y el análisis de datos. En última instancia, la representación reducida mejorada de la secuenciación de bisulfito detecta la resolución cuantitativa del par de bases de los patrones de metilación de citidina en loci genómicos ricos en CG.La principal ventaja de esta técnica sobre otros métodos de metilación del ADN, como los microarrays, es que puede utilizar pequeñas cantidades de material de entrada para generar datos de metilación D-N-A-C-P-G de alta cobertura con resolución de pares de bases y sitios biológicamente relevantes. La primera vez que tuvimos la idea de este método fue cuando nos interesaba explorar los patrones epigenéticos más allá de las regiones cubiertas por los ensayos tradicionales. Estábamos interesados en desarrollar esta técnica para la transición de microarrays a la generación de datos de metilación de ADN con resolución de pares de bases que pudieran integrarse con datos generados a partir de otras técnicas de próxima generación.Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la epigenética. Por ejemplo, el patrón epigenético y la heterogeneidad en las muestras biológicas en comparación con los controles normales u otros estados de enfermedad. Por lo general, las personas nuevas en este método lo encontrarán desafiante debido a la duración del procedimiento, los numerosos requisitos específicos y las características de secuenciación únicas de las bibliotecas generadas por la caída de Mamie.Un especialista en investigación de nuestro laboratorio asistirá en la demostración del procedimiento para comenzar este protocolo. En primer lugar, prepare alícuotas purificadas de muestras de ADN genómico que hayan sido sometidas a una digestión de enzima de restricción MSP, una reacción de reparación de extremo romo y una sola adición de nucleótido en los tres extremos principales. En este punto, los productos de ADN estarán listos para que las ligaduras adaptadoras comiencen a transferir 10 microlitros de la muestra A-A-L-D-N-A a a un tubo de PCR de 0,2 mililitros y colocar el tubo en hielo.Además, coloque una alícuota de las moléculas adaptadoras en hielo. A continuación, prepare la mezcla de reactivos de ligadura en hielo. Añada el reactivo de ligadura y las moléculas adaptadoras a la muestra de ADN y pipetee hacia arriba y hacia abajo unas cuantas veces para mezclar.Coloque un tubo de PCR en un termociclador y deje que la reacción de ligadura continúe durante la noche a 16 grados centígrados al día siguiente. Purifique los productos de ligadura utilizando un kit de extracción de ADN en fase sólida basado en perlas magnéticas o columnas de sílice. En el último paso del proceso de purificación.Eluir el ADN añadiendo 30 microlitros de agua libre de ADN. El producto de ADN purificado se puede almacenar a 20 grados centígrados negativos hasta que se necesite para las muestras, que comenzaron con el ADN total de 25 nanogramos o más. Utilice un aparato automatizado de extracción de gel, como el PI y la preparación, para seleccionar productos ligados con longitudes entre 150 y 400 pares de bases.Asegúrese de excluir los tintes de visualización de ADN, como el bromuro de Ethereum o el verde cibernético del casete agros, ya que pueden alterar las propiedades de migración del ADN de los fragmentos unidos al adaptador bifurcado. Los protocolos estándar de selección de tamaño basados en gel de agros también se pueden utilizar para este paso del protocolo para configurar la electroforesis de ADN en un casete de aros sin colorante al 2% de pippina. Cree un nuevo protocolo en la consola de Pippin Prep y seleccione la opción L del marcador 2%DF como casete de su elección.A continuación, habilite la opción usar estándares internos y verifique que el número de carril de referencia coincida con los números de carril para aislar fragmentos de ADN que van desde 150 pares de bases hasta 400 pares de bases. Seleccione la opción de rango como modo de recolección e ingrese los siguientes parámetros de límite: 135 para el inicio del par base, 410 para el final del par base y 240 para las patas del par base. Esto indica al aparato que alinee el campo electroforético con el puerto de salida de electroelución.Cuando los fragmentos de ADN dentro de ese rango viajan cerca de las proximidades de la salida. Después de guardar el archivo de protocolo, prepare el casete de gel y los pocillos de carga de muestras del instrumento siguiendo los procedimientos operativos estándar de Pippen Prep al configurar el instrumento. Prepare las muestras de ADN para la electroforesis añadiendo 10 microlitros del marcador de ADN a una alícuota de 30 microlitros de una muestra dada después de la ligadura para cargar las mezclas en el casete de gel.En primer lugar, extraiga 40 microlitros del tampón de electroforesis de cada muestra. A continuación, reemplace el volumen pipeteando cada mezcla de marcador de muestra de 40 microlitros en pocillos individuales. Volviendo a la consola, cargue el protocolo guardado y pulse iniciar para iniciar la electroforesis.Cuando el programa alcance el par de bases 240, haga una pausa en el paso para recoger manualmente 40 microlitros de la salida de cada puerto de salida con una pipeta. Etiquete estas fracciones como la fracción inferior de la biblioteca. Después de recoger las fracciones de la biblioteca inferior, lave inmediatamente los puertos de salida añadiendo 40 microlitros de tampón de electroforesis fresco.Pipetear el tampón hacia arriba y hacia abajo al menos tres veces y, a continuación, aspirar la red. Repita este lavado dos veces más para eliminar todos los rastros de especies de ADN de longitud corta de las salidas. Ahora agregue 40 microlitros de tampón de electroforesis a la muestra.Bueno, selle los puertos elucian y presione el botón ejecutar para reanudar el proceso eluciano. Al finalizar el programa Ellucian en la configuración de par base 410, recoja los 40 microlitros de inuit de todos los puertos de salida y etiquete estas fracciones como la fracción superior de la biblioteca. En este punto, ambas fracciones de la biblioteca se purifican en gel y ya están para la conversión de bisulfito.Utilizando un kit disponible en el mercado, realice el ensayo de conversión de bisulfito en ambas fracciones de la biblioteca. En el paso final del proceso de conversión, eluir las muestras de ADN en 40 microlitros de agua libre de ADN. Después de la conversión de bisulfito, los fragmentos de la biblioteca de ADN resultantes se someterán a una amplificación por PCR de enriquecimiento utilizando cebadores que se hibridan en los extremos adaptadores de cada molécula de ADN.Para prepararse primero para la PCR de enriquecimiento, agregue 160 microlitros de la mezcla maestra de PCR a cada alícuota de 40 microlitros de una muestra convertida en sulfuro dada. A continuación, divida la mezcla resultante de 200 microlitros en cuatro alícuotas de 50 microlitros. En tubos de PCR separados.Coloque los tubos en un termociclador y amplifique la plantilla de ADN convertida. Después del enriquecimiento, extraiga los cuatro productos posteriores a la PCR en un solo tubo de 1,5 mililitros y purifique el ADN con un kit de limpieza de PCR comercial. Si se utiliza un kit de extracción en fase sólida con perlas magnéticas para purificar los productos de PCR, modifique los procedimientos operativos estándar mezclando primero los productos de PCR de la biblioteca inferior combinados con 1,7 veces su volumen total en perlas.A continuación, mezcle los productos PCR de la biblioteca superior combinada con 1,1 veces su volumen total en perlas. A continuación, siga el protocolo del fabricante hasta los pasos de lavado con etanol al 70%, donde cada uno de los volúmenes de lavado debe cambiarse a 800 microlitros en el último paso del proceso de purificación. Eluir el ADN con 50 microlitros de tampón de elución libre de ADN.Almacene las bibliotecas purificadas a 20 grados centígrados negativos hasta que se necesiten, utilizando un ensayo selectivo basado en fluorescencia para el ADN bicatenario, cuantifique la cantidad de contenido de ADN posterior al enriquecimiento para cada fracción de la biblioteca. Además, evalúe el tamaño y la calidad de la biblioteca posterior al enriquecimiento con un bioanalizador. Calcule la molaridad efectiva de ADN de una fracción de biblioteca particular utilizando la longitud promedio de ADN expresada en pares de bases.Una vez que se conoce la molaridad, se utiliza el agua libre del ADN para diluir cada fracción superior e inferior de la biblioteca correspondiente hasta una concentración final de dos nanomolares. Combine los pares de biblioteca inferior y superior en un solo tubo para crear una mezcla de biblioteca de dos agujeros nanomolares de 20 microlitros cada uno. La muestra agrupada ya está lista para una ejecución de secuenciación.En los ensayos relacionados con la secuenciación, incluido el E-R-R-B-S, la calidad y la distribución del tamaño de las moléculas de la biblioteca superior e inferior son factores clave para determinar la calidad de los datos finales de secuenciación. En comparación con los protocolos tradicionales de extracción manual de gel, el aparato automatizado de extracción de gel utilizado en el protocolo E-R-R-B-S producirá una distribución de tamaño consistente y minimizará el potencial de contaminación entre muestras. A continuación, al enviar las moléculas de biblioteca convertidas en sulfito BIS para la secuenciación, los datos sin procesar de todas las hebras de ADN muestran que, para cualquier hebra dada, la calidad de los datos para cada posición de nucleótido aumenta drásticamente justo después de los primeros tres nucleótidos.Dado que la secuencia de consenso para estos tres nucleótidos se establece con CGG para la gran mayoría de las moléculas de la biblioteca, los datos sugieren que el protocolo E-R-R-B-S ha producido una colección de biblioteca que contiene un conjunto deseable de fragmentos genómicos que están predominantemente flanqueados. Con MSP, un resumen de restricción termina a vista de pájaro. El protocolo E-R-R-B-S puede proporcionar datos de resolución de pares de bases de los sitios de metilación de citidina en todo el genoma.Por ejemplo, aquí se muestra el cromosoma 12. El protocolo cubre una representación reducida de las GPC de todo el genoma. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar bibliotecas E-R-R-B-S para la generación de datos de metilación D-N-A-C-P-G de resolución base una vez dominada, esta técnica se puede realizar en cuatro días si se realiza correctamente.Al intentar este procedimiento, es importante recordar comenzar con ADN de alta calidad, incluir todos los pasos descritos, validar la eficiencia de la conversión de bisulfato y secuenciar utilizando los parámetros recomendados. No olvide que trabajar con fenilo y cloroformo puede ser extremadamente peligroso. Siempre se deben tomar precauciones comunes, como trabajar en una campana química y tener una eliminación de desechos adecuada mientras se realiza este procedimiento.Siguiendo este procedimiento. Se pueden realizar otros métodos, como la secuenciación por espectroscopia o el epitipo de matriz de masas, para validar los hallazgos. Además, se puede realizar un perfil de expresión génica para determinar la importancia biológica de los patrones de metilación del ADN detectados.La capacidad de generar patrones de metilación y ADN con resolución de pares de bases a partir de cantidades limitadas de materiales de entrada ha permitido el perfil de poblaciones de células raras nunca antes posible. También ha hecho posible el perfil de grandes cohortes de muestras clínicas para la exploración de la regulación mediada por epigenética y la heterogeneidad de la enfermedad.

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Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

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