Enhanced reducido Representación bisulfito secuenciación para la Evaluación de la metilación del ADN en la Resolución Base Par

El objetivo general de este procedimiento es generar bibliotecas de secuenciación para la resolución de pares de bases D-N-A-C-P-G, análisis de metilación basado en la digestión de enzimas de restricción combinada con citosina por conversión de sulfitos. Esto se logra realizando primero la digestión de una enzima de restricción MSP de ADN de alta calidad, seguida de la reparación final, una cola y ligadura de adaptadores metilados. El siguiente paso es realizar la conversión de sulfito en fragmentos seleccionados de tamaño y luego mediante conversión de sulfito.

Los fragmentos se amplifican mediante PCR. El paso final es realizar el control de calidad y la secuenciación, seguido de la visualización y el análisis de datos. En última instancia, la representación reducida mejorada de la secuenciación de bisulfito detecta la resolución cuantitativa del par de bases de los patrones de metilación de citidina en loci genómicos ricos en CG.

La principal ventaja de esta técnica sobre otros métodos de metilación del ADN, como los microarrays, es que puede utilizar pequeñas cantidades de material de entrada para generar datos de metilación D-N-A-C-P-G de alta cobertura con resolución de pares de bases y sitios biológicamente relevantes. La primera vez que tuvimos la idea de este método fue cuando nos interesaba explorar los patrones epigenéticos más allá de las regiones cubiertas por los ensayos tradicionales. Estábamos interesados en desarrollar esta técnica para la transición de microarrays a la generación de datos de metilación de ADN con resolución de pares de bases que pudieran integrarse con datos generados a partir de otras técnicas de próxima generación.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la epigenética. Por ejemplo, el patrón epigenético y la heterogeneidad en las muestras biológicas en comparación con los controles normales u otros estados de enfermedad. Por lo general, las personas nuevas en este método lo encontrarán desafiante debido a la duración del procedimiento, los numerosos requisitos específicos y las características de secuenciación únicas de las bibliotecas generadas por la caída de Mamie.

Un especialista en investigación de nuestro laboratorio asistirá en la demostración del procedimiento para comenzar este protocolo. En primer lugar, prepare alícuotas purificadas de muestras de ADN genómico que hayan sido sometidas a una digestión de enzima de restricción MSP, una reacción de reparación de extremo romo y una sola adición de nucleótido en los tres extremos principales. En este punto, los productos de ADN estarán listos para que las ligaduras adaptadoras comiencen a transferir 10 microlitros de la muestra A-A-L-D-N-A a a un tubo de PCR de 0,2 mililitros y colocar el tubo en hielo.

Además, coloque una alícuota de las moléculas adaptadoras en hielo. A continuación, prepare la mezcla de reactivos de ligadura en hielo. Añada el reactivo de ligadura y las moléculas adaptadoras a la muestra de ADN y pipetee hacia arriba y hacia abajo unas cuantas veces para mezclar.

Coloque un tubo de PCR en un termociclador y deje que la reacción de ligadura continúe durante la noche a 16 grados centígrados al día siguiente. Purifique los productos de ligadura utilizando un kit de extracción de ADN en fase sólida basado en perlas magnéticas o columnas de sílice. En el último paso del proceso de purificación.

Eluir el ADN añadiendo 30 microlitros de agua libre de ADN. El producto de ADN purificado se puede almacenar a 20 grados centígrados negativos hasta que se necesite para las muestras, que comenzaron con el ADN total de 25 nanogramos o más. Utilice un aparato automatizado de extracción de gel, como el PI y la preparación, para seleccionar productos ligados con longitudes entre 150 y 400 pares de bases.

Asegúrese de excluir los tintes de visualización de ADN, como el bromuro de Ethereum o el verde cibernético del casete agros, ya que pueden alterar las propiedades de migración del ADN de los fragmentos unidos al adaptador bifurcado. Los protocolos estándar de selección de tamaño basados en gel de agros también se pueden utilizar para este paso del protocolo para configurar la electroforesis de ADN en un casete de aros sin colorante al 2% de pippina. Cree un nuevo protocolo en la consola de Pippin Prep y seleccione la opción L del marcador 2%DF como casete de su elección.

A continuación, habilite la opción usar estándares internos y verifique que el número de carril de referencia coincida con los números de carril para aislar fragmentos de ADN que van desde 150 pares de bases hasta 400 pares de bases. Seleccione la opción de rango como modo de recolección e ingrese los siguientes parámetros de límite: 135 para el inicio del par base, 410 para el final del par base y 240 para las patas del par base. Esto indica al aparato que alinee el campo electroforético con el puerto de salida de electroelución.

Cuando los fragmentos de ADN dentro de ese rango viajan cerca de las proximidades de la salida. Después de guardar el archivo de protocolo, prepare el casete de gel y los pocillos de carga de muestras del instrumento siguiendo los procedimientos operativos estándar de Pippen Prep al configurar el instrumento. Prepare las muestras de ADN para la electroforesis añadiendo 10 microlitros del marcador de ADN a una alícuota de 30 microlitros de una muestra dada después de la ligadura para cargar las mezclas en el casete de gel.

En primer lugar, extraiga 40 microlitros del tampón de electroforesis de cada muestra. A continuación, reemplace el volumen pipeteando cada mezcla de marcador de muestra de 40 microlitros en pocillos individuales. Volviendo a la consola, cargue el protocolo guardado y pulse iniciar para iniciar la electroforesis.

Cuando el programa alcance el par de bases 240, haga una pausa en el paso para recoger manualmente 40 microlitros de la salida de cada puerto de salida con una pipeta. Etiquete estas fracciones como la fracción inferior de la biblioteca. Después de recoger las fracciones de la biblioteca inferior, lave inmediatamente los puertos de salida añadiendo 40 microlitros de tampón de electroforesis fresco.

Pipetear el tampón hacia arriba y hacia abajo al menos tres veces y, a continuación, aspirar la red. Repita este lavado dos veces más para eliminar todos los rastros de especies de ADN de longitud corta de las salidas. Ahora agregue 40 microlitros de tampón de electroforesis a la muestra.

Bueno, selle los puertos elucian y presione el botón ejecutar para reanudar el proceso eluciano. Al finalizar el programa Ellucian en la configuración de par base 410, recoja los 40 microlitros de inuit de todos los puertos de salida y etiquete estas fracciones como la fracción superior de la biblioteca. En este punto, ambas fracciones de la biblioteca se purifican en gel y ya están para la conversión de bisulfito.

Utilizando un kit disponible en el mercado, realice el ensayo de conversión de bisulfito en ambas fracciones de la biblioteca. En el paso final del proceso de conversión, eluir las muestras de ADN en 40 microlitros de agua libre de ADN. Después de la conversión de bisulfito, los fragmentos de la biblioteca de ADN resultantes se someterán a una amplificación por PCR de enriquecimiento utilizando cebadores que se hibridan en los extremos adaptadores de cada molécula de ADN.

Para prepararse primero para la PCR de enriquecimiento, agregue 160 microlitros de la mezcla maestra de PCR a cada alícuota de 40 microlitros de una muestra convertida en sulfuro dada. A continuación, divida la mezcla resultante de 200 microlitros en cuatro alícuotas de 50 microlitros. En tubos de PCR separados.

Coloque los tubos en un termociclador y amplifique la plantilla de ADN convertida. Después del enriquecimiento, extraiga los cuatro productos posteriores a la PCR en un solo tubo de 1,5 mililitros y purifique el ADN con un kit de limpieza de PCR comercial. Si se utiliza un kit de extracción en fase sólida con perlas magnéticas para purificar los productos de PCR, modifique los procedimientos operativos estándar mezclando primero los productos de PCR de la biblioteca inferior combinados con 1,7 veces su volumen total en perlas.

A continuación, mezcle los productos PCR de la biblioteca superior combinada con 1,1 veces su volumen total en perlas. A continuación, siga el protocolo del fabricante hasta los pasos de lavado con etanol al 70%, donde cada uno de los volúmenes de lavado debe cambiarse a 800 microlitros en el último paso del proceso de purificación. Eluir el ADN con 50 microlitros de tampón de elución libre de ADN.

Almacene las bibliotecas purificadas a 20 grados centígrados negativos hasta que se necesiten, utilizando un ensayo selectivo basado en fluorescencia para el ADN bicatenario, cuantifique la cantidad de contenido de ADN posterior al enriquecimiento para cada fracción de la biblioteca. Además, evalúe el tamaño y la calidad de la biblioteca posterior al enriquecimiento con un bioanalizador. Calcule la molaridad efectiva de ADN de una fracción de biblioteca particular utilizando la longitud promedio de ADN expresada en pares de bases.

Una vez que se conoce la molaridad, se utiliza el agua libre del ADN para diluir cada fracción superior e inferior de la biblioteca correspondiente hasta una concentración final de dos nanomolares. Combine los pares de biblioteca inferior y superior en un solo tubo para crear una mezcla de biblioteca de dos agujeros nanomolares de 20 microlitros cada uno. La muestra agrupada ya está lista para una ejecución de secuenciación.

En los ensayos relacionados con la secuenciación, incluido el E-R-R-B-S, la calidad y la distribución del tamaño de las moléculas de la biblioteca superior e inferior son factores clave para determinar la calidad de los datos finales de secuenciación. En comparación con los protocolos tradicionales de extracción manual de gel, el aparato automatizado de extracción de gel utilizado en el protocolo E-R-R-B-S producirá una distribución de tamaño consistente y minimizará el potencial de contaminación entre muestras. A continuación, al enviar las moléculas de biblioteca convertidas en sulfito BIS para la secuenciación, los datos sin procesar de todas las hebras de ADN muestran que, para cualquier hebra dada, la calidad de los datos para cada posición de nucleótido aumenta drásticamente justo después de los primeros tres nucleótidos.

Dado que la secuencia de consenso para estos tres nucleótidos se establece con CGG para la gran mayoría de las moléculas de la biblioteca, los datos sugieren que el protocolo E-R-R-B-S ha producido una colección de biblioteca que contiene un conjunto deseable de fragmentos genómicos que están predominantemente flanqueados. Con MSP, un resumen de restricción termina a vista de pájaro. El protocolo E-R-R-B-S puede proporcionar datos de resolución de pares de bases de los sitios de metilación de citidina en todo el genoma.

Por ejemplo, aquí se muestra el cromosoma 12. El protocolo cubre una representación reducida de las GPC de todo el genoma. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar bibliotecas E-R-R-B-S para la generación de datos de metilación D-N-A-C-P-G de resolución base una vez dominada, esta técnica se puede realizar en cuatro días si se realiza correctamente.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar comenzar con ADN de alta calidad, incluir todos los pasos descritos, validar la eficiencia de la conversión de bisulfato y secuenciar utilizando los parámetros recomendados. No olvide que trabajar con fenilo y cloroformo puede ser extremadamente peligroso. Siempre se deben tomar precauciones comunes, como trabajar en una campana química y tener una eliminación de desechos adecuada mientras se realiza este procedimiento.

Siguiendo este procedimiento. Se pueden realizar otros métodos, como la secuenciación por espectroscopia o el epitipo de matriz de masas, para validar los hallazgos. Además, se puede realizar un perfil de expresión génica para determinar la importancia biológica de los patrones de metilación del ADN detectados.

La capacidad de generar patrones de metilación y ADN con resolución de pares de bases a partir de cantidades limitadas de materiales de entrada ha permitido el perfil de poblaciones de células raras nunca antes posible. También ha hecho posible el perfil de grandes cohortes de muestras clínicas para la exploración de la regulación mediada por epigenética y la heterogeneidad de la enfermedad.