Name: Generación de microambientes celulares multicue mediante fotopatronaje UV de sustratos de cultivo celular tridimensional (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-02T14:20:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Aprende a generar microambientes celulares multicue mediante fotopatronaje UV en sustratos tridimensionales de PDMS. Este método permite estudiar sistemáticamente cómo las células responden a señales extracelulares combinadas.

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Agradecemos al Dr. Nello Formisano (MERLN Institute for Technology-Inspired Regenerative Medicine) por proporcionar queratocitos primarios humanos. Este trabajo ha sido apoyado por el Chemelot InSciTe (proyecto BM3.02); el Consejo Europeo de Investigación (subvención 851960); y el Ministerio de Educación, Cultura y Ciencia para el Programa de Gravitación 024.003.013 "Regeneración Impulsada por Materiales". Los autores desean agradecer a Alvéole por su correspondencia, ayuda y solución de problemas.

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Hoy en día, el comportamiento celular se estudia a menudo en sustratos de cultivo plano que carecen de la complejidad del microambiente celular nativo. Los entornos 3D como andamios e hidrogeles se utilizan como alternativa. Aunque estos entornos de cultivo celular mejoran la relevancia in vivo, tanto los estudios sistemáticos del comportamiento celular como la viabilidad de los métodos de lectura siguen siendo un desafío. Para investigar sistemáticamente el comportamiento celular en sustratos de cultivo representativos, se necesitan sustratos multicue consistentes que permitan la lectura microscópica. Por lo tanto, en este protocolo, describimos un método para crear sustratos de cultivo celular multicue con geometrías fisiológicamente relevantes y proteínas ECM modeladas. El principal desafío en la combinación de señales ambientales como la geometría de tejidos y las señales de guía de contacto en plataformas in vitro es en gran medida de naturaleza tecnológica. Los métodos convencionales para aplicar señales de guía de contacto (por ejemplo, litografía blanda, patrones UV profundos e impresiónde microcontacto 35,36) a materiales de cultivo celular se han optimizado para sustratos planos. La necesidad de materiales de cultivo celular 3D combinados con señales de guía de contacto destacó varios desafíos tecnológicos, como la mala alineación de patrones, la resolución y la flexibilidad. Para superar estos desafíos, se puede utilizar un método de modelado de alto rendimiento, sin máscaras y basado en la luz45,49. Aquí, un microscopio óptico permite una alineación precisa del patrón y una resolución del orden de micrómetros (ver Figura 6). Además, el uso de una máscara digital permite a los investigadores estudiar el comportamiento celular en una amplia gama de patrones sin la necesidad de fabricar máscaras físicas que requieren mucha mano de obra.
El enfoque de fotopatronaje UV se puede utilizar en combinación con una variedad de geometrías 3D (por ejemplo, cilindros, sillines, cúpulas, pozos) producidas a partir de una variedad de materiales48. Los sustratos de cultivo celular 3D utilizados en este estudio están hechos de PDMS; sin embargo, también se pueden utilizar otros materiales. Esto podría requerir diferentes pasos para producir el sustrato final de cultivo celular que contenga las características de interés. Dado que se ha demostrado que las células son sensibles a la rugosidad superficial de los materiales de cultivo celular, es importante crear los chips de cultivo celular con una superficie lisa para que la respuesta de las células observadas pueda ser totalmente atribuible a la geometría 3D y las señales de guía de contacto50,51. Se pueden utilizar métodos de medición como la profilometría óptica, la microscopía electrónica de barrido o la microscopía de fuerza atómica para medir la rugosidad de la superficie. Después de la fabricación del material de cultivo celular, se puede seleccionar un método de modelado basado en uno o varios planos focales dependiendo de las dimensiones específicas de la característica de interés (ver Figura 3). Por lo general, se utiliza un solo plano focal para modelar un área dentro de un rango Z de aproximadamente 50 μm. Se demostró que la resolución del patrón era consistente usando esta regla general (ver Figura 6). Sin embargo, una desventaja de este método es el aumento del tiempo de modelado con la introducción de múltiples planos y patrones focales. En nuestra mano, utilizando múltiples planos focales, las características geométricas 3D de hasta 16 mm x 16 mm x 0,17 mm (X x Y x Z) se han modelado con éxito con una alta calidad de patrón.
Además, es importante mencionar que la altura (eje Z) de las características geométricas que se pueden utilizar en combinación con este protocolo es limitada. Dado que tanto el fotopatronaje UV como muchas lecturas celulares dependen de una configuración de microscopía, la distancia de trabajo de los objetivos determina la altura máxima de una característica. En nuestra mano, las geometrías que superan una altura de 300 μm todavía pueden ser fotopatronadas uv, y las lecturas se han realizado utilizando un microscopio confocal con objetivos 40x. Por lo tanto, la investigación mecanobiológica que va desde las escalas intracelulares hasta las celulares y tisulares es posible utilizando el protocolo descrito. 
Otro factor que debe tenerse en cuenta es el riesgo de que las muestras se sequen durante o después del fotopatronaje UV49. Esto es especialmente relevante cuando se utilizan geometrías 3D, ya que las convexidades a menudo se exponen fuera de los materiales de cultivo celular. Como se muestra en la Figura 4, esto podría resultar en patrones desiguales con agregados de proteínas que se forman sobre la característica de interés. El lavado de los chips de cultivo celular después de la incubación de proteínas y durante el cultivo celular es fundamental para el recubrimiento adecuado de las geometrías 3D. Por lo tanto, se recomienda dejar siempre pequeños volúmenes de una solución de trabajo (PBS, PLPP, solución de proteína, medio de cultivo celular) sobre el chip de cultivo celular.
Hasta ahora, varios recubrimientos de proteínas (fibronectina, colágeno tipo I y IV, gelatina, FNC) y tipos de células (células estromales de médula ósea humana, miofibroblastos humanos, células endoteliales humanas, queratocitos humanos y fibroblastos dérmicos) se han utilizado en combinación con el enfoque de fotopatronaje descrito en materiales de cultivo celular estructurado. Como se muestra en un estudio anterior48, la optimización de los parámetros de incubación de proteínas es clave para la investigación sistemática en nuevos tipos de células. Por lo tanto, antes de realizar un nuevo experimento con nuevas proteínas o células, se recomienda probar un rango de concentraciones de proteínas, temperaturas de incubación y tiempos de incubación. Al comparar la morfología celular después de la adhesión inicial en áreas planas homogéneas y modeladas con la morfología celular en condiciones de cultivo celular "normales", se puede obtener un conjunto optimizado de parámetros experimentales. Además, cada tipo de célula puede requerir una cantidad diferente de tiempo después de la siembra para mostrar una morfología de adhesión reconocible en un entorno multicue específico (ver Figura 5). Con este fin, es crucial optimizar el tiempo requerido por tipo de célula para presentar eventos de contacto en el área estampada durante el lavado en el paso 8.4. Por ejemplo, observamos que en los patrones en línea, los queratocitos humanos muestran morfologías alargadas dentro de los primeros 30 minutos después de la siembra, mientras que las células endoteliales y los fibroblastos dérmicos requieren varias horas antes de mostrar un cambio en la morfología de adhesión. Por lo tanto, los parámetros experimentales requeridos para la incubación de proteínas (paso 7) y la siembra celular (paso 8) podrían depender de la proteína y el tipo de célula de elección. 
El enfoque presentado para aplicar señales de guía de contacto en geometrías 3D puede ayudar a crear una comprensión más profunda del comportamiento celular en entornos complejos de múltiples capas. Esto puede incluir investigaciones sobre componentes intracelulares, como adherencias focales y núcleos, y también puede involucrar experimentos realizados en una escala más grande, celular o tisular utilizando el método propuesto. Eventualmente, se anticipa que el conocimiento adquirido se puede utilizar en el diseño de aplicaciones de ingeniería de tejidos, donde los entornos celulares complejos están diseñados para dirigir el comportamiento celular hacia un resultado deseado.

In vivo, las células están sujetas a una amplia variedad de señales ambientales que pueden ser de naturaleza mecánica, física y bioquímica que se originan en la matriz extracelular (ECM). Se han identificado numerosas señales ambientales que desempeñan un papel vital en la regulación del comportamiento celular, como la proliferación, la diferenciación yla migración 1,2,3,4,5. Uno de los fenómenos más ampliamente investigados es la guía de contacto, que describe la alineación celular mediada por adhesión a lo largo de patrones bioquímicos o topográficos anisotrópicos presentes en el sustrato extracelular 6,7,8,9,10,11. Más allá de dirigir la alineación de las células, también se ha demostrado que las señales de guía de contacto influyen en otras propiedades celulares como la migración celular, la organización de las proteínas intracelulares, la forma celular y el destino celular 12,13,14,15. Además, la arquitectura geométrica del entorno celular 3D también ha sido reconocida por su influencia reguladora en el comportamiento celular16,17. En el cuerpo humano, las células están expuestas a una variedad de geometrías curvas, que van desde fibras de colágeno a microescala, capilares y glomérulos, hasta alvéolos y arterias de mesoescala18,19. Curiosamente, estudios recientes in vitro han demostrado que las células pueden detectar y responder a tales señales físicas, desde la nanoescala hasta la mesoescala 20,21,22,23.
Hasta la fecha, la mayoría de los estudios que investigan la respuesta celular a las señales ambientales se han realizado en gran medida utilizando configuraciones experimentales que aíslan señales individuales. Si bien este enfoque ha permitido un tremendo progreso en la comprensión de los mecanismos básicos detrás de la detección celular de señales ambientales, recapitula mal el entorno in vivo que presenta simultáneamente múltiples señales. Para cerrar esta brecha, es útil desarrollar plataformas de cultivo mediante las cuales se puedan controlar múltiples señales ambientales de forma independiente y simultánea. Este concepto ha ganado una tracción creciente últimamente24,25, con estudios que combinan la rigidez de la matriz y la densidad del ligando 26,27,28,29, la rigidez y la porosidaddel sustrato 30, la rigidez del sustrato y el volumen31 del microniche 3D, la topografía de la superficie y las señales de guía de contacto32,33,34 , y señales de guía de contacto a nanoescala con señales de guía de curvatura a mesoescala23. Sin embargo, sigue siendo un desafío combinar las señales de guía de contacto con una variedad de geometrías 3D de una manera controlada y de alto rendimiento.
Este protocolo de investigación aborda este desafío e introduce un método para crear sustratos de cultivo celular con una combinación controlada de áreas adhesivas estampadas de proteínas ECM (señales de guía de contacto) y curvatura del sustrato (señales geométricas). Este enfoque permite la disección de la respuesta celular en un entorno biomimético multicue de una manera sistemática y de alto rendimiento. El conocimiento adquirido puede ayudar a comprender mejor el comportamiento celular en entornos complejos y se puede utilizar para diseñar materiales instructivos con propiedades que dirijan las respuestas celulares hacia un resultado deseado.
Fotopatronaje de proteínas 3D La creación de áreas adhesivas de proteínas ECM (señales de guía de contacto) en materiales de cultivo celular se puede lograr utilizando una variedad de técnicas, por ejemplo, mediante patrones ultravioleta profundo (UV profundo) o impresiónde microcontacto 35,36. El patrón UV profundo hace uso de la luz UV que se proyecta a través de una máscara en un material polimérico para degradar los polímeros de pasivación en lugares específicos en el sustrato de cultivo celular. El sustrato modelado se incuba con un ligando de interés, lo que resulta en áreas adhesivas que soportan la unión celular y el cultivo en ubicaciones predefinidas 12,37,38. Una forma alternativa de introducir patrones de proteínas es mediante la impresión de microcontactos, donde los sellos elastoméricos que contienen una forma deseada se recubren con una proteína de elección y se presionan sobre un sustrato de cultivo celular, transfiriendo así el recubrimiento proteico al que las células pueden adherirse 35,37,39,40 . Desafortunadamente, dado que ambas técnicas se basan en la preparación de máscaras y métodos de litografía suave, los experimentos consumen mucho tiempo y mano de obra, así como son limitados en términos de flexibilidad del patrón. Además, tanto el patrón UV profundo como la impresión de microcontacto son más adecuados para materiales planos y son técnicamente difíciles, si no imposibles, para modelar ligandos en un entorno 3D.
Para mejorar estos métodos convencionales, Waterkotte et al. combinaron litografía sin máscara, deposición química de vapor y termoformado para generar sustratos poliméricos 3D con micromodelado41. Sin embargo, esta técnica se basa en el uso de películas de polímeros termoformables y ofrece una baja resolución de patrón de proteínas (7,5 μm), mientras que se ha informado que las células responden a patrones geométricos de proteínas tan pequeños como 0,1 μm 2,42. Sevcik et al. describieron otro método prometedor para nanomodelar ligandos ECM en sustratos que contienen topografías nanométricas y micrómetros43. Utilizando la impresión de microcontacto, las proteínas ECM se transfirieron de sellos de polidimetilsiloxano (PDMS) a un sustrato termosensible de poli(N-isopropilacrilamida) (pNIPAM). Posteriormente, la propiedad termorreceptiva de la red pNIPAM les permitió transferir el patrón de proteína bidimensional (2D) a un sustrato TOPOGRÁFICO PDMS (surcos de 10-100 μm de profundidad), controlando así la localización de sitios de adhesión en características topográficas. Sin embargo, no todas las microtopografías posibles pueden ser modeladas ya que la disminución de los problemas de humectabilidad hace que sea más difícil modelar sustratos topográficos más profundos. Se ha informado que las zanjas con una relación de aspecto profundidad-anchura de 2,4 son el límite final para transferir con éxito el patrón al sustrato topográfico43. Además, la flexibilidad de los patrones variables y la resolución de los patrones generados son deficientes debido al requisito de la impresión de microcontactos.
Este documento describe un método que supera los cuellos de botella mencionados anteriormente y ofrece un método flexible y de alto rendimiento para crear sustratos multicue que se pueden utilizar para el cultivo celular (ver Figura 1). Las geometrías fisiológicamente relevantes (cilindros, cúpulas, elipses y superficies de sillín) con curvaturas que van desde ĸ = 1/2500 a ĸ = 1/125 μm-1 están prediseñadas y microfabricadas en chips PDMS. Posteriormente, las señales de guía de contacto se crean sobre las geometrías 3D utilizando una variedad de diseños de patrones digitales mediante el empleo de una técnica de fotopatronaje con una resolución tan pequeña como 1.5 μm44. Con este fin, los chips PDMS se pasivan inicialmente para evitar que las células y las proteínas se adhieran; esta capa de pasivación se puede eliminar mediante la combinación del fotoiniciador cloruro de 4-benzoilbencil-trimetilamonio (PLPP) y la exposición a la luz UV45. Una máscara digital está diseñada para especificar las ubicaciones de la exposición a los rayos UV y, por lo tanto, el área donde se elimina la capa de pasivación. Las proteínas pueden adherirse posteriormente a estas áreas, lo que permite la unión celular. Dado que el modelado se realiza utilizando una máscara digital (en lugar de física), se puede crear rápidamente una variedad de patrones sin la molestia y el costo asociados con el diseño y la fabricación de fotomáscaras adicionales. Además, una amplia gama de proteínas ECM (por ejemplo, colágeno tipo I, gelatina y fibronectina) pueden ser modeladas en el sustrato. Aunque este protocolo se realiza utilizando chips de cultivo celular hechos de PDMS, el principio se puede aplicar a cualquier otro material de interés46.

<table><tbody><tr><td>Anticuerpo anti-vinculina, monoclonal de ratón IgG1</td><td>Sigma</td><td>V9131</td><td>Dilución: 1/600</td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina, fracción V</td><td>Roche</td><td>10735086001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, alto contenido de glucosa, piruvato</td><td>Gibco</td><td>41966029</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12 + GlutaMAX (1x)</td><td></td><td></td>Microscopio epifluorescente Gibco 10565018 <td></td></tr><tr><td>DMi8</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Biosolve</td><td>0005250210BS</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Serana 758093</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fiji/ImageJ, version v1.53k</td><td>www.imageJ.nih.gov</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Iluminador fluorescente</td><td>Stabilo</td><td>4006381333627</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina marcada con fluorescina</td><td>Invitrogen</td><td>G13187</td><td>Concentración: 0.01%</td></tr><tr><td>Solución de formaldehído</td><td>Merck</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos de vidrio 24 x 60 mm, #1</td><td>VWR</td><td>631-1575</td><td></td></tr><tr><td>Cubertades de vidrio, &oslash; = 32 mm, #1</td><td>Menzel-Gl&auml; Objetivo del</td> microscopio ser <td></td><td></td></tr><tr><td>HCX PL fluotar L 20X/0.40na</td><td>Leica 11506242</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Fibroblastos dérmicos humanos</td><td>Lonza</td><td>CC-2511</td><td></td></tr><tr><td>Queratocitos primarios humanos</td><td>MERLN Institute for Technology-Inspired Regenerative Medicine Illustrator</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, versión 26.0.1</td><td>Adobe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Horno de laboratorio</td><td>Carbolita</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-Ácido ascórbico 2-fosfato sesquimagnesio sal hidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8960</td><td></td></tr><tr><td>Leica Application Suite X, versión 3.5.7.23225</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software Leonardo, versión 4.16</td><td>Alv&eacute; ole</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro-manager, versión 1.4.23</td><td>Imagen</td><td></td><td></td>abierta</tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81381</td><td>medio de montaje</td></tr><tr><td>valerato de mPEG-succinimidilo MW 5.000 Da Laysan</td><td>Bio</td><td>MPEG-SVA-5000</td><td>Concentración: 50 mg/mL</td></tr><tr><td>Molde de vidrio negativo</td><td>FEMTOprint</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NucBlue Live Readyprobes Reactivo (Hoechst 33342)</td><td>Invitrogen</td><td>R37605</td><td>2 gotas/mL</td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina (10.000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140163</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri (&oslash;=100 mm)</td><td>Greiner Bio-one</td><td>664160</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin Atto 647N</td><td>Sigma</td><td>65906</td><td>Dilución: 1/250</td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato</td><td>Sigma</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Plasma asher</td><td>Emitech</td><td>K1050X</td><td></td></tr><tr><td>PLPP (fotoiniciador)</td><td>Alv&eacute; ole</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-lisina,</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4707</td> filtrada estérilmente <td>Concentración: 0.01%</td></tr><tr><td>PRIMO</td><td>Alv&eacute; ole</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina marcada con rodamina</td><td>Cytoskeletn, Inc.</td><td>FNR01</td><td>Concentración: 10 &micro; g/mL</td></tr><tr><td>Anticuerpo secundario con Alexa 488, IgG1 (H) anti-ratón de cabra</td> <td>Sondas moleculares</td><td>A21121</td><td>Dilución: 1/300</td></tr><tr><td>Anticuerpo secundario con Alexa 555, IgG1 (H) anti-ratón de cabra</td> <td>Sondas moleculares</td><td>A21127</td><td>Dilución: 1/300</td></tr><tr><td>Recubridor de centrifugado</td><td>Leurell Technologies Corporation</td><td>modelo WS-650MZ-23NPPB</td><td></td></tr><tr><td>SYLGARD 184 Kit de elastómero de silicona</td><td>DOW</td><td>1673921</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocal TCS SP8X</td><td></td> Tridecafluoro<td></td><td></td></tr><tr><td>(1,1,2,2-tetrahidrooctil)Triclorosilano</td><td>TCS SP8X ABCR</td><td>AB111444</td><td></td></tr><tr><td>Enzima TrypLE Express (1x), rojo sin fenol</td><td>Gibco</td><td>12604013</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,05%), rojo</td><td>fenol Gibco</td><td>25300054</td><td></td></tr></tbody></table>

generación de microambientes celulares multicue mediante fotopatronaje uv de sustratos de cultivo celular tridimensional

Generation of Multicue Cellular Microenvironments by UV-Photopatterning of Three-Dimensional Cell Culture Substrates

La matriz extracelular es un importante regulador de la función celular. Se ha demostrado cada vez más que las señales ambientales existentes en el microambiente celular, como la distribución de ligandos y la geometría de los tejidos, desempeñan un papel crítico en el gobierno del fenotipo y el comportamiento celular. Sin embargo, estas señales ambientales y sus efectos sobre las células a menudo se estudian por separado utilizando plataformas in vitro que aíslan las señales individuales, una estrategia que simplifica en gran medida la compleja situación in vivo de múltiples señales. Los enfoques de ingeniería pueden ser particularmente útiles para cerrar esta brecha, mediante el desarrollo de configuraciones experimentales que capturen la complejidad del microambiente in vivo , pero que conserven el grado de precisión y manipulabilidad de los sistemas in vitro .
Este estudio destaca un enfoque que combina el modelado de proteínas basado en ultravioleta (UV) y la microfabricación de sustrato basada en litografía, que en conjunto permiten una investigación de alto rendimiento sobre los comportamientos celulares en entornos de multicue. Mediante el fotopatronaje UV sin máscara, es posible crear distribuciones de proteínas complejas y adhesivas en sustratos de cultivo celular tridimensionales (3D) en chips que contienen una variedad de señales geométricas bien definidas. La técnica propuesta se puede emplear para sustratos de cultivo hechos de diferentes materiales poliméricos y combinados con áreas con patrones adhesivos de una amplia gama de proteínas. Con este enfoque, las células individuales, así como las monocapas, pueden ser sometidas a combinaciones de señales geométricas y señales de guía de contacto presentadas por los sustratos modelados. La investigación sistemática utilizando combinaciones de materiales de chips, patrones de proteínas y tipos de células puede proporcionar información fundamental sobre las respuestas celulares a los entornos de multicue.

Mediante el protocolo descrito, los sustratos de cultivo celular 3D PDMS pueden ser fotopatronados UV para crear áreas adhesivas precisas y de alto rendimiento adecuadas para la fijación celular. De esta manera, las células se someten a geometrías de sustrato relevantes y patrones de ligando adhesivo simultáneamente. Las propiedades celulares, como la orientación, el área celular y el número de adherencias focales, se pueden monitorear y utilizar fácilmente para comprender mejor el comportamiento celular en entornos complejos e in vivo.
Para verificar los eventos de patronaje en los sustratos 3D PDMS, se han medido composiciones de la superficie atómica del material en diferentes etapas del protocolo mediante espectroscopia atómica de fotoelectrones de rayos X (XPS)48. En resumen, las mediciones de XPS mostraron la presencia de cadenas PEG con una mayor señal de carbono en muestras pasivadas, que se redujo después del fotopatronaje. La incubación con fibronectina resultó en un aumento de la señal de carbono, lo que nuevamente indica una adhesión exitosa de proteínas en la superficie del chip de cultivo celular. A continuación, la resolución del patrón y la alineación en las características 3D se caracterizaron en una variedad de fosas cóncavas con patrones circulares (ĸ = 1/250 μm-1, ĸ = 1/1,000 μm-1 y ĸ = 1/3,750 μm-1, ver Figura 6). A partir de las proyecciones de máxima intensidad, se puede concluir que el patrón de proteínas se modeló con éxito en las tres características 3D. El perfil de intensidad de la Figura 6A muestra una alta resolución de patrón con transiciones nítidas entre áreas con y sin patrón. Además, se obtuvo una intensidad de proteína consistente a través del patrón completo en el hoyo.
El pozo cóncavo con ĸ = 1/250 μm-1 se modeló utilizando el método de plano focal único (un patrón), mientras que los pozos con ĸ = 1/1.000 μm-1 y ĸ = 1/3.750 μm-1 se modelaron utilizando dos y tres planos focales (patrones), respectivamente. Como se puede ver en las proyecciones de máxima intensidad en la Figura 6, ambos métodos dan como resultado una alineación perfecta de los patrones en la parte superior de las características. No se pueden observar transiciones desalineadas entre los dos planos y patrones focales diferentes.
Utilizando el protocolo descrito, se puede aplicar una amplia gama de diseños de patrones de proteínas a una variedad de geometrías (ver Figura 7 y Video 1). Para ilustrar la versatilidad de este método, los semicilinders (convexos y cóncavos), una superficie de silla de montar y un hoyo fueron modelados utilizando líneas y círculos de varios anchos. Los materiales fotomodelados se pueden utilizar posteriormente para el cultivo celular (ver Figura 7, Figura 8, Video 2, Video 3 y Video 4). Un ejemplo de fibroblastos dérmicos cultivados en un semicilinder cóncavo patrón (líneas de fibronectina, rojo, 5 μm de ancho y 5 μm) se muestra en la Figura 8, Figura 9 y Video 4. Durante el experimento, las células detectan y se adhieren al sustrato de cultivo celular multicue y permanecen viables con el tiempo. Como se puede ver en la tinción inmunofluorescente en la Figura 8, las células forman adherencias focales (grupos de vinculina) principalmente en las líneas de fibronectina.
Otro estudio de ejemplo que hace uso de estos materiales de cultivo celular fue publicado recientemente por nuestro grupo48. En este estudio, los miofibroblastos humanos y las células endoteliales se sometieron a la combinación de señales de guía de contacto y topografías geométricas. In vivo, ambos tipos de células experimentan señales de guía de curvatura y contacto en tejidos nativos, como en la vasculatura humana. Al someter las células in vitro a un entorno que combina ambas señales ambientales, la situación in vivo se puede recapitular, proporcionando una comprensión más profunda del papel del microambiente en el comportamiento celular. Se demostró que los miofibroblastos humanos se alinean con las señales de guía de contacto (líneas paralelas de fibronectina) en sustratos cilíndricos cóncavos48. Sin embargo, en estructuras convexas con curvaturas crecientes, las señales geométricas anularon las señales bioquímicas, lo que sugiere que los miofibroblastos pueden detectar tanto el grado como el signo de curvatura. Curiosamente, las células endoteliales solo podían adherirse a los sustratos cóncavos de multicue y no a los sustratos convexos de PDMS. En sustratos cóncavos con patrón de proteínas, las células endoteliales están orientadas en la dirección de la señal de guía de contacto. Este conocimiento fundamental in vitro tiene relevancia fisiológica en el campo de la ingeniería de tejidos vasculares y eventualmente puede ayudar en el diseño de construcciones inteligentes de ingeniería de tejidos.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63988/63988fig01.jpg"> Figura 1: La línea de tiempo experimental de la aplicación de señales de guía de contacto en sustratos de cultivo celular 3D. En primer lugar, los chips de cultivo celular positivo se producen a partir de un molde PDMS negativo que contiene una gama de geometrías. El PDMS sin curar se vierte en el molde y se cura durante 3 h a 65 °C. Posteriormente, el PDMS se trata con plasma de O2 y se incuba con PLL y mPEG-SVA (azul, marcado) para pasivar la superficie del sustrato de cultivo celular. Después del lavado, el sustrato se voltea boca abajo en una gota de fotoiniciador (PLPP, verde, etiquetado) y se fotopatrea CON UV utilizando el enfoque LIMAP. Aquí, se utiliza una máscara digital con un patrón definido por el usuario para dividir la capa de pasivación en ubicaciones definidas. A continuación, se puede incubar una solución de proteína (roja, etiquetada) y solo se adherirá a los lugares donde se elimina la capa de pasivación. Las células sembradas en el sustrato se someten tanto a la geometría como a los patrones de proteínas, lo que permite la investigación del comportamiento celular en entornos complejos que imitan el vivo. Abreviaturas: PDMS = polidimetilsiloxano; mPEG-SVA = valerato de metoxipolietilenglicol-succinimidil; PLPP = cloruro de 4-benzoilbencil-trimetilamonio; LIMAP = Adsorción molecular inducida por la luz de proteínas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63988/63988fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63988/63988fig02.jpg"> Figura 2: Diferentes etapas durante la producción y pasivación del sustrato de cultivo celular 3D. El molde de vidrio negativo (# 1) está diseñado con software de diseño asistido por computadora y producido utilizando una técnica de escritura directa con láser de femtosegundo. Este molde se utiliza para producir el chip PDMS positivo intermedio (# 2) y el molde PDMS negativo (# 3), que posteriormente se utilizan para producir el chip de cultivo celular final (# 4). Abreviatura: PDMS = polidimetilsiloxano. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63988/63988fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63988/63988fig03.jpg"> Figura 3: Ilustración esquemática de los dos métodos de modelado. Izquierda: El fotopatronaje UV se realiza en características más pequeñas (aproximadamente un DMD) utilizando un solo plano focal y patrón. Como resultado, la función completa se modela de una sola vez. Derecha: Cuando se utilizan características más grandes (más grandes que un DMD), el patrón se divide en múltiples planos focales y patrones. Abreviatura: DMD = dispositivo espejo digital. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63988/63988fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63988/63988fig04.jpg"> Figura 4: Un ejemplo típico de un sustrato incubado con proteínas normal y seco. Proyecciones de máxima intensidad (XY) y vistas ortogonales (XZ) de sustratos normales y secos incubados con proteínas. Al lavar un sustrato de cultivo celular modelado después de la incubación con una solución de proteína, es crucial mantener siempre la muestra húmeda. Aunque el patrón es idéntico en todas las imágenes en las características (ĸ = 1/1.000 μm-1), la gelatina-fluoresceína (verde) se agregó formando un grupo importante cuando la muestra se dejó secar durante unos segundos. Si la muestra siempre permanece húmeda, se pueden observar patrones de proteínas correctos. Barras de escala = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63988/63988fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63988/63988fig05.jpg"> Figura 5: Imágenes de campo brillante después de la siembra. Queratocitos primarios (izquierda) y fibroblastos dérmicos (derecha) 4 h después de la siembra en características geométricas 3D (fosa cóncava de ĸ = 1/1.000 μm-1 y semicilinders de ĸ = 1/500, 1/375, 1/250, 1/175 y 1/125 μm-1). Las inserciones superiores izquierdas representan el patrón de línea utilizado para el modelado de las geometrías. Las flechas blancas indican celdas de propagación que ya muestran alineación. Barras de escala = 250 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63988/63988fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63988/63988fig06.jpg"> Figura 6: Caracterización de patrones circulares en fosas cóncavas. (A) La proyección de máxima intensidad (XY) y vista ortogonal (XZ) de fosa aconceva (ĸ = 1/250 μm-1) estampada utilizando LIMAP (ancho de línea: 20 μm, ancho de hueco: 20 μm) e incubada con gelatina-fluoresceína (verde). El perfil de intensidad a lo largo de la línea blanca se traza contra la distancia, mostrando una calidad y resolución de patrón consistentes. (B) Patrones adicionales realizados en fosas cóncavas con ĸ = 1/1,000 μm-1 y ĸ = 1/3750 μm-1, mostrando flexibilidad en términos de características geométricas que pueden usarse para el modelado. Una vez más, se visualizan tanto las proyecciones de intensidad máxima (XY) como las vistas ortogonales (XZ). Barras de escala = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63988/63988fig06large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63988/63988fig07.jpg"> Figura 7: Datos de microscopía 3D de estructuras modeladas. Ejemplos típicos de materiales de cultivo celular con patrones 3D después del fotopatronaje y el cultivo celular, visualizados utilizando software de renderizado 3D. (A) Semicilinder convexo modelado con líneas de 10 μm de ancho (rodamina-fibronectina, rojo) y espacios de 10 μm de ancho. Barra de escala = 5 μm. (B) Fibroblastos dérmicos teñidos para F-actina (verde) cultivados en semicilinder cóncavo modelado con líneas de 20 μm de ancho (rodamina-fibronectina, rojo) y espacios de 20 μm de ancho. Barra de escala = 5 μm. (C) Superficie del sillín modelada con líneas de 20 μm de ancho (rodamina-fibronectina, rojo) y espacios de 20 μm de ancho. Barra de escala = 5 μm. (D) Fosa cóncava modelada con círculos concéntricos de líneas de 20 μm de ancho (gelatina-fluoresceína, verde) y huecos de 20 μm de ancho. El citoesqueleto de F-actina de los queratocitos humanos se tiñe con faloidina y se visualiza en rojo. Barra de escala = 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63988/63988fig07large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63988/63988fig08.jpg"> Figura 8: Tinción inmunofluorescente de fibroblastos dérmicos humanos en un semicilinder cóncavo fotomodelado. (A) Proyección de máxima intensidad (XY) y secciones ortogonales (XZ y YZ) de fibroblastos dérmicos humanos cultivados durante 24 h en un semicilizador cóncavo patrónado (líneas de fibronectina, rojo, 5 μm de ancho y huecos de 5 μm). Las células se tiñen para F-actina (magenta), vinculina (verde) y núcleos (azul). Barra de escala = 100 μm. (B) Zoom de una celda adherida al entorno multicue. Barras de escala = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63988/63988fig08large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63988/63988fig09.jpg"> Figura 9: Imágenes de lapso de tiempo de campo brillante de fibroblastos dérmicos humanos en un cilindro cóncavo estampado. El semicífero cóncavo (ĸ = 1/250 μm-1) se modeló con líneas paralelas (5 μm de ancho y 5 μm de huecos) y se incubó con rodamina-fibronectina antes de la siembra celular. La imagen de lapso de tiempo se inicia 1 h después de la siembra celular inicial (izquierda, 0 min), cuando las células todavía están redondeadas y no adherentes (flechas). Después de aproximadamente 24 h (medio, 1.420 min), las células se adhirieron al sustrato multicue y muestran una respuesta de alineación de acuerdo con el patrón de guía de contacto. Tanto la respuesta de alineación como la viabilidad celular se mantienen a lo largo de toda la duración del cultivo (derecha, 3.180 min). Barras de escala = 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63988/63988fig09large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Video 1: Ejemplo de patrón en un sustrato cilíndrico 3D. Representación 3D de un cilindro convexo modelado con rodamina-fibronectina (rojo). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63988/Video%201.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este video.</a>
Video 2: Representación 3D de fibroblastos dérmicos cultivados en un sustrato cilíndrico 3D modelado (ĸ = 1/500 μm-1). Fibroblastos dérmicos cultivados durante 24 h en un semicilinder convexo patrón (líneas de fibronectina, rojo, 10 μm de ancho y huecos de 10 μm). Las células se tiñen para F-actina (magenta), vinculina (verde) y núcleos (azul). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63988/Video%202.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este video.</a>
Video 3: Representación 3D de queratocitos humanos cultivados en un pozo 3D modelado (ĸ = 1/3,750 μm-1). Representación 3D de queratocitos humanos cultivados durante 24 h en un hoyo cóncavo y estampado (círculos de gelatina, verdes, de 20 μm de ancho y huecos de 20 μm). Las células se tiñen para F-actina (rojo). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63988/Video%203.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este video.</a>
Video 4: Imágenes de lapso de tiempo de campo brillante de fibroblastos dérmicos humanos en un cilindro cóncavo con patrón. El semicífero cóncavo (ĸ = 1/250 μm-1) se modeló con líneas paralelas (5 μm de ancho y 5 μm de huecos) y se incubó con rodamina-fibronectina antes de la siembra celular. La imagen de lapso de tiempo se inicia 1 h después de la siembra celular inicial, cuando las células muestran adherencia inicial al entorno multicue. Durante el lapso de tiempo completo, las células se orientan predominantemente a lo largo de las señales de guía de contacto, mientras que la viabilidad celular se mantiene. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63988/Video%204.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este video.</a>

Tradicionalmente, el cultivo celular se realiza sobre sustratos planos que imitan mal el entorno natural de las células in vivo. Aquí describimos un método para producir sustratos de cultivo celular con geometrías curvas fisiológicamente relevantes y proteínas extracelulares micromodeladas, lo que permite investigaciones sistemáticas sobre la detección celular de estas señales extracelulares.

Generación de microambientes celulares multicue mediante fotopatronaje UV de sustratos de cultivo celular tridimensional

The extracellular matrix is an important regulator of cell function. Environmental cues existing in the cellular microenvironment, such as ligand ...

La influencia de los factores microambientales en el comportamiento celular a menudo se estudia utilizando plataformas in vitro demasiado simplificadas, que aíslan señales individuales. Nuestro enfoque crea sustratos de cultivo celular que combinan múltiples de estas señales. Este enfoque es muy versátil y permite un estudio sistemático utilizando una amplia variedad de materiales de cultivo celular, patrones de guía de contacto, lecturas celulares y proteínas.El procedimiento será demostrado por dos candidatos de PSE de nuestro laboratorio. CAS VAN DER PUTTEN, y MIRKO D'URSO First, crean un molde de vidrio negativo utilizando una técnica directa derecha láser de femtosegundo que contiene todas las características de interés. Luego, coloque cuidadosamente el molde de vidrio negativo en el fondo de una placa de Petri y vierta el prepolímero de polidimetilsiloxano sobre el molde de vidrio negativo para cubrirlo por completo.Coloque esta placa de Petri en el desecador de vacío y encienda la bomba de vacío. Una vez que se logra el vacío, espere 5 minutos para eliminar todas las burbujas presentes en la interfaz entre la superficie del molde y el prepolímero de polidimetilsiloxano. Curar el prepolímero PDMS durante la noche en el horno a 65 grados centígrados.Después del curado, use una espátula para levantar los bordes del PDMS. Retire el chip PDMS positivo recién curado del molde de vidrio negativo, y si el chip PDMS positivo tiende a adherirse al molde de vidrio negativo, agregue etanol o agua a los bordes de la impresión mientras levanta. Luego, coloque el chip de polidimetilsiloxano positivo en un desecador junto a un pequeño vial con una gota de agente de silanización y deje el chip al vacío durante la noche.Vierta el prepolímero PDMS en el molde PDMS negativo para producir múltiples chips de cultivo celular de 5 milímetros de espesor. A continuación, retire las burbujas con el desecador y cure durante tres horas a 65 grados centígrados. Use una cuchilla de afeitar para cortar el chip al tamaño final y almacene los chips a temperatura ambiente Para la pasivación del sustrato con pinzas, coloque el chip en la canasta del plasma Asher.Luego, use plasma de oxígeno para activar los grupos hidroxilo en la superficie del chip y ventile la cámara de cenizas con nitrógeno. Saque el chip de la canasta y colóquelo en un recipiente pequeño de polidimetilsiloxano. Ahora, use una pipeta pasteur para agregar 500 microlitros de poli-L-lisina en la parte superior del chip, para sumergir completamente la superficie en la solución e incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente.Luego, retire 450 microlitros de la poli-L-lisina del chip de cultivo celular con una pipeta. A continuación, enjuague el trío de superficie del chip con 500 microlitros de tampón HEPES 0.1 molar. Mantenga la calidad del patrón final dejando un pequeño volumen de líquido en el chip de polidimetilsiloxano, para evitar que la muestra se seque.Justo antes de su uso, prepare 500 microlitros de 50 miligramos por mililitro de valerato de cianamida metoxi polietilenglico-glicosico en 0,1 pilas molares por chip de cultivo celular e incube la muestra en ella durante 60 minutos. Con una micropipeta, retire 450 microlitros de la solución de valerato cianamida metoxi polietileno glicolísico. Lave la superficie del chip cinco veces con PBS pipeteando dentro y fuera.Para eliminar todos los mPEG-SVA independientes. Coloque el portaobjetos de vidrio con un resaltador fluorescente en la trayectoria óptica del microscopio. Cambie al modo fluorescente en el microscopio y enfoque cuidadosamente la imagen primo, asegurándose de que tanto el logotipo como el texto estén enfocados.Haga clic en siguiente para ver los datos de calibración y el patrón para finalizar el procedimiento de calibración. Anote la ubicación Z del escenario al calibrar y use esta ubicación como referencia más adelante en el protocolo. Después de retirar el portaobjetos de calibración del escenario, coloque un portaobjetos de vidrio que contenga una gota del fotoiniciador en el escenario y coloque el sustrato de cultivo celular PDMS boca abajo, en la gota del fotoiniciador.Asegúrese de que las características 3D en la superficie del sustrato de cultivo celular miren hacia el portaobjetos de vidrio y estén completamente sumergidas en el iniciador fotográfico, para garantizar un patrón adecuado. Concéntrese en la parte superior o inferior de las estructuras convexas o cóncavas respectivamente y concéntrese en el área del chip en la ubicación correcta como se describe en el manuscrito. Ajuste la configuración de patrones de acuerdo con la función y seleccione una dosis de 1000 milijulios por mililitro.Haga clic en el botón de reproducción en la parte inferior derecha de la pantalla para iniciar el patrón. Una vez terminado, observe el patrón que se muestra en verde. Usando una micropipeta, agregue dos mililitros de PBS a un vial de 20 microgramos de fibronectina marcada con rodamina, para obtener una concentración de 10 microgramos por mililitro.Pipetear suavemente para evitar los grupos de proteínas y proteger de la luz. Usando una micropipeta, agregue de 200 a 500 microlitros de la solución de proteína al chip de cultivo celular. Ajuste el tiempo de incubación y la temperatura dependiendo de la proteína de elección, y asegúrese de cubrir la muestra.Retire la solución de proteína y lave el chip cinco veces con 500 microlitros de PBS estéril. Asegúrese de pipetear el PBS hacia arriba y hacia abajo varias veces por encima de todas las características relevantes del chip de cultivo celular, para eliminar cualquier proteína no unida. Una vez que la suspensión celular esté preparada, retire PBS y agregue 1 mililitro de la suspensión celular al chip.Luego, incubar durante 60 minutos a 37 grados centígrados. Verifique la adhesión de las células en el chip de cultivo celular patrón bajo un microscopio de campo brillante. Busque morfologías celulares alargadas en el caso de patrones de línea.Y si las células han comenzado a adherirse fuera del área modelada, elimínelas pipeteando el medio hacia arriba y hacia abajo directamente sobre las células en el sustrato. Después de teñir, coloque la muestra teñida boca abajo en una gota de PBS en un portaobjetos de vidrio. Luego, dependiendo del nivel de detalle requerido, haga pilas Z con un objetivo adecuado y un espaciado Z para garantizar la adquisición adecuada de la imagen.Cree un renderizado 3D de la pila Z con el software de renderizado 3D. Se modeló un hoyo cóncavo utilizando la absorción molecular inducida por la luz de las proteínas y se visualizaron la proyección de intensidad máxima y la vista ortogonal. El perfil de intensidad mostró transiciones agudas de alta resolución de patrones entre áreas con y sin patrón y una intensidad de proteína consistente.El patrón utilizando el plano focal único, así como el método de dos y tres planos focales, mostró una alineación perfecta de los patrones en la parte superior de las características. Los semicilindros cóncavos, los semicilindros convexos, la superficie de la silla de montar y el PID se modelaron utilizando líneas o círculos concéntricos de varios anchos. El efecto dentro del esqueleto de los queratocitos humanos se tiñe usando foliden y se visualiza.Los fibroblastos dérmicos se cultivaron en un semicilindro cóncavo modelado y se visualizaron. Las células detectaron y se adhirieron al sustrato de cultivo celular multicue y permanecieron viables con el tiempo según lo visualizado por F-actina, vinculina y núcleos. Además, las células formaron adherencias focales principalmente en las líneas de fibronectina.Los fibroblastos dérmicos humanos cultivados en un cilindro cóncavo modelado en presencia de fibronectina rodamina adheridos al sustrato multicue y mostraron una respuesta de alineación, de acuerdo con el patrón de guía de contacto. La respuesta de alineación y la viabilidad celular se mantienen durante toda la duración del cultivo. Lo más importante al realizar este protocolo es evitar que la superficie del chip de cultivo celular se seque.El uso de diferentes materiales de sustrato, recubrimientos de proteínas y tipos de células puede requerir una optimización adicional. Proporcionar múltiples señales ambientales en 3D puede abrir nuevas posibilidades para dirigir la organización celular en tejidos de ingeniería complejos.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

Acuosos sistemas de dos fases se utiliza para poblaciones modelo simultáneamente múltiples de células. Este método rápido y fácil para el patrón celular se aprovecha de la separación de fases de las soluciones acuosas de glicol de polietileno y dextrano y la tensión interfacial que existe entre las dos soluciones de polímero.

Co-cultivo celular Patterning Uso acuoso de dos fases Sistemas

Describimos un protocolo para modificar la afinidad celular de la superficie de un andamio en un entorno acuoso. El método aprovecha la fotocatálisis de dióxido de titanio para descomponer la película orgánica en la región fotoirradiada. Demostramos que se puede utilizar para crear microdominios de proteínas de andamiaje, tanto ex situ como in situ.

Photopatterning proteínas y células en el medio ambiente acuoso Usando TiO<sub&gt; 2</sub&gt; Fotocatálisis

El siguiente protocolo describe el procedimiento para ensamblar cultivos tipo sándwich que se utilizarán como etapa intermedia entre los entornos celulares bidimensionales (2D) y tridimensionales (3D). Los sistemas diseñados pueden tener aplicaciones en ensayos de microscopía, biomecánica, bioquímica y biología celular.

Microentornos-Sandwich como para aprovechar Celulares / Materiales Interacciones

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Formación luz mediada y el patrón de hidrogeles para aplicaciones de cultivo celular

Este artículo describe la metodología detallada para preparar una matriz de multiplexado Artificial celular microambiente (MACME) para manipulación de alto rendimiento de física y química señales mímico en vivo microambientes celulares y a identificar el entorno celular óptimo para las células de vástago pluripotent humanas (hPSCs) con perfiles de unicelulares.

Fabricación de una Matriz microambiente celular Artificial multiplexados

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Celular 3D inicial grupo Control en un dispositivo híbrido Gel cubo para formaciones de patrón repetible

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Mapeo de la Organización Espacial Emergente de Células De mamíferos usando Micropatrones e Imágenes Cuantitativas

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Aquí, presentamos un protocolo para generar un modelo tridimensional de piel simplificado e indiferenciado utilizando una plataforma microfluídica micromecanizado. Un enfoque de flujo paralelo permite la deposición in situ de un compartimento dérmico para la siembra de células epiteliales en la parte superior, todo controlado por bombas de jeringa.

Generación de un modelo tridimensional simplificado de piel en un chip en una plataforma microfluídica micromecanizado

El protocolo presentado aquí permite la fabricación automatizada de micropatrones que estandariza la forma celular para estudiar las estructuras citoesqueléticos dentro de las células de mamíferos. Esta técnica fácil de usar se puede configurar con sistemas de imágenes disponibles en el comercio y no requiere equipos especializados inaccesibles a los laboratorios de biología celular estándar.

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Aprende a generar microambientes celulares multicue mediante fotopatronaje UV en sustratos tridimensionales de PDMS. Este método permite estudiar sistemáticamente cómo las células responden a señales extracelulares combinadas.

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