Cultivo, congelación, procesamiento e imágenes de organoides y esferoides completos mientras aún están en un hidrogel

Los organoides y esferoides, al ser muy frágiles, se dañan seriamente durante la manipulación. Nuestro protocolo garantiza que estas estructuras de cultivo 3D permanezcan intactas durante varios procesos, aumentando así la precisión, la reproducibilidad, la fiabilidad y la repetibilidad. El investigador puede cultivar, congelar, descongelar, procesar, teñir, etiquetar y examinar organoides y esferoides completos bajo varios microscopios mientras permanecen intactos en un hidrogel dentro de un solo dispositivo multipropósito.

Permite la creación de un modelo de enfermedad y el seguimiento de pasos secuenciales en un dispositivo multipropósito. La tecnología aporta más precisión al examinar biomarcadores para el diagnóstico y pronóstico de enfermedades. Este método se puede aplicar a cualquier sistema de cultivo 3D, incluidos organoides, esferoides, células individuales u organismos vivos.

Para comenzar el cultivo organoide o esferoide, coloque el hidrogel correctamente descongelado en hielo dentro de una campana de flujo laminar durante 15 minutos. Además, mantenga el tubo que contiene una bolita del carcinoma hepatocelular, o células HEPG2, en hielo. A continuación, coloque de 30 a 35 microlitros de hidrogel al 100% dentro del nicho del dispositivo multipropósito precalentado para crear una gota de gel, coloque 10, 000 células HEPG2 en el centro de la parte superior de la gota de hidrogel e incube la configuración a 37 grados centígrados durante 15 minutos.

Después de la incubación, cubra la gota de hidrogel con 200 microlitros de Dulbecco's Modified Eagle Medium, o DMEM, que contiene 10% de suero bovino fetal, o FBS. Coloque la tapa en el dispositivo correctamente, permitiendo el flujo de gas, antes de colocarlo en la incubadora. Cada dos días, alimente las células con 200 microlitros de DMEM que contienen 10% FBS.

Verifique el crecimiento de los esferoides bajo un microscopio invertido. Antes de comenzar el etiquetado de inmunofluorescencia de los organoides, caliente los medios y soluciones necesarios a 37 grados centígrados. Aspirar el medio de cultivo celular que rodea la gota de hidrogel antes de agregar 200 microlitros de paraformaldehído al 4% precalentado a 37 grados centígrados y fijarlo colocándolo en una incubadora a 37 grados centígrados durante 15 a 30 minutos.

Luego, aspire el fijador y lave la solución para el etiquetado de inmunofluorescencia, o SIF, precalentada a 37 grados centígrados tres veces durante 10 minutos cada una. Agregue agua destilada al área que rodea el nicho para proporcionar humedad antes de continuar con los siguientes pasos. Aspire el SIF que rodea la gota de hidrogel y agregue 100 microlitros de la solución de anticuerpos primarios precalentados en SIF al hidrogel antes de incubarlo a 37 grados centígrados durante 30 a 60 minutos.

Luego, aspire la solución de anticuerpos primarios y lave con SIF precalentado a 37 grados centígrados tres veces durante 10 minutos cada una. Después del lavado, aspire el SIF restante y agregue 100 microlitros de la solución de anticuerpos secundarios precalentados en SIF al hidrogel. Incubar el hidrogel a 37 grados centígrados en la oscuridad durante 30 a 60 minutos.

Después de la incubación, aspire la solución de anticuerpos secundarios y lave la gota de hidrogel con PBS a 37 grados centígrados tres veces en la oscuridad durante 10 minutos cada una. A continuación, aspire el PBS residual e incube el hidrogel con 100 microlitros de tinción de ADN nuclear que contenga medio de montaje o glicerol a 37 grados centígrados en la oscuridad. Llene el nicho con glicerol para evitar que se seque antes de cerrar herméticamente el dispositivo multiusos que contiene el hidrogel.

Para examinar los organoides por microscopía confocal, ajuste los parámetros del microscopio siguiendo las instrucciones dadas en el manuscrito. Para congelar los organoides, aspire los medios de cultivo celular, agregue 200 microlitros de la solución de congelación precalentada e incube la muestra a 37 grados centígrados durante una hora. Cierre bien la tapa del dispositivo antes de colocarlo dentro de una caja de espuma.

Coloque esta caja de espuma en otra caja de espuma y cierre ambas cajas de espuma herméticamente. Mantenga la caja a menos 20 grados centígrados durante dos horas, luego déjela durante la noche en un congelador de menos 80 grados centígrados. Para almacenar los organoides durante más de seis meses, retire el dispositivo multiusos que contiene los organoides de las cajas y transfiéralo al tanque de nitrógeno líquido.

Para descongelar los organoides, saque el dispositivo multipropósito que contiene la muestra del congelador o del tanque de nitrógeno líquido y colóquelo directamente en una incubadora a 37 grados centígrados. Una vez descongelado, aspire suavemente la mezcla de solución de congelación y medio antes de agregar medio fresco y proceder a obtener imágenes del hidrogel organoide de montaje completo. En imágenes en vivo, los organoides en crecimiento dentro del hidrogel se hicieron visibles de tres a cinco días después de insertar el pellet celular, especialmente en la periferia de la cúpula de hidrogel.

Aquí se muestra la serie temporal de imágenes a diferentes niveles de un hidrogel que contiene esferoides bajo un microscopio de contraste de fase invertida. Las imágenes de microscopía confocal de los organoides vivos de montaje completo después de teñir en vivo la membrana celular y el núcleo mostraron una densidad de etiquetado similar en la periferia y el centro. Además, el etiquetado de inmunofluorescencia de los esteroides de montaje completo podría realizarse con éxito con un anticuerpo, dos anticuerpos, así como tres anticuerpos, eliminando cualquier necesidad de pasos de tratamiento adicionales.

El análisis representativo demuestra dos organoides de las vías respiratorias marcados con inmunofluorescencia en un dispositivo. Las imágenes SEM de todos los esferoides en el dispositivo multipropósito y 10 imágenes de esteroides seccionados indicaron una arquitectura 3D bien conservada de esferoides, orgánulos citoplasmáticos y otras características celulares ultraestructurales, lo que demuestra la efectividad del protocolo descrito. La irregularidad en los límites de la cúpula de hidrogel fue evidente después de congelar las muestras.

Sin embargo, el tamaño y la redondez de los esferoides permanecieron similares. Se observó migración celular en la superficie de cultivo después de descongelar las muestras congeladas. La técnica es muy simple.

Sin embargo, el investigador debe ser muy cuidadoso al aspirar o agregar cualquier líquido que rodee la gota de hidrogel para evitar dañar la muestra. El investigador puede observar la misma muestra en un solo dispositivo utilizando un microscopio de alta tecnología y realizar un estudio correlativo.