Name: Cultivo, congelación, procesamiento e imágenes de organoides y esferoides completos mientras aún están en un hidrogel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-23T14:10:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: Aprenda a cultivar, congelar y procesar organoides y esferoides completos en hidrogel utilizando un dispositivo multipropósito. Este método mejora la reproducibilidad y permite el análisis de biomarcadores con microscopía confocal.

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Agradecemos a Dale Mertes de la Universidad de Chicago por la preparación de diagramas, al Dr. Mehmet Serif Aydin por su apoyo técnico en el Instituto de Investigación de Ciencias y Tecnologías de la Salud de la Universidad Medipol de Estambul, y al Dr. Rana Kazemi de la Universidad de Maltepe por editar el manuscrito.

1. Cultivo de organoides y esferoides
<ol><li>Coloque el hidrogel en hielo durante la noche (en un refrigerador o en una cámara frigorífica) para descongelar.</li>
	<li>Coloque el dispositivo multipropósito disponible comercialmente (MD; consulte la Tabla de materiales) en la incubadora 1 día antes del experimento (37 °C, 5% deCO2) para calentarlo.</li>
	<li>Introduzca las puntas de pipeta estériles de extremo ancho en la nevera a 4 °C. NOTA: Los pasos 1.1-1.3 deben realizarse el día 0 y los pasos 1.4-1.11 deben realizarse el día 1.</li>
	<li>Coloque el hidrogel sobre hielo en una campana de flujo laminar durante 15 min.<ol><li>Opcional: Diluir el hidrogel en medio de cultivo de células frías de acuerdo con la recomendación del fabricante.</li>
	</ol></li>
	<li>Coloque el tubo que contiene una bolita de células HepG2 (línea celular de carcinoma hepatocelular obtenida comercialmente; consulte la Tabla de materiales) en hielo.</li>
	<li>Placa 30-35 μL de hidrogel 100% dentro del nicho del dispositivo precalentado para crear una gota de gel.</li>
	<li>Coloque 10.000 células HepG2 en el centro de la parte superior de cada gota de hidrogel (Figura 2) e incube durante 15 minutos a 37 °C.</li>
	<li>Cubra la gota de hidrogel con 200 μL de Medio de Águila Modificada (DMEM) de Dulbecco con 10% de Suero Bovino Fetal.</li>
	<li>Cubra la tapa del MD en la posición correcta para permitir el flujo de gas y coloque el dispositivo en la incubadora.</li>
	<li>Alimente las células con 200 μL de DMEM con 10% de FBS cada dos días.</li>
	<li>Comprobar el crecimiento de los esferoides bajo un microscopio invertido (Figura 3). La formación de esferoides comienza después del3er día. El video 1 muestra la ubicación de los esferoides en diferentes niveles en una cúpula de hidrogel. NOTAS: Se recomienda encarecidamente aspirar suavemente el líquido que rodea el hidrogel y agregar lentamente el nuevo líquido al ambiente para evitar dañar las gotas de hidrogel.</li>
</ol>2. Tinción de hematoxilina y eosina de organoides/esferoides de montaje entero en un hidrogel
<ol><li>Calentar el fijador (4% paraformaldehído; PFA), PBS y hematoxilina (ver Tabla de Materiales) hasta 37 °C.</li>
	<li>Aspirar el medio que rodea la gota de hidrogel con una pipeta, añadir 100-200 μL de PFA al 4% para fijar e incubar durante 15-20 min a 37 °C.</li>
	<li>Aspirar el PFA al 4% y añadir 200 μL de PBS para lavar 3 veces durante 5 min cada una a 37 °C. A continuación, aspirar el PBS e incubar con 200 μL de solución de hematoxilina durante 15-20 min a 37 °C.</li>
	<li>Aspirar la hematoxilina y añadir 200 μL dedH2Opara lavar 3 veces durante 10 min cada una a 37 °C. Aspirar eldH2Oe incubar con 200 μL de etanol durante 5-10 min a 37 °C.</li>
	<li>Aspirar el etanol e incubar con 200 μL de eosina (ver Tabla de materiales) durante 10 min a 37 °C. Aspirar la eosina y añadir 200 μL dedH2Opara lavar durante 5 min a temperatura ambiente (RT).</li>
	<li>Aspirar eldH2Oy añadir 100 μL de glicerol para cubrir la gota de hidrogel como medio de montaje.</li>
	<li>Opcional: Monte el nicho con un cubreobjetos. Este paso se puede omitir para evitar apretar organoides/esferoides de tamaño considerable.</li>
	<li>Cierre firmemente la tapa de MD para evitar que se seque hasta el examen. La muestra es estable para su examen durante al menos 6 meses.</li>
</ol>3. Inmunohistoquímica de organoides/esferoides de montaje completo en un hidrogel
<ol><li>Calentar la solución obtenida comercialmente para inmunohistoquímica (S-IHC; ver Tabla de materiales) a 37 °C.</li>
	<li>Incubar los organoides o esferoides en el hidrogel con peróxido de hidrógeno al 3% (H2O2) en 200 μL dedH2O durante5 min a 37 °C.</li>
	<li>Aspirar la solución de peróxido de hidrógeno y lavar endH2Odurante 5 min a 37 °C. Aspirar eldH2Oe incubar dos veces con 100 μL de S-IHC a 37 °C durante 10 min cada una.</li>
	<li>Aspirar la S-IHC e incubar con 100 μL de anticuerpo primario (ver Tabla de materiales) diluido en S-IHC durante 1-2 h a 37 °C (siguiendo las recomendaciones del fabricante con respecto a la dilución de trabajo).</li>
	<li>Aspirar la solución de anticuerpos primarios e incubar con 100 μL de S-IHC 3x durante 5 min cada uno a 37 °C.</li>
	<li>Aspirar 100 μL de S-IHC e incubar con un anticuerpo secundario biotinilado (ver Tabla de materiales) durante 10 min a 37 °C.</li>
	<li>Aspirar la solución de anticuerpos secundarios e incubar con 100 μL de S-IHC 3x durante 5 min cada uno a 37 °C. Aspirar la S-IHC e incubar con 100 μL de peroxidasa de rábano picante (HRP) marcada con estreptavidina (ver Tabla de materiales) durante 10 min a 37 °C.</li>
	<li>Aspirar la estreptavidina marcada con HRP e incubar con 100 μL de S-IHC 3x durante 5 min cada uno a 37 °C.</li>
	<li>Aspirar la S-IHC e incubar con 100 μL de mezcla de solución de cromógeno DAB/AEC (ver Tabla de materiales) durante 5-10 min a 37 °C.</li>
	<li>Controle la intensidad de la tinción bajo un microscopio óptico.</li>
	<li>Lavar con dH 2 O 3x durante2min cada uno.</li>
	<li>Opcional: Incubar con 100 μL de hematoxilina (ver Tabla de Materiales) para la contratinción nuclear durante 5 min a 37 °C.</li>
	<li>Aspirar la Hematoxilina y lavar endH2Odurante 5 min.</li>
	<li>Aspirar eldH2Oy cubrir la gota de hidrogel con 100 μL de glicerol como medio de montaje.</li>
	<li>Cierre firmemente la tapa del MD hasta el examen microscópico. NOTAS: Los pasos de recuperación de antígenos y bloqueo de proteínas se omiten en este protocolo ya que S-IHC elimina estos pasos.</li>
</ol>4. Etiquetado por inmunofluorescencia de organoides/esferoides de montaje completo en un hidrogel
<ol><li>Calentar los siguientes materiales a 37 °C: PFA AL 4%, PBS, S-IF, solución de anticuerpos primarios en S-IF, solución de anticuerpos secundarios en S-IF, tinción nuclear y glicerol (ver Tabla de materiales).</li>
	<li>Aspirar el medio de cultivo celular y fijar con 200 μL de PFA al 4% durante 15-30 min a 37 °C. Aspirar el fijador y lavar en S-IF 3 veces durante 10 min cada una a 37 °C.</li>
	<li>Agregue dH2O al lado que rodea el nicho para proporcionar humedad durante los siguientes pasos.</li>
	<li>Aspirar el S-IF que rodea la gota de hidrogel e incubar la gota de hidrogel con 100 μL de solución de anticuerpos primarios (ver Tabla de materiales) en S-IF durante 30-60 min a 37 °C.</li>
	<li>Aspirar la solución de anticuerpos primarios y lavar en S-IF 3 veces durante 10 min cada una a 37 °C.</li>
	<li>Aspirar el S-IF e incubar con 100 μL de solución de anticuerpos secundarios (ver Tabla de materiales) en S-IF durante 30-60 min a 37 °C en la oscuridad.</li>
	<li>Aspirar la solución de anticuerpos secundarios y lavar con PBS 3x durante 10 min cada uno a 37 °C en la oscuridad.</li>
	<li>Aspirar el PBS e incubar con 100 μL de tinción de ADN nuclear que contenga medio de montaje o glicerol a 37 °C en la oscuridad.</li>
	<li>Llene el nicho con glicerol para evitar que se seque.</li>
	<li>Opcional: Cubra el nicho con un cubreobjetos. Este paso se puede omitir para evitar apretar los organoides / esferoides.</li>
	<li>Cierre herméticamente el MD. Las muestras en MD pueden almacenarse a 4 °C en la oscuridad durante al menos 6 meses con una pérdida mínima de fluorescencia.</li>
	<li>Utilice los siguientes ajustes para el examen microscópico confocal: establezca el valor estenopeico de todos los canales en 20,1, mantenga la constante del maestro de ganancia en 550 para 488 nm, 485 para 550 nm y 450 para 594 nm, mantenga constante la potencia del láser para todos los experimentos y el porcentaje más bajo en 2,0. NOTAS: Anticuerpos primarios: Anti-Na-K ATPasa (1:100), Anti-Arginasa (1:50), Antialbúmina (1:50), Anti-Beta-galactosidasa (1:25), Anticuerpo antimitocondrial (1:100), Anticuerpo Anti-Golgi (1:50), Anti-citoqueratina 5 (1:100), Anticuerpo Ov6 (1:100). Anticuerpos secundarios: Cabra anti-Conejo IgG (H+L)- 488, Cabra anti-Conejo IgG (H+L)-550, Cabra anti-Ratón IgG (H+L)-488, Cabra anti-Ratón IgG (H+L)-550, Cabra anti-Pollo IgY(H+L)-647. La dilución para todos los anticuerpos secundarios es 1:100. Además, también se utiliza FITC-faloidina (1:100), un anticuerpo conjugado (ver Tabla de materiales).</li>
</ol>5. Etiquetado de la membrana plasmática y el núcleo de organoides y esferoides vivos en un hidrogel
<ol><li>Prepare la solución de etiquetado que contenga aglutinina de germen de trigo fluorado de Alexa (5.0 μg / ml) y Hoechst (2 μM) en la solución salina equilibrada de Hank (HBSS), de acuerdo con las recomendaciones del fabricante (consulte la Tabla de materiales), y caliente hasta 37 ° C.</li>
	<li>Aspirar el medio de cultivo celular y añadir 100 μL de solución de etiquetado para cubrir la gota de hidrogel. Incubar durante 15-30 min a 37 °C.</li>
	<li>Retire la solución de etiquetado y lave dos veces en PBS 2 veces durante 10 minutos cada una a 37 °C. Opcional: Fijar con 200 μL de formaldehído al 4% durante 15 min a 37 °C.</li>
	<li>Cubra la gota de hidrogel con glicerol como medio de montaje. Opcional: Monte el nicho con una cubierta de vidrio.</li>
	<li>Cierre bien la tapa del MD y manténgalo refrigerado en la oscuridad hasta el examen microscópico fluorescente/confocal. Es estable durante al menos 6 meses.</li>
</ol>6. Congelación y descongelación de organoides/esferoides de montaje entero en un hidrogel
<ol><li>Congele los organoides siguiendo los pasos a continuación.<ol><li>Calentar la solución de congelación obtenida comercialmente (FS; ver Tabla de materiales) a 37 °C.</li>
		<li>Aspire suavemente los medios de cultivo celular que rodean la cúpula de hidrogel.</li>
		<li>Añadir 200 μL de FS suavemente. Incubar la muestra con FS a 37 °C durante 1 h.</li>
		<li>Cierre bien la tapa del dispositivo y colóquelo en una caja de espuma. Coloque esta caja de espuma en otra caja de espuma, como se muestra en la Figura complementaria 3. Cierre ambas cajas de espuma herméticamente. Dos cajas de espuma una dentro de la otra proporcionan un rango de gradiente de enfriamiento de temperatura de 1 a 2 ° C / min de la muestra en un congelador de -20 ° C.</li>
		<li>Colocar la caja a -20 °C durante 2 h. Transfiera la caja a un congelador a -80 °C y déjela toda la noche.</li>
		<li>Saque la muestra de las cajas. La muestra en el MD puede conservarse en el congelador de -80 °C durante 6 meses.</li>
		<li>Transfiera el MD que contiene la muestra al tanque de nitrógeno líquido para su almacenamiento a largo plazo.</li>
	</ol></li>
	<li>Descongela los organoides siguiendo los pasos a continuación.<ol><li>Saque la MD que contiene la muestra del congelador/tanque de nitrógeno y colóquela directamente en una incubadora a 37 °C. Incubar durante 1 h a 37 °C.</li>
		<li>Añadir 200 μL de medio de cultivo caliente al nicho (la proporción de FS a medio de cultivo celular es de 1:1) e incubar durante 30 min a 37 °C.</li>
		<li>Añadir más medio de cultivo caliente al nicho (la proporción de FS a medio de cultivo celular es de 1:2) e incubar durante 30 min a 37 °C.</li>
		<li>Aspirar suavemente el medio y la mezcla de FS. Proceda a la microscopía electrónica de barrido (paso 7) y la microscopía electrónica de transmisión (paso 8) de los organoides/esferoides de montaje completo en el hidrogel.</li>
	</ol></li>
</ol>7. Microscopía electrónica de barrido de organoides/esferoides de montaje completo
<ol><li>Caliente la solución fijadora y postfijadora de Karnovsky (consulte la Tabla de materiales) a temperatura ambiente (RT).</li>
	<li>Aspirar el medio de cultivo celular que rodea el hidrogel en la DM. Coloque la muestra en el MD sobre hielo en la campana de flujo laminar durante 15 min.</li>
	<li>Aspirar el hidrogel licuado que rodea los organoides/esferoides muy suavemente. Una cantidad limitada de matrigel puede permanecer en el nicho para evitar dañar y perder la muestra.</li>
	<li>Fijar con fijador de Karnovsky (2% PFA, 2,5% glutaraldehído en 0,15 M de tampón de cacodilato, y 2 mM CaCl2; ver Tabla de materiales) en RT durante 1 h.</li>
	<li>Aspirar el fijador suavemente y lavar con agua destilada (dH2O) 3 veces durante 15 min cada una.</li>
	<li>Aspirar suavemente eldH2Oy fijar con solución postfijadora (tetróxido de osmio acuoso al 1% [OsO4]; ver Tabla de materiales) a RT durante 1 h.</li>
	<li>Aspirar suavemente el postfijador y lavar con agua destilada (dH2O) 3x durante 15 min cada uno.</li>
	<li>Deshidratar en una serie graduada de etanol (30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 96%, 100%), mezcla de etanol/acetona (1:1; 1:2) y acetona absoluta a RT durante 15 min cada una.</li>
	<li>Secar con un secador de punto crítico.</li>
	<li>Cubra la muestra en el dispositivo con oro/paladio de 6 nm usando un recubridor de pulverización catódica (consulte la Tabla de materiales) durante 90 s.</li>
	<li>Observe bajo un microscopio electrónico de barrido con un detector de electrones secundario en la lente a 2-3 kV en modo vacío (5 x 10-6 mA). Tome imágenes con una distancia de trabajo de 8.1-8.2 mm y con aumentos de 675x, 1050x y 1570x. NOTAS: Todos los pasos se realizan en el MD. Use 200-250 μL de solución para cada paso.</li>
</ol>8. Microscopía electrónica de transmisión de organoides/esferoides de montaje completo en un hidrogel
<ol><li>Calentar el fijador de Karnovsky a 37 °C. Aspirar el medio de cultivo celular que rodea el hidrogel en la DM.</li>
	<li>Fijar la muestra con el fijador de Karnovsky en RT durante 1 h. Lavar con dH2O 3x durante 15 min cada uno.</li>
	<li>Post-fijación conOsO4 acuoso al 2% y ferrocianuro de potasio al 2,5% a RT durante 45 min. Lavar con dH2O 3x durante 10 min cada uno.</li>
	<li>Incubar en tiocarbohidrazida al 0,5% (TCH; ver Tabla de materiales) a RT durante 30 min. Lavar con dH2O 3x durante 10 min cada uno.</li>
	<li>Incubar enOsO4 acuoso al 2% a RT durante 30 min. Lavar con dH2O 3x durante 10 min cada uno.</li>
	<li>Incubar en solución de acetato de uranilo al 2% (ver Tabla de materiales) a RT durante 1 h. NOTA: En este paso, los esferoides se pueden mantener a 4 °C durante la noche.</li>
	<li>Incubar en solución de aspartato de plomo (ver Tabla de materiales) a 60 °C durante 45 min. Lavar con dH2O 3x durante 10 min cada uno.</li>
	<li>Deshidratar en una serie graduada de etanol (50%, 70%, 90%, 100% [x2]) y acetona absoluta a RT durante 15 min cada uno.</li>
	<li>Tratar con una mezcla de (1:1; 1:2) acetona/resina Epon y resina Epon pura (ver Tabla de materiales) en RT durante 2 h cada uno.</li>
	<li>Polimerizar la resina a 60 °C durante la noche (mínimo de 16 h). Después de la polimerización, retire el bloque de resina del MD, como se muestra en la Figura complementaria 4.</li>
	<li>Fije el bloque de resina a uno más grande con un pegamento de resina. Recorta el bloque y alcanza la ubicación de organoides o esferoides.</li>
	<li>Obtenga secciones semidelgadas (1,000 nm) y ultradelgadas (60 nm) usando un ultramicrotomo (consulte la Tabla de materiales).</li>
	<li>Coloque las secciones ultrafinas en rejillas de cobre de malla 100 y observe bajo un microscopio electrónico de barrido con un detector STEM a un voltaje de aceleración de 30 kV. Capture imágenes con una distancia de trabajo de 44 mm y con aumentos de 2580x, 5020x y 6060x. NOTAS: Utilice 200-250 μL de solución para cada paso. Los pasos 8.1-8.10 se realizan en el MD.</li>
</ol>

Ranan Gulhan Aktas posee solicitudes de patentes MD, S-IHC, S-IF y FS. Olgu Enis Tok participó en el desarrollo de estos productos. Olgu Enis Tok y Gamze Demirel son miembros del equipo de investigación y desarrollo de la compañía llamada Cellorama. Yusuf Mustafa Saatci, Zeynep Akbulut y Ozgecan Kayalar no tienen ningún conflicto de intereses que declarar.

El MD, complementando las formulaciones y protocolos descritos aquí, facilita el crecimiento 3D rápido y espontáneo de organoides y esferoides en un entorno más controlado y continúa el experimento en las mismas condiciones. El espécimen permanece en el mismo entorno durante todo el proceso, y casi el 100% de las arquitecturas de cultivo 3D permanecen intactas en el contenedor. Esto mejora la homogeneidad durante los experimentos secuenciales y permite un período de cultivo prolongado. Además, el número de pasos durante ...

El futuro de la investigación y terapia celular está dentro de los cultivos celulares 3D 1,2,3. Los modelos organoides y esferoides cierran la brecha entre los experimentos in vitro y los modelos animales al crear mejores modelos que imitan el desarrollo del cuerpo humano, la fisiología y las enfermedades 4,5,6,7,8,9. Sin embargo, la reproducibilidad y repetibilidad de estos modelos siguen siendo un desafío. Además, el manejo, la cosecha, la transferencia y la centrifugación de estas estructuras con las tecnologías actuales resultan en la pérdida o daño de los organoides y esferoides en muchas condiciones, lo que afecta significativamente los resultados.

A pesar de muchos protocolos para la tinción histológica, la tinción inmunohistoquímica, el etiquetado de inmunofluorescencia y la criopreservación, no existe un enfoque universal relacionado con la estandarización de las condiciones experimentales, el manejo y el procesamiento de estas delicadas estructuras sin perderlas o dañarlas. Los protocolos actuales también son increíblemente largos, alternando desde unos pocos días hasta varias semanas, e incluyen procedimientos complejos con varios reactivos 10,11,12,13,14. Además, la recolección, el pipeteo, la centrifugación y la transferencia de estructuras de cultivo 3D entre los vasos de cultivo celular y los crioviales causan cambios en el posicionamiento de las estructuras y las fuerzas mecánicas y, en última instancia, afectan la diferenciación y maduración de los organoides y esferoides. Se ha reportado que la topología tisular, el posicionamiento de las células y las fuerzas mecánicas impactan significativamente la diferenciación y maduración celular 6,15,16,17.

Por lo tanto, es deseable mejorar las tecnologías convencionales actuales para generar organoides y esferoides con calidad estable. Un método / dispositivo que omita la centrifugación y otros pasos descritos anteriormente y proporcione el material en un solo entorno seguro desde el principio hasta el final de los múltiples procesos sería beneficioso para alcanzar los datos más consistentes y confiables. Además, esto reducirá las limitaciones de tiempo, mano de obra y costos.
El dispositivo multipropósito (MD) descrito aquí proporciona un único entorno seguro para múltiples procesos de organoides y esferoides (Figura complementaria 1). Este dispositivo y los protocolos complementarios eliminan los pasos de recolección, pipeteo, transferencia y centrifugación. Los organoides y esferoides permanecen en su ambiente in vitro durante los procesos secuenciales. Este entorno comprende principalmente componentes naturales o sintéticos de la matriz extracelular, como los hidrogeles disponibles comercialmente. En otras palabras, los métodos descritos aquí permiten procesar, examinar y congelar una muestra completa de organoides/esferoides mientras aún están en una gota de hidrogel.
El dispositivo biocompatible es resistente a temperaturas entre 60 °C y -160 °C, lo que hace posible restaurar los organoides/esteroides en un tanque de nitrógeno líquido a -160 °C o preparar bloques de resina para microscopía electrónica a 60 °C. El nicho en el dispositivo ha sido diseñado para definir un espacio limitado para estructuras de cultivo 3D y estimular la formación de esferoides u organoides basados en los estudios previos 18,19,20,21,22,23. Esa parte del dispositivo es transparente y contiene un plástico específico que proporciona una alta calidad óptica (índice de refracción: 1.43; valor abbe: 58; espesor: 7.8 mil [0.0078 in o 198 μm]). Tanto el nicho como la parte "lateral" circundante causan autofluorescencia. El nicho transparente en el centro tiene un área de80 mm 2, mientras que la parte lateral es de 600 mm2. La profundidad del contenedor es de 15 mm y el grosor es de 1,5 mm. Estas características, además del tamaño y el diseño del dispositivo, permiten realizar observaciones bajo diferentes tipos de microscopio de alta tecnología y preparar las muestras para exámenes microscópicos electrónicos (Figura 2). El sistema de cierre del dispositivo proporciona dos posiciones, una sellada en el congelador y la otra que permite el flujo de gas en la incubadora. Los ensayos de proliferación y citotoxicidad de CCK8 demuestran efectos similares en las células en comparación con las placas de cultivo celular tradicionales (Figura complementaria 2). La prueba de exclusión de azul de tripano demuestra una alta viabilidad celular (94%) durante el cultivo celular en la DM (Figura 3).
Los procesos que se pueden realizar para una muestra en el dispositivo único comprenden (1) cultivo, (2) tinción histológica, (3) inmunotinción, incluido el etiquetado inmunohistoquímico e inmunofluorescente, (4) congelación, (5) descongelación, (6) examen bajo microscopios ópticos, como microscopios de campo claro, campo oscuro, fluorescencia, confocales y de súper resolución, (7) recubrimiento y examen directamente bajo un microscopio electrónico de barrido, o (8) preparación para microscopía electrónica de transmisión ( Figura 2).
Existen diferentes metodologías para la tinción histológica, el marcaje inmunohistoquímico o el marcado fluorescente de organoides y esferoides 10,11,12,13,14,24,25. Cosecharlos del hidrogel es el primer y principal paso de la tecnología actual. Después de este paso, algunos métodos permiten el inmunoetiquetado de montaje completo. Los organoides cosechados se incrustan en parafina, se seccionan y se etiquetan para teñir e inmunotinción en otros. Sin embargo, las secciones pueden no presentar toda la muestra y proporcionar solo datos limitados relacionados con la arquitectura 3D de la estructura. Además, el daño a estas estructuras 3D y la pérdida de antigenicidad son efectos secundarios bien conocidos de estas tecnologías.
Los nuevos protocolos complementarios para exámenes microscópicos en este artículo permiten un análisis de muestras de montaje completo aún en un hidrogel. Los protocolos descritos aquí incluyen dos formulaciones recientemente desarrolladas: solución para inmunohistoquímica (S-IHC) y solución para etiquetado de inmunofluorescencia (S-IF). Los métodos con estas soluciones permiten a los investigadores obtener datos más precisos, ya que no hay efectos nocivos de los flujos de trabajo tradicionales, como la centrifugación, el pipeteo y la transferencia de las estructuras delicadas. El protocolo descrito aquí también elimina la necesidad de recolección, bloqueo, limpieza y pasos de recuperación de antígenos, y acorta todo el procedimiento a 6-8 h. Además, la metodología permite agregar simultáneamente de uno a tres anticuerpos al mismo S-IF. Por lo tanto, es posible obtener los resultados el mismo día incluso después de los múltiples experimentos de etiquetado, que es otra ventaja del protocolo descrito aquí; Los protocolos tradicionales de etiquetado de inmunofluorescencia de montaje completo suelen tardar entre 3 días y varias semanas 10,11,12,13,14.
También se omite la incorporación de parafina, otro paso dañino que reduce la antigenicidad. La estructura 3D permanece en su entorno in vitro desde el principio hasta el final del examen microscópico. Dado que la estructura 3D permanece en sus condiciones de crecimiento, la expresión de proteínas y los datos de localización imitan mejor las condiciones in vivo. Se esperan resultados más precisos, ya que la metodología elimina los pasos que afectan la expresión del antígeno de la muestra. La Tabla 1 y la Tabla 2 demuestran cómo estos nuevos protocolos eliminan pasos, ahorran tiempo y mano de obra en el laboratorio y reducen los costos y los productos de desecho en comparación con los flujos de trabajo tradicionales.
Además de los pasos cruciales descritos anteriormente, otro problema es proporcionar un medio de criopreservación y un método para preservar la estructura 3D de la muestra con mayores tasas de viabilidad celular 26,27,28,29,30,31. La criopreservación es esencial para crear un sistema modelo estable y permitir el biobanco de organoides y esferoides32,33. Biobanco toda la estructura 3D original permitirá una recapitulación más fiel del estado natural de salud o enfermedad. Las consideraciones clave son la conveniencia y confiabilidad de la criopreservación y la descongelación de organoides / esferoides. La recuperación de organoides post-deshielo es muy baja en la mayoría de las tecnologías actuales, a menudo menos del 50%. Sin embargo, estudios recientes han mostrado resultados prometedores con mejores tasas de supervivencia26,27,28,29. Lee et al. demostraron que el 78% de las células esferoides sobrevivieron después de la criopreservación cuando utilizaron la solución de la Universidad de Wisconsin que contenía 15% de DMSO28. La razón de supervivencia celular aumentó al 83% en el estudio de Arai et al.29. Sin embargo, los resultados después de la criopreservación se ven afectados significativamente ya que las estructuras 3D no pueden mantener las mismas características y calidad. Además, se requieren reactivos sin suero para las buenas prácticas de fabricación en entornos farmacéuticos y de diagnóstico. Los flujos de trabajo tradicionales utilizan un medio que contiene suero bovino fetal (FBS) y dimetilsulfóxido (DMSO) para el método de congelación lenta, ambos asociados con discapacidades. FBS es un producto derivado de animales y puede tener variaciones de lotes. El DMSO es un crioprotector muy exitoso, pero la exposición a largo plazo, especialmente durante la descongelación, puede causar efectos citotóxicos30,31.
Este artículo también describe la metodología de congelación/descongelación de organoides o esferoides enteros mientras aún están en un hidrogel. En el estudio se utilizan dos fórmulas para congelar organoides y esferoides: (1) DMSO al 10% que contiene solución de congelación tradicional (FS) y (2) un medio de criopreservación libre de suero y DMSO. Este medio de criopreservación contiene componentes de matriz extracelular, que son diferentes de las fórmulas actuales. La matriz extracelular comprende dos clases principales de macromoléculas, proteoglicanos y proteínas fibrosas, que son esenciales para el andamiaje físico de los constituyentes celulares, pero también inician procesos necesarios para la morfogénesis, diferenciación y homeostasis tisulares 34,35,36,37,38,39,40 . Los colágenos proporcionan resistencia a la tracción, regulan la adhesión celular, apoyan la quimiotaxis y la migración, y dirigen el desarrollo de los tejidos37. Además, las fibras de elastina proporcionan retroceso a los tejidos que sufren estiramientos repetidos38. Una tercera proteína fibrosa, la fibronectina, dirige la organización de la matriz extracelular intersticial y tiene un papel crucial en la mediación de la unión celular y funciona como un mecano-regulador extracelular39. Du et al. han demostrado el efecto crioprotector del hidrolizado de colágeno de pollo sobre el sistema modelo de actomiosina natural41. Sus resultados sugieren que el hidrolizado de colágeno puede inhibir el crecimiento de cristales de hielo, reducir la desnaturalización por congelación de proteínas y la oxidación de manera similar a los crioprotectores comerciales, y proporcionar una mejor estructura de gel después de los ciclos de congelación y descongelación. Por lo tanto, la adición de componentes de matriz extracelular a los medios de criopreservación proporciona un entorno más seguro y protector para la muestra y ayuda a las estructuras vivas a sanar después de la congelación-descongelación.
Además, el presente estudio describe un protocolo sencillo para etiquetar las membranas citoplasmáticas y los núcleos de organoides y esferoides vivos mientras aún están en el hidrogel.

<table><tbody><tr><td>Etanol absoluto (EtOH)</td><td>Merck</td><td>8187602500</td><td>diluir en dH2O para hacer una solución al 30%, 50%, 70%, 80%, 90% y 96% y almacenar en RT</td></tr><tr><td>Acetona</td><td>Merck</td><td>8222512500</td><td>Tienda en RT</td></tr><tr><td>Alexa aglutinina de germen de trigo flúor y Hoechst&nbsp; en la solución salina equilibrada de Hank (HBSS) &nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>I34406</td><td>Image-IT LIVE Kit de etiquetado nuclear y membrana plasmática, almacenar a -20 & grados; C</td></tr><tr><td>Alfa-1-Fetoproteína (AFP) Anticuerpo policlonal concentrado y prediluido</td><td>Biocare Medical</td><td>CP 028 A Almacenar</td><td>en +4 &deg; C</td></tr><tr><td>Anticuerpo antialbúmina</td><td>Abcam</td><td>EPR20195</td><td>Store en +4 &deg; C, Dilución: 1:50</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-beta galactosidasa,</td><td>Abcam</td> policlonal de pollo <td>134435</td><td>Almacenar a +4 & grados; C, Dilución: 1:25</td></tr><tr><td>Anti-citoqueratina 5</td><td>Abcam</td><td>53121</td><td>Almacenar en +4 &deg; C, dilución: 1:100</td></tr><tr><td>Arginasa-1 Anticuerpo monoclonal de conejo concentrado y prediluido</td><td>Biocare Medical</td><td>ACI 3058 A, B</td><td>Almacenar a +4 &deg; C, Dilución: 1:50</td></tr><tr><td>Cloruro de calcio (CaCl2)</td><td>Sigma</td><td>C1016-500G</td><td>Disolver en el fijador de Karnovsky para hacer 2 mM de CaCl2; almacene en RT</td></tr><tr><td>Cell Counting Kit 8 (WST-8 / CCK8)</td><td>Abcam</td><td>ab228554</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga, 15 mL&nbsp;</td><td>Tubos</td><td></td> de centrífuga Nest 601051<td></td></tr><tr><td>, 50 mL&nbsp;</td><td>Nest</td><td>602052</td><td></td></tr><tr><td>Clase II Cabina de seguridad microbiológica Bio II Advance Plus</td><td>Telstar</td><td>EN12469</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de CO2</td><td>Panasonic</td><td>KM-CC17RU2</td><td></td></tr><tr><td>Rejillas de cobre</td><td>Ciencias de la Microscopía Electrónica</td><td>G100-Cu</td><td>Secciones ultrafinas colocadas en las rejillas; Malla cuadrada de 100 líneas/pulgada</td></tr><tr><td>Secador de puntos críticos</td><td>Leica</td><td>EM CPD300</td><td>Para el secado de muestras biológicas para aplicaciones SEM en acetona absoluta</td></tr><tr><td>DAB/AEC mezcla de solución de cromógeno &nbsp;</td><td>Tienda Sigma Aldrich</td><td>AEC101</td><td>en +4 &deg; C</td></tr><tr><td>Cuchillo de diamante</td><td>Diatome</td><td>Ultra 45&deg;, 40-US</td><td>Uso para secciones ultrafinas para TEM</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide para biología molecular</td><td>Biofroxx</td><td>67-68-5</td><td></td></tr><tr><td>Plástico Desechable Pasteur Pippettes Nest</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM - Dulbecco's Modified Eagle Medium</td><td>Gibco</td><td>41966-029</td><td>Tienda en +4 &deg; C</td></tr><tr><td>Eosina Y Solución Alcohólica</td><td>Brillante Slide</td><td>2.BS01-105-1000</td><td></td></tr><tr><td>Resina Epon&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>45359-1EA-F Kit de</td><td>medio de incrustación epoxi, almacenar en +4 &deg; C</td></tr><tr><td>Suero Fetal Bovino con Aditivo Fortificante</td><td>Pan Biotech</td><td>P30-3304</td><td>Tienda en +4 &deg; C</td></tr><tr><td>Solución de congelación (FS)</td><td>Cellorama</td><td>CellO-F</td><td>Almacene a +4 &deg; C</td></tr><tr><td>Fabricante de cuchillos de vidrio</td><td>Leica</td><td>EM KMR3</td><td>Para fabricar cuchillos de vidrio de 8 mm de espesor</td></tr><tr><td>Tiras de cuchillos de vidrio (Tamaño 8 mm x 25,4 mm x 400 mm)</td><td>Leica</td><td>7890-08</td><td>Uso para secciones ultra o semifinas para TEM</td></tr><tr><td>Solución acuosa de glutaraldehído, grado EM, 25%&nbsp;</td><td>Electrónica Microscopy Sciences</td><td>16210</td><td>Diluir en dH2O para hacer una solución al 2,5% y almacenar a +4 & grados; C</td></tr><tr><td>Solución de glicerol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>56-81-5</td><td>Almacenar a -20 C, Dilución: 1:100</td></tr><tr><td>Anticuerpo secundario IgY (H+L) anti-pollo de cabra, Alexa, 647</td><td>Invitrogen</td><td>A32933</td><td>Almacenar en RT</td></tr><tr><td>Anticuerpo secundario IgG (H+L) anti-ratón de cabra, DyLight, 488</td><td>Invitrogen</td><td>35502</td><td>Almacenar en +4 &deg; C,&nbsp; Dilución :1:50</td></tr><tr><td>Anticuerpo secundario anti-ratón IgG (H+L) de cabra, DyLight, 550</td><td>Invitrogen</td><td>84540</td><td>Almacenar en +4 &deg; C,&nbsp; Dilución :1:50</td></tr><tr><td>Anticuerpo secundario IgG (H+L) anti-conejo de cabra, DyLight, 488</td><td>Invitrogen</td><td>35552</td><td>Almacenar en +4 &deg; C,&nbsp; Dilución :1:50</td></tr><tr><td>Anticuerpo secundario anti-conejo IgG (H+L) de cabra, DyLight, 550</td><td>Invitrogen</td><td>84541</td><td>Almacenar en +4 &deg; C</td></tr><tr><td>Hematoxilina Harris &nbsp;</td><td>Diapositiva brillante</td><td>2.BS01-104-1000</td><td></td></tr><tr><td>Células HepG2</td><td>ATCC</td><td>HB-8065</td><td>Almacenar en tanque de nitrógeno</td></tr><tr><td>Humano/Rata Anticuerpo OV-6 Ratón monoclonal IgG1 clon # OV-6</td><td>R& D Systems</td><td>MAB2020</td><td>Tienda a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Hidrogel</td><td>Corning 354248</td><td></td><td>Matrigel, Matriz de Membrana Basal de Alta Concentración (HC), sin LDEV, 10 mL, Almacenar a -20 & grados; C</td></tr><tr><td>Hidrogel</td><td>Corning 354234</td><td></td><td>Matrigel, Matriz de Membrana Basal, sin LDEV, 10 mL, almacenar a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Hidrogel</td><td>ThermoFischer Scientific A1413201</td><td></td><td>Geltrex, Factor de crecimiento reducido sin LDEV Hidrogel de matriz de membrana basal</td></tr><tr><td></td><td>Biotechne, R& D Systems</td><td>BME001-01</td><td>Cultrex Ultramatrix RGF BME, Tienda en -20 &deg; C</td></tr><tr>Fijador <td></td><td></td><td>de Karnovsky</td><td>%2 PFA, %2.5 Glutaraldehído en tampón de cacodilato de 0.15 M, 2 mM de CaCl2; preparar fresco; uso para TEM & Muestras SEM</td></tr><tr><td>de ácido L-aspártico</td><td>Sigma</td><td>11189-100G</td><td>Almacenar en RT</td></tr><tr>Solución <td></td><td></td> de<td>aspartato de plomo</td><td>Disuelva 40 mg de ácido aspártico en 10 mL ddH2O y agregue 66 mg de nitrato de plomo. La solución se estabiliza a 60 & grados; C y ajustar el pH a 5; Tienda</td></tr><tr>de<td>Nitrato Electrónico de Nitrato de Plomo</td> Sciences <td>17900</td><td>en RT</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio Confocal Leica Microscopio Confocal</td> de Barrido Láser <td>Leica</td><td>DMi8</td><td></td></tr><tr><td>LSM 700 Lector</td> de microplacas <td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dispositivo</td> multipropósito <td>Biotek Synergy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(MD)</td><td>Cellorama</td><td>CellO-M</td><td></td></tr><tr><td>Tinción de ADN nuclear</td><td>Invitrogen</td><td>H3569</td><td>Hoechst 33258, Pentahidrato (bis-Benzimida) - 10 mg/mL Solución en agua, almacenar a +4 & deg; C</td></tr><tr><td>Tinción de ADN nuclear</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>62248</td><td>DAPI solución, almacenar a +4 &deg; </td></tr><tr><td>C Tetróxido de osmio (OsO4), 4%</td><td>Ciencias de la Microscopía Electrónica</td><td>19190</td><td>Diluir en dH2O para hacer una solución al 2%; almacenar a +4 & deg; C y en recipiente hermético; proteger la luz</td></tr><tr><td>anticuerpo Ov6</td><td>R& D systems</td><td>MAB2020</td><td>Almacenar en +4 &deg; C</td></tr><tr><td>Solución de paraformaldehído (PFA), 4%&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>1.04005.1000</td><td>Disolver PFA al 4% en dH2O y hervir, enfriar y alícuota; almacenar a -20 & grados; C</td></tr><tr><td>Solución de paraformaldehído al 4% en PBS, 1 L</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-281692</td><td>Tienda en +4 &deg; C</td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS), tabletas</td><td>MP Biomedicals, LLC</td><td>2810305</td><td></td></tr><tr><td>solución</td><td></td><td></td> posfijadora<td>%2 OsO4, %2.5 Ferrocianuro de potasio en dH2O; preparar</td></tr><tr><td>una solución acuosa fresca de ferrocianuro de potasio, 5%&nbsp;</td><td>Ciencias de la Microscopía Electrónica</td><td>26603-01</td><td>Tienda en RT</td></tr><tr><td>Primovert - Microscopio de campo claro invertido - ZEISS</td><td>Zeiss</td><td>N.º de artículo: 491206-0001-000</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga de fondo redondo, 2 mL</td><td></td> Microscopía electrónica de barrido Nest <td>620611</td><td></td></tr><tr><td>con accesorio STEM</td><td>Zeiss</td><td>GeminiSEM 500</td><td>Utilizamos un detector de electrones secundarios (SE) Inlens a 2-3 kV para micrografías electrónicas de barrido y un detector STEM a 30 kV para micrografías electrónicas de transmisión.</td></tr><tr><td>SensiTek HRP Anti-Polyvalent Lab Pack</td><td>ScyTek Laboratories</td><td>SHP125</td><td>Tienda en +4 &deg; C</td></tr><tr><td>Tampón de cacodilato de sodio, 0,4 M, pH 7,2</td><td>Electrónica Microscopy Sciences</td><td>11655</td><td>Diluir en dH2O para hacer 0,2 M y almacenar a +4 &deg; C</td></tr><tr><td>Anticuerpo ATPasa alfa 1 de sodio/potasio [M7-PB-E9]</td><td>GeneTex</td><td>GTX22871</td><td>Almacenar a -20 & grados; </td></tr><tr><td>C Solución para el marcaje de inmunofluorescencia (S-IF)</td><td>Cellorama</td><td>CellO-IF</td><td>Almacenar a +4 &deg; </td></tr><tr><td>C Solución para inmunohistoquímica (S-IHC)</td><td>Cellorama</td><td>CellO-P</td><td>Store a +4 &deg; C</td></tr><tr><td>Dispositivo de recorte de muestras</td><td>Leica</td><td>EM TRIM2</td><td>Para preparar el bloque de muestras epon a ultramicrótomo</td></tr><tr><td>Recubridor de pulverización catódica</td><td>Leica</td><td>EM ACE200</td><td>Cubrir las muestras SEM con 6 nm de oro/paladio durante 90 s</td></tr><tr><td>Tiocarbohidrazida (TCH)</td><td>Sigma</td><td>223220-5G</td><td>Diluir en dH2O para hacer una solución al 0,5% y filtrar con 0,22 &micro; Filtro de membrana M; tienda en RT; preparar una solución fresca</td></tr><tr><td>de Trypan Blue, 0.4%</td><td>Gibco</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Ultra gel superpegamento</td><td>Pattex</td><td>PSG2C</td><td>Para pegamento Bloque de epón polimerizado con muestra en el soporte Bloque de epón</td></tr><tr><td>Ultramicrótomo</td><td>Leica</td><td>EM UC7</td><td>Para preparar secciones ultra o semifinas de alta calidad para microscopía electrónica de transmisión (TEM)</td></tr><tr><td>Puntas de pipeta universales, 10 &micro; L</td><td>Nest</td><td>171215-1101</td><td></td></tr><tr><td>Puntas de pipeta universales, 1000 &micro; L</td><td>Isolab</td><td>L-002</td><td></td></tr><tr><td>Puntas de pipeta universales, 200 &micro; L&nbsp;</td><td>Nest</td><td>110919HA01</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de uranilo</td><td>Ciencias de la microscopía electrónica</td><td>22400</td><td>Diluir en dH2O para hacer una solución al 2% y filtrar con 0.22 &micro; Filtro de membrana M; mantenga el recipiente herméticamente cerrado, almacene en RT</td></tr></tbody></table>

cultivo, congelación, procesamiento e imágenes de organoides y esferoides completos mientras aún están en un hidrogel

Culturing, Freezing, Processing, and Imaging of Entire Organoids and Spheroids While Still in a Hydrogel

Los organoides y esferoides, estructuras de cultivo tridimensionales en los laboratorios de cultivo celular, son cada vez más reconocidos como modelos superiores en comparación con los modelos de cultivo bidimensionales, ya que imitan mejor el cuerpo humano y tienen ventajas sobre los estudios en animales. Sin embargo, estos estudios comúnmente enfrentan problemas con la reproducibilidad y la consistencia. Durante los largos procesos experimentales, con transferencias de organoides y esferoides entre diferentes recipientes de cultivo celular, pipeteo y centrifugación, estas estructuras de crecimiento 3D susceptibles y frágiles a menudo se dañan o se pierden. En última instancia, los resultados se ven afectados significativamente, ya que las estructuras 3D no pueden mantener las mismas características y calidad. Los métodos descritos aquí minimizan estos pasos estresantes y garantizan un entorno seguro y consistente para organoides y esferoides a lo largo de la secuencia de procesamiento mientras todavía están en un hidrogel en un dispositivo multipropósito. Los investigadores pueden cultivar, congelar, descongelar, procesar, teñir, etiquetar y luego examinar la estructura de organoides o esferoides bajo varios instrumentos de alta tecnología, desde microscopios confocales hasta microscopios electrónicos, utilizando un solo dispositivo multipropósito. Esta tecnología mejora la reproducibilidad, fiabilidad y validez de los estudios, al tiempo que mantiene un entorno estable y protector para las estructuras de cultivo 3D durante el procesamiento. Además, eliminar pasos estresantes minimiza los errores de manejo, reduce el tiempo necesario y disminuye el riesgo de contaminación.

El presente artículo representa un dispositivo multipropósito (MD) y metodologías complementarias para el cultivo, la congelación, la descongelación, la tinción histológica, la tinción inmunohistoquímica, el etiquetado de inmunofluorescencia, el recubrimiento y el procesamiento de organoides o esferoides completos mientras aún se encuentran en un hidrogel en un solo entorno de diseño único. El estudio actual fue diseñado para preparar esferoides de cáncer de hígado HepG2 en 35 gotas de hidrogel en 35 DM. Los experimentos...

El presente estudio describe metodologías para cultivar, congelar, descongelar, procesar, teñir, etiquetar y examinar esferoides y organoides completos bajo varios microscopios, mientras permanecen intactos en un hidrogel dentro de un dispositivo multipropósito.

Cultivo, congelación, procesamiento e imágenes de organoides y esferoides completos mientras aún están en un hidrogel

Organoids and spheroids, three-dimensional growing structures in cell culture labs, are becoming increasingly recognized as superior models compared to ...

Los organoides y esferoides, al ser muy frágiles, se dañan seriamente durante la manipulación. Nuestro protocolo garantiza que estas estructuras de cultivo 3D permanezcan intactas durante varios procesos, aumentando así la precisión, la reproducibilidad, la fiabilidad y la repetibilidad. El investigador puede cultivar, congelar, descongelar, procesar, teñir, etiquetar y examinar organoides y esferoides completos bajo varios microscopios mientras permanecen intactos en un hidrogel dentro de un solo dispositivo multipropósito.Permite la creación de un modelo de enfermedad y el seguimiento de pasos secuenciales en un dispositivo multipropósito. La tecnología aporta más precisión al examinar biomarcadores para el diagnóstico y pronóstico de enfermedades. Este método se puede aplicar a cualquier sistema de cultivo 3D, incluidos organoides, esferoides, células individuales u organismos vivos.Para comenzar el cultivo organoide o esferoide, coloque el hidrogel correctamente descongelado en hielo dentro de una campana de flujo laminar durante 15 minutos. Además, mantenga el tubo que contiene una bolita del carcinoma hepatocelular, o células HEPG2, en hielo. A continuación, coloque de 30 a 35 microlitros de hidrogel al 100% dentro del nicho del dispositivo multipropósito precalentado para crear una gota de gel, coloque 10, 000 células HEPG2 en el centro de la parte superior de la gota de hidrogel e incube la configuración a 37 grados centígrados durante 15 minutos.Después de la incubación, cubra la gota de hidrogel con 200 microlitros de Dulbecco's Modified Eagle Medium, o DMEM, que contiene 10% de suero bovino fetal, o FBS. Coloque la tapa en el dispositivo correctamente, permitiendo el flujo de gas, antes de colocarlo en la incubadora. Cada dos días, alimente las células con 200 microlitros de DMEM que contienen 10% FBS.Verifique el crecimiento de los esferoides bajo un microscopio invertido. Antes de comenzar el etiquetado de inmunofluorescencia de los organoides, caliente los medios y soluciones necesarios a 37 grados centígrados. Aspirar el medio de cultivo celular que rodea la gota de hidrogel antes de agregar 200 microlitros de paraformaldehído al 4% precalentado a 37 grados centígrados y fijarlo colocándolo en una incubadora a 37 grados centígrados durante 15 a 30 minutos.Luego, aspire el fijador y lave la solución para el etiquetado de inmunofluorescencia, o SIF, precalentada a 37 grados centígrados tres veces durante 10 minutos cada una. Agregue agua destilada al área que rodea el nicho para proporcionar humedad antes de continuar con los siguientes pasos. Aspire el SIF que rodea la gota de hidrogel y agregue 100 microlitros de la solución de anticuerpos primarios precalentados en SIF al hidrogel antes de incubarlo a 37 grados centígrados durante 30 a 60 minutos.Luego, aspire la solución de anticuerpos primarios y lave con SIF precalentado a 37 grados centígrados tres veces durante 10 minutos cada una. Después del lavado, aspire el SIF restante y agregue 100 microlitros de la solución de anticuerpos secundarios precalentados en SIF al hidrogel. Incubar el hidrogel a 37 grados centígrados en la oscuridad durante 30 a 60 minutos.Después de la incubación, aspire la solución de anticuerpos secundarios y lave la gota de hidrogel con PBS a 37 grados centígrados tres veces en la oscuridad durante 10 minutos cada una. A continuación, aspire el PBS residual e incube el hidrogel con 100 microlitros de tinción de ADN nuclear que contenga medio de montaje o glicerol a 37 grados centígrados en la oscuridad. Llene el nicho con glicerol para evitar que se seque antes de cerrar herméticamente el dispositivo multiusos que contiene el hidrogel.Para examinar los organoides por microscopía confocal, ajuste los parámetros del microscopio siguiendo las instrucciones dadas en el manuscrito. Para congelar los organoides, aspire los medios de cultivo celular, agregue 200 microlitros de la solución de congelación precalentada e incube la muestra a 37 grados centígrados durante una hora. Cierre bien la tapa del dispositivo antes de colocarlo dentro de una caja de espuma.Coloque esta caja de espuma en otra caja de espuma y cierre ambas cajas de espuma herméticamente. Mantenga la caja a menos 20 grados centígrados durante dos horas, luego déjela durante la noche en un congelador de menos 80 grados centígrados. Para almacenar los organoides durante más de seis meses, retire el dispositivo multiusos que contiene los organoides de las cajas y transfiéralo al tanque de nitrógeno líquido.Para descongelar los organoides, saque el dispositivo multipropósito que contiene la muestra del congelador o del tanque de nitrógeno líquido y colóquelo directamente en una incubadora a 37 grados centígrados. Una vez descongelado, aspire suavemente la mezcla de solución de congelación y medio antes de agregar medio fresco y proceder a obtener imágenes del hidrogel organoide de montaje completo. En imágenes en vivo, los organoides en crecimiento dentro del hidrogel se hicieron visibles de tres a cinco días después de insertar el pellet celular, especialmente en la periferia de la cúpula de hidrogel.Aquí se muestra la serie temporal de imágenes a diferentes niveles de un hidrogel que contiene esferoides bajo un microscopio de contraste de fase invertida. Las imágenes de microscopía confocal de los organoides vivos de montaje completo después de teñir en vivo la membrana celular y el núcleo mostraron una densidad de etiquetado similar en la periferia y el centro. Además, el etiquetado de inmunofluorescencia de los esteroides de montaje completo podría realizarse con éxito con un anticuerpo, dos anticuerpos, así como tres anticuerpos, eliminando cualquier necesidad de pasos de tratamiento adicionales.El análisis representativo demuestra dos organoides de las vías respiratorias marcados con inmunofluorescencia en un dispositivo. Las imágenes SEM de todos los esferoides en el dispositivo multipropósito y 10 imágenes de esteroides seccionados indicaron una arquitectura 3D bien conservada de esferoides, orgánulos citoplasmáticos y otras características celulares ultraestructurales, lo que demuestra la efectividad del protocolo descrito. La irregularidad en los límites de la cúpula de hidrogel fue evidente después de congelar las muestras.Sin embargo, el tamaño y la redondez de los esferoides permanecieron similares. Se observó migración celular en la superficie de cultivo después de descongelar las muestras congeladas. La técnica es muy simple.Sin embargo, el investigador debe ser muy cuidadoso al aspirar o agregar cualquier líquido que rodee la gota de hidrogel para evitar dañar la muestra. El investigador puede observar la misma muestra en un solo dispositivo utilizando un microscopio de alta tecnología y realizar un estudio correlativo.

culturing-freezing-processing-imaging-entire-organoids-spheroids

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Este protocolo se generó como un medio para producir organoides cerebrales de una manera simplificada y de bajo costo sin factores de crecimiento exógenos o matriz de membrana de sótano sin dejar de mantener la diversidad de tipos de células cerebrales y muchas características de la organización celular.

Un método autodirigido estático para generar organoides cerebrales a partir de células madre embrionarias humanas

Toda la estructura 3D y el contenido celular de los organoides, así como su parecido fenotípico con el tejido original se pueden capturar utilizando el protocolo de imágenes 3D de resolución de una sola célula descrito aquí. Este protocolo se puede aplicar a una amplia gama de organoides que varían en origen, tamaño y forma.

Imagen tridimensional de resolución de una sola célula de organoides intactos

Aquí, proporcionamos protocolos detallados, robustos y complementarios para realizar imágenes de tinción y resolución subcelular de modelos de cultivo celular tridimensionales fijos que van desde 100 μm hasta varios milímetros, lo que permite la visualización de su morfología, composición de tipo celular e interacciones.

Tinción e imágenes de alta resolución de modelos organoides y esferoides tridimensionales

Aquí, se describen métodos detallados para generar, mantener y caracterizar organoides de intestino delgado y colon derivados de células madre pluripotentes humanas. Estos métodos están diseñados para mejorar la reproducibilidad, ampliar la escalabilidad y disminuir el tiempo de trabajo necesario para el recubrimiento y el paso de organoides.

Generación, mantenimiento y caracterización de organoides intestinales y colónicos derivados de células madre pluripotentes humanas

Aquí se presenta un protocolo detallado para describir un modelo organoide in vitro de células epiteliales nasales humanas. El protocolo tiene opciones para mediciones que requieren equipos de laboratorio estándar, con posibilidades adicionales para equipos y software especializados.

Cultivo e imágenes de organoides epiteliales nasales humanos

Aquí, describimos un método para generar organoides de glioblastoma (GBM) a partir de muestras primarias de pacientes o cultivos celulares derivados de pacientes y mantenerlos hasta la madurez. Estos organoides GBM contienen poblaciones celulares fenotípicamente diversas y recrean microambientes tumorales ex vivo.

Mantenimiento de la diversidad celular del glioblastoma humano ex vivo mediante cultivo de organoides tridimensionales

Este artículo presenta un protocolo de fabricación para un nuevo tipo de sustrato de cultivo con cientos de microcontenedores por mm2, en el que los organoides pueden ser cultivados y observados utilizando microscopía de alta resolución. También se detallan los protocolos de siembra celular e inmunotinción.

Una plataforma de alto rendimiento para el cultivo y la obtención de imágenes 3D de organoides

Aquí, presentamos un protocolo que permite la fabricación rápida, robusta y barata de esferoides tumorales seguida de encapsulación de hidrogel. Es ampliamente aplicable ya que no requiere equipo especializado. Sería particularmente útil para explorar las interacciones esferoides-matrices y construir modelos de fisiología tisular o patología in vitro .

Fabricación y encapsulación de esferoides tumorales en hidrogeles de polietilenglicol para el estudio de las interacciones esferoide-matriz

Este estudio presenta una metodología rentable y eficiente para generar estructuras celulares en 3D utilizando un sistema basado en sellos para crear micropocillos en moldes de agarosa. El sistema promueve la formación de esferoides/organoides uniformes, mejorando así las interacciones celulares. Este enfoque reduce la variabilidad experimental y apoya las aplicaciones en pruebas de fármacos e ingeniería de tejidos.

Generación de esferoides/organoides tridimensionales a partir de cultivos celulares bidimensionales utilizando un novedoso dispositivo de estampado

Presentamos un protocolo paso a paso para imágenes tridimensionales, sin etiquetas y de alta resolución de organoides mediante holotomografía de baja coherencia. Este protocolo detalla la preparación del cultivo de organoides, la adquisición de imágenes y el análisis computacional de imágenes, lo que permite la visualización en tiempo real de la dinámica estructural y las respuestas a los fármacos en organoides vivos.

Imágenes 3D de alta resolución y análisis de aprendizaje automático sin etiquetas de organoides intestinales mediante holotomografía de baja coherencia

Aprenda a cultivar, congelar y procesar organoides y esferoides completos en hidrogel utilizando un dispositivo multipropósito. Este método mejora la reproducibilidad y permite el análisis de biomarcadores con microscopía confocal.

Cultivo, congelación, procesamiento e imágenes de organoides y esferoides completos mientras aún están en un hidrogel

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