Imágenes 3D de alta resolución y análisis de aprendizaje automático sin etiquetas de organoides intestinales mediante holotomografía de baja coherencia

Nuestro objetivo es establecer métodos de imagen en tiempo real y sin etiquetas al monitorear los cambios biofísicos en organoides vivos durante el desarrollo y en respuesta a los medicamentos. Este protocolo facilita la escala optimizada de imágenes y pruebas de medicamentos no invasivas en organoides vivos respaldados por mutaciones impulsadas por IA y selección cuantitativa de texturas para la investigación biomédica. Trazamos para integrar aún más imágenes 3D sin etiquetas y un análisis de un año para estudios de organoides no invasivos de alta resolución en el modelado de enfermedades y la medicina precisa.

Para comenzar, aspire el medio gastado de cada pocillo de una placa de 48 pocillos que contiene la matriz extracelular. Agregue 200 microlitros de solución de recuperación celular a cada pocillo e incube a cuatro grados centígrados durante 30 minutos. Con una pipeta, recoja suavemente la suspensión de organoides y transfiérala a un tubo de microcentrífuga.

Centrifugar el tubo a 150 g durante tres minutos, luego retirar con cuidado el sobrenadante. Para disociar el pellet mecánicamente, resuspender en 200 microlitros de medio de cultivo y pipetear la suspensión hacia arriba y hacia abajo de 20 a 30 veces con una pipeta P200 antes de centrifugarla durante tres minutos. Después de la centrifugación y la eliminación del sobrenadante, agregue matriz extracelular media y fresca, o ECM, en una proporción de uno a cuatro al gránulo y pipetee suavemente para mezclar bien.

Dispense 15 microlitros de la mezcla por domo en cada pocillo de una placa de 48 pocillos. Coloque la placa boca abajo en una incubadora de dióxido de carbono al 5% a 37 grados Celsius durante una hora para permitir la polimerización de la ECM. Después de la polimerización, agregue 200 microlitros de medio de cultivo fresco a cada pocillo y llene los pocillos exteriores vacíos con PBS.

Para preparar la muestra para la obtención de imágenes, dispense 15 microlitros de cúpula ECM organoide en un plato de imágenes con fondo de cubreobjetos número 1.5 e incube a temperatura ambiente durante un minuto. Coloque la placa boca abajo en una incubadora de dióxido de carbono al 5% a 37 grados centígrados durante una hora. Luego, agregue suavemente suficiente medio de cultivo para sumergir completamente los organoides.

A los cinco días después del paso, lave la muestra dos o tres veces con PBS inmediatamente antes de la imagen. A continuación, para obtener imágenes, encienda el controlador ambiental. La unidad de control de la cámara ajustará automáticamente la temperatura a 37 grados Celsius y el dióxido de carbono al 5%Presione el botón Door para abrir la puerta.

Agregue agua para formar una capa delgada dentro del pozo de la cámara. Coloque el plato de imágenes en el soporte del vaso, insértelo en la cámara de imágenes y asegúrelo con un pasador para evitar movimientos. Cierre la puerta para evitar interferencias de luz externa.

Ahora, inicie el software TomoStudio X e inicie sesión. Haga clic en Iniciar para abrir la ventana principal y, a continuación, haga clic en Agregar proyecto en la esquina superior izquierda y asigne el experimento. Confirme que se ha seleccionado el tipo de medio correcto para el uso adecuado del índice de refracción.

Haga clic en el pocillo deseado en el panel y luego haga clic en Crear en la parte superior para registrar el pocillo como una muestra. Luego, haga clic en Configuración de ROI en la esquina superior derecha para definir la región de interés en el plato. Una vez configurado, haga clic en Ejecutar experimento en la esquina inferior derecha para abrir la ventana Adquisición de imágenes.

Haga clic en Cargar recipiente en la esquina para mostrar una imagen de campo brillante. Ajuste la posición Z con los botones Z y Z para enfocar la imagen. En la pestaña Imagen única, ajuste el tamaño del ROI.

Capture organoides en un campo de visión de 160 micrómetros por 160 micrómetros y adquiera pilas de hasta 140 micrómetros de profundidad. Vaya a la pestaña Imágenes de lapso de tiempo para configurar imágenes a largo plazo y establecer la duración y el tiempo de intervalo deseados. Haga clic en el icono Escanear para capturar la ubicación actual del ROI.

Haga clic en el botón BF para ajustar los valores de intensidad y exposición para imágenes de campo claro. Mueva el cuadro ROI en el panel Vista previa para seleccionar el ROI. Una vez seleccionado el ROI deseado, haga clic en Agregar punto en la parte inferior, se creará la lista de puntos de imagen.

Ahora, haga clic en Adquirir para comenzar a crear imágenes y adquirir los datos de imagen sin procesar. Inicie el servidor de procesamiento HTX haciendo clic en el icono Escritorio. Arrastre y suelte archivos de imagen RAW en el servidor de procesamiento HTX.

Haga clic en Procesar para generar un archivo TCF a partir del archivo de imagen sin procesar. Inicie TomoAnalysis Viewer haciendo clic en el icono Escritorio. Cargue los archivos TCF procesados arrastrándolos y soltándolos en la ventana del visor.

Haga doble clic en la miniatura de un archivo para abrir el tomograma ROI. Examine la vista 2D navegando por los planos X, Y, Z mediante los controles de zoom, panorámica y desplazamiento. Haga clic en el icono de la vista de renderizado MIP de la izquierda para cambiar al modo de renderizado 3D.

Navegue por la vista 3D girando, haciendo zoom y encuadrando la imagen. Para la segmentación de imágenes basada en el aprendizaje automático, exporte el archivo de imagen TCF al formato HDF5 para asegurarse de que los datos estén en un formato multidimensional, compatible con ilastik. Abra ilastik y navegue hasta Nuevo proyecto.

Seleccione Clasificación de píxeles en la sección Flujo de trabajo de segmentación y guarde el proyecto en una carpeta designada. Para cargar el archivo HGF5, vaya a la pestaña Datos de entrada, haga clic en Agregar nuevo archivo, seleccione el conjunto de datos H5 adecuado y verifique las asignaciones correctas de canales de imagen. Ahora, navegue a la pestaña Selección de características para elegir características como color, intensidad, borde y textura para optimizar la segmentación.

En la pestaña Entrenamiento, etiquete las regiones organoides y no organoides con pinceladas de diferentes colores. Haga clic en Actualización en vivo para obtener una vista previa de los resultados de la segmentación y realizar ajustes, si es necesario. Una vez hecho esto, vaya a la pestaña Exportación de predicciones.

Seleccione Segmentación simple como origen para exportar las predicciones etiquetadas y haga clic en Exportar todo. Establezca el formato de exportación en H5 o TIFF en función de los requisitos de análisis. Para el análisis cuantitativo, abra el archivo de codificación complementario 2.

Designe las rutas de carpeta adecuadas para el archivo de máscara y el archivo TCF correspondiente dentro del script. Ejecute el código para iniciar el análisis cuantitativo. El código calculará el volumen de organoides, la densidad de proteínas y el contenido total de proteínas para cada conjunto de datos.

Esta figura ilustra las reconstrucciones tridimensionales de índice de refracción de alta resolución utilizadas para visualizar la morfología general de los organoides del intestino delgado. Las reconstrucciones renderizadas revelan claras diferencias estructurales entre los organoides tratados con vehículo y tratados con cisplatino en las tres profundidades de sección óptica. Los organoides tratados con cisplatino mostraron un volumen significativamente mayor, una menor densidad de proteínas y un mayor contenido total de proteínas, en comparación con los organoides tratados con vehículos a los 10 minutos posteriores al tratamiento, lo que indica una hinchazón estructural temprana y una composición de proteínas alterada.

Las imágenes de lapso de tiempo durante 24 horas mostraron que los organoides tratados con vehículos mantuvieron la integridad estructural, mientras que los organoides tratados con cisplatino experimentaron una degradación estructural progresiva, incluido el colapso de la cripta y el aumento de la disociación celular, lo que sugiere un daño citotóxico dependiente del tiempo. El seguimiento cuantitativo confirmó que los organoides tratados con vehículos aumentaron en volumen y contenido de proteínas con el tiempo, mientras que los organoides tratados con cisplatino mostraron una disminución dependiente del tiempo en ambos parámetros, lo que indica que el cisplatino suprimió el crecimiento e indujo la degradación celular. La densidad de proteínas se mantuvo estable en los organoides tratados con vehículos, pero disminuyó progresivamente en los organoides tratados con cisplatino durante el período de 24 horas, lo que sugiere una ruptura en la estructura celular y un aumento del espacio extracelular debido a la exfoliación.