Name: Humanizado modelo de ratón para el Estudio de Infecciones Bacterianas Targeting la microvasculatura (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-01T15:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 40 s
Description: Aprende a estudiar infecciones de Neisseria meningitidis en vasos sanguíneos humanos usando un modelo de ratón humanizado con injertos de piel. Este método permite observar la patología clínica de la infección meningocócica in vivo.

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Los autores desean agradecer a todos los miembros del laboratorio Dumenil, particularmente Silke Silva para la lectura crítica del manuscrito. El departamento de cirugía del Hôpital Européen Georges-Pompidou (HEGP), Dr. David Maladry. Michael Hivelin y el Dr. Patrick Bruneval, Departamento de Patología en HEGP. El Bioterio del PARCC, dirigido por Elizabeth Huc. Este trabajo fue apoyado por las siguientes agencias de subvención Marie Curie IEF comunión no. 273223 (KM), ATIP-Avenir Beca de INSERM, subvención equipos CODDIM (Ile de France Región), FRM (Fondation pour la recherche médicale) subvención equipo, el Laboratorio IBEID del consorcio excelencia, ANR (Agence Nationale pour la Recherche) subvención &quot; Insecto-en-flow &quot;. Los financiadores no tenía papel en el diseño del estudio, recogida y análisis de datos, la decisión de publicar, o la preparación del manuscrito.

1. Riesgos y Permisos <ol><li> Los comités de ética locales deben aprobar todos los protocolos de los animales. Este protocolo se realizó de conformidad con las directrices establecidas por la normativa francesa y europea para el cuidado y uso de animales de laboratorio (Decrets 87-848, 2001-464, 2001-486 y 2001-131 y Directiva Europea 2010/63/UE) y aprobado por el comité de ética local Comité d&#39;Ethique en Materia de Expérimentation Animale, Université Paris Descartes, Paris, Francia. No: CEEA34.GD.002.11. </li><li> Para la piel humana, fue obtenido por escrito el consentimiento informado del paciente y se realiza todos los procedimientos de acuerdo con las directrices nacionales franceses y aprobado por el comité de ética local, Comité d&#39;Evaluación Ethique de l&#39;INSERM IRB 00003888 FWA 00005881, Paris, Francia Opinión: 11-048 . </li><li> N. meningitidis es un patógeno humano potencialmente dañino y todas las precauciones necesarias se deben tomar al manipular el organismo. Estas precauciones incluyen la vacunación y que trabaja bajo nivel de Bioseguridad 2 condiciones. </li></ol> 2. Injerto de Piel <ol><li> Recoger la piel humana tan cerca de injerto tiempo como sea posible. La mayor parte de la piel en este trabajo proviene de las operaciones de cirugía plástica que involucran el área abdominal. Otras fuentes, como pecho, piernas e incluso la cara se han utilizado con éxito. </li><li> Preparar la muestra de piel humana mediante la limpieza de la superficie de la piel con EtOH al 70% y acostado en posición horizontal sobre una superficie bien limpia, preferiblemente bajo una campana de flujo. </li><li> Cortar 200-400 micras rodajas de la parte superior de la piel usando un dermatoma con grosor preestablecido. </li><li> Compruebe las rebanadas de la piel para la integridad y cortarlas en 2 cm x 2 cm cuadrados, y echarlo en PBS (sin cationes divalentes) si el injerto de forma inmediata o bien a 4 ° C en DMEM con 10% de suero para el almacenamiento a corto plazo (3-12 hr ). </li><li> Anestesiar 6-8 semanas de edad ratones SCID.bg (aproximadamente 20 g) con ketamina (100 mg / kg) y xilazina (10 mg / kg) injected ip </li><li> Una vez que los ratones se anestesiaron, comprobar la respuesta al dolor mediante la realización de una pizca dedo del pie, un método uniforme para dar reflejo doloroso. Aplicar gel para ojos para evitar el secado de la córnea y rasura el lado izquierdo del animal detrás del hombro, donde se colocará el injerto. Mantenga caliente del ratón sobre una almohadilla de calor todo el procedimiento. </li><li> Después de preparar el ratón para la cirugía, limpie la zona afeitada con EtOH al 70%. </li><li> Aplicar anestésico local por vía tópica para el sitio del injerto (Tronothane) y preparar el sitio del injerto mediante la eliminación cuidadosamente la capa superficial de la piel del ratón con un par de tijeras curvas. Tenga cuidado de no perturbar la vasculatura subyacente. </li><li> Quite la piel en una zona un poco más pequeña que el área de la rebanada de la piel humana. </li><li> Retire piel rebanada de PBS (o DMEM) y colocar sobre lecho del injerto, lo que garantiza el lado de la epidermis hacia arriba. Pasos 2.8 a 2.10 se debe realizar lo antes posible, lo que garantiza el lecho del injerto no se seque. </li><li> Alinear una de las esquinaso el borde y fijar con adhesivo tisular. Colocar cuidadosamente el resto de la piel rebanada de lecho del injerto, la colocación de pequeñas cantidades de goma de tejido alrededor de los bordes. Siempre corte la piel humana a tamaño en lugar de hacer que el lecho del injerto más grande. </li><li> No tire de la piel demasiado ajustado sobre el lecho del injerto como la piel del ratón es muy flexible. </li><li> Asegúrese de que el injerto se fija con pegamento de tejido en cada esquina. </li><li> Limpie el área con una solución de yodo. </li><li> Aplicar una curita con el área cojín sobre el injerto. Asegúrese de que el curita es firme pero no apretado y que la respiración del animal no se ve afectada. </li><li> Fijar el curita con cinta vestidor. </li><li> Permita que el animal se recupere en una superficie caliente. </li><li> Una vez despierto, devolver el animal a su jaula. Los animales se alojan 2-3 por jaula. </li><li> Compruebe regularmente los ratones durante la recuperación para detectar signos de dolor o angustia. 10-14 días después del injerto, quitar la tirita, teniendo cuidado de no perturbar el injerto. En nuestra experiencia, el dolor postoperatorio es pequeñomal. Sin embargo los animales deben ser controlados cada día en particular, en los pocos días siguientes operaciones. Criterios para el dolor o angustia son los siguientes. <ul><li> La pérdida de peso con el 10% </li><li> La apariencia física, piel, posición jorobada, ojos </li><li> El aumento de las tasas de respiración o del corazón </li><li> Disminución o inusuales movimientos. </li><li> Aumento de la temperatura corporal </li><li> Paracetamol En caso de que se detectaron signos de dolor se administra por vía oral (300 mg / kg, cada 4 horas). Puntos finales Humane se cumplan estrictamente si el dolor persiste. </li></ul></li><li> Si el injerto se ve seca se aplica el aceite de bebé cada 2-3 días para mantener la piel flexible. </li><li> El injerto está listo para la experimentación 21 días después del injerto. </li></ol> 3. Infección <ol><li> El día antes de la infección, preparar cepa bacteriana mediante extensión en placas de agar GCB con los antibióticos apropiados. Crecer durante la noche a 37 ° C en 5% de CO 2. </li><li> Preparación bacterias <ol&gt; <li> Bacterias y renovar la siembra en 5 ml de medio SFM endotelio humano con 10% de suero a un OD 600 de 0,05. </li><li> Incubar mientras se agita durante 2 horas en una incubadora (37 ° C en 5% de CO 2) con la tapa suelta, hasta una densidad bacteriana de aproximadamente OD 600 0,1. </li><li> Centrifugar las bacterias durante 3 min 15.000 rpm. </li><li> Aspirar el sobrenadante y resuspender en PBS y centrifugar de nuevo. </li><li> Repita el paso de lavado (2.2.4-2.2.5) dos veces. </li><li> Resuspender sedimento bacteriano en PBS. </li><li> Mida OD 600. </li><li> Hacer una cultura de cualquiera de OD 600 0,1 (10 8 UFC / ml), o OD 600 1,0 (10 9 UFC / ml). De esta concentración conocido, diluir a 10 7 UFC / ml. Trate de preparar las bacterias lo más cercano a tiempo de inyección como sea posible. </li></ol></li><li> Ratones <ol><li> Pesar ratones. </li><li> Anestesiar ratones con ketamina (100 mg / kg) y xilazina (10 mg / kg) inyectado ip </li><li> Una vez dormido, cdiablos que la respuesta del dolor está ausente por un dedo del pie-pinch, mantenga el ratón cálido con una almohadilla de calor y poner ungüento para los ojos a evitar que se sequen. </li><li> Dar cada ratón 8 mg de transferrina humana, se resuspendieron en solución salina o PBS, inyectó ip </li><li> Tomar una pequeña gota de sangre de la cola y se extendió sobre una placa de agar sangre para comprobar es estéril antes de la infección. </li><li> Inyectar 100 l 10 7 UFC / ml de cultivo bacteriano (10 6 CFU total) por vía intravenosa a través de la vena retro-orbital o la cola. Las mediciones de la CFU tomadas 5 min después de la inyección son consistentes independientemente del lugar de la inyección. </li><li> Después de unos pocos minutos, cortar el extremo de la cola y se extendió muestra de sangre en placas de agar con antibióticos apropiados con una dilución de 10 veces para establecer UFC sangre inmediatamente después de la infección. </li><li> Selle la cola con adhesivo tisular. </li><li> Después de la inyección, diluir el inóculo bacteriano y se extendió sobre placas de agar con antibióticos apropiados para establecer CFU. </li><li> Permitir a los ratonespara recuperar en una almohadilla de calor hasta que se levanten y se muevan </li><li> A las 6 horas después de la infección dibujar una pequeña cantidad de sangre de la cola, se diluye y la placa para establecer CFU a las 6 horas. </li><li> Incubar todas las placas de agar a 37 ° C en 5% de CO 2 durante la noche. </li></ol></li></ol> 4. Sacrificio <ol><li> En el momento elegido de la infección, anestesiar a los ratones con ketamina (100 mg / kg) y xilazina (10 mg / kg) inyectado ip </li><li> Una vez dormido, mantener caliente el ratón con una almohadilla de calor. </li><li> Cuando el reflejo del dolor se ha ido (toe-pinch), corte final de la cola y extraer la sangre. </li><li> Corre la sangre en placas de agar con antibióticos apropiados; dilución 1:10 5 l directa y 10 l para establecer CFU. </li><li> Sacrificar el ratón por dislocación cervical. </li><li> Después de sacrificar el ratón de acuerdo con todas las directrices institucionales y éticos relevantes, confirmar la muerte por la falta de ritmo de corazón. Haga una incisión en la línea media, cortar a través de la caja torácica, y hacer una incisión en el corat. </li><li> Recoge la mayor cantidad de sangre posible desde el corazón / cavidad torácica y colocar en un tubo estéril. </li><li> Eliminar órganos (por ejemplo, hígado, bazo, cerebro) en una placa de estéril. </li><li> Retire el injerto de piel y una sección de piel de ratón en la placa estéril. </li><li> Deseche el cuerpo del ratón. </li><li> Después de la sangre recogida se ha permitido para coagular durante 15 minutos, centrifugar que 15 min a 3000 rpm. </li><li> Extraer el plasma de la sangre y se almacena a -80 ° C para el análisis posterior, por ejemplo para la detección de citoquinas por los métodos basados ​​en ELISA o FACS. </li></ol> 5. Condes de órganos UFC <ol><li> Pesar homogeneizar tubos que contienen 500 l de uno PBS antes de la toma de muestras de biopsia. </li><li> Tomar 4 mm muestras de biopsia de cada tejido utilizando un punzón de biopsia estéril. </li><li> Coloque las biopsias en tubos de homogeneización previamente pesado que contienen 500 l de PBS. Homogeneizar las muestras de piel con 2 cuentas mm, utilice bolitas más pequeñas para otros órganos. </li><li> Coloque el resto de tproblemas en el 4% paraformaldehído (PFA) y se almacena a 4 ° C para microscopía (ver más abajo). </li><li> Pesar homogeneizar tubos que contienen las biopsias para determinar el peso de biopsia (para el cálculo posterior de tejido CFU / mg). </li><li> Homogeneizar las muestras. <ol><li> Homogeneizar el hígado, el bazo y el cerebro, a 6000 rpm durante 30 seg. </li><li> Homogeneizar las muestras de piel a 6.000 rpm durante 30 segundos y repita si es necesario. </li></ol></li><li> Spread diluciones de cada tubo homogeneizar en placas de agar y crecer durante la noche a 37 ° C en 5% de CO 2 para establecer recuentos de CFU de órganos. </li></ol> 6. Histología / inmunohistoquímica <ol><li> Fijación <ol><li> Corrija los tejidos en PFA al 4% durante la noche a 4 ° C. El paso de fijación puede ser más largo, si el almacenamiento durante períodos más largos colocar los tejidos en 0.25% PFA. </li><li> Enjuague los tejidos en PBS y luego se coloca en solución de sacarosa al 20% y volver a 4 ° C durante la noche o hasta que los tejidos se han hundido en la solución. </li><li> Lave los tejidos en PBS, cortado a la medida y el lugar en solución octubre (ya sea en un molde de tejido o se han adherido a una placa base). </li><li> Congelar rápidamente los tejidos en una placa de Petri que flota en nitrógeno líquido. </li><li> Después de la congelación, poner los tejidos en hielo seco antes de la transferencia a -80 ° C para su almacenamiento. </li></ol></li><li> Rebanar <ol><li> Quite los tejidos de -80 ° C y deje que se equilibre a -20 ° C en un criostato. </li><li> Tejidos Slice con un espesor de aproximadamente 10 a 15 micras y colocan en portaobjetos de microscopio recubiertos. </li><li> Tienda desliza a -20 ° C hasta que se necesite. </li></ol></li><li> La tinción <ol><li> Permitir a las diapositivas de la temperatura ambiente. </li><li> Dibuja alrededor de la rebanada en la diapositiva con un lápiz hidrofóbico. Espere 5-10 min. </li><li> Rehidratar / rebanada de lavado en PBS durante 5 min, repetir dos veces. </li><li> Permeabilizar rebanada en 0,1% de Triton en PBS durante 10 min. </li><li> Lave en PBS 2-3x durante 5 min. </li><li> Bloquear en PBS0,1% de Triton 1% de BSA durante entre 10-60 min dependiendo del anticuerpo o la mancha para ser utilizado. </li><li> Retire el amortiguador de bloqueo y añadir el anticuerpo primario diluido como se requiere en la memoria de secuencia. Incubar durante determinado tiempo. (A menudo 1 hora a temperatura ambiente o durante la noche a 4 ° C). </li><li> Lave en PBS 2-3x durante 5 min. </li><li> Aplicar el anticuerpo secundario diluido según sea apropiado en tampón Bock; DAPI se incluye típicamente en este paso. Incubar durante determinado tiempo, a menudo 1-2 horas la temperatura ambiente, en la oscuridad. </li><li> Lave en PBS 2-3x durante 5 min. </li><li> Monte en fade proteger los medios de montaje con una cubierta de vidrio y selle con barniz de uñas. </li><li> Imagen portaobjetos teñidos inmediatamente o se almacenan a 4 ° C. </li><li> Realice imágenes con una microscopía confocal fluorescente o configurado con filtros / láseres adecuados para fluoróforos utilizados. </li></ol></li><li> Histología <ol><li> Permitir a las diapositivas que se utilizarán para la histología a la temperatura ambiente. </li><li> Diapositivas de la mancha utilizando comoprotocolo de tinción hematoxilina tandard / eosina. <ol><li> Colocar los portaobjetos en parrilla corrediza. </li><li> Transferencia de rack con desliza entre las soluciones en el orden siguiente: </li><li> 2 segundos en agua corriente del grifo. </li><li> 3 min en solución de hematoxilina filtrada. </li><li> 10 segundos en agua corriente. </li><li> 10 segundos en agua destilada. </li><li> 10 segundos en etanol al 100%. </li><li> 2 seg en eosina filtrada. </li><li> 10 segundos en agua corriente. </li><li> 10 segundos en etanol 100% </li><li> 2 min en xileno x 3 (baño I, II, III). </li><li> Transferir inmediatamente y añadir unas gotas de pegamento de la fijación en cada portaobjetos, coloque la cubierta deslizante en la parte superior, eliminar las burbujas de aire, dejar secar durante un par de horas. </li><li> Imagen desliza bajo un microscopio de luz blanca estándar. </li></ol></li></ol></li></ol>

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</ol>

Los autores declaran no tener intereses financieros en competencia.

Los modelos animales son muy importantes para la investigación patogénesis bacteriana. Es imposible imitar completamente el medio ambiente in vivo en cultivo celular y se hace evidente que la interacción huésped-patógeno se ve influida por muchos factores dinámicos. La especificidad humana de algunos patógenos clínicamente importantes, como N. meningitidis, VIH, VHC, Plasmodium falciparum, Listeria monocytogenes, y Salmonella typhi ha limitado el uso de modelos in vivo para estas infecciones. Sin embargo, a medida que empezamos a entender qué pasos infecciosos están implicados en la especificidad, se están desarrollando modelos humanizados. El protocolo descrito aquí es una demostración de este con la introducción de microvasos humanos en ratones, lo que permite extensa infección in vivo con N. meningitidis, lo que resulta en el daño vascular y en ocasiones el desarrollo de erupciones purpúricas. Utilizando este modelo,hemos sido capaces de definir que las propiedades adhesivas de la PTF están involucrados en la colonización vascular in vivo mediante el uso de mutantes bacterianos y que el daño vascular se reduce en la ausencia de adhesión 18. Anteriormente, que circulan productos bacterianos han sido implicados en este daño, pero nuestros resultados sugieren un papel decisivo para la adhesión local y la colonización vascular. Esto abre nuevas posibilidades para el desarrollo de los objetivos de tratamiento novedoso. Si la adherencia de las bacterias patógenas podría ser bloqueado farmacéuticamente posiblemente podría prevenir el desarrollo de lesiones dérmicas y dar lugar a mejores resultados para los sobrevivientes de meningococo en términos de necrosis tisular, desbridamiento y amputaciones. El trabajo también ha demostrado la complejidad de la infección y la participación de la respuesta inmune y la cascada de la coagulación. Se identificaron la señalización de citoquinas humana en el suero de los ratones infectados a pesar de la relativamente pequeña cantidad de endotelio humano presente 18.Esto indicó una respuesta significativa de citocinas, junto con la infiltración de ratón poblaciones de células inmunes en la zona. Los modelos animales pueden, por supuesto, nunca replicar completamente la enfermedad humana y todos los resultados obtenido de ellos debe ser considerado con esto en mente. Por ejemplo, en este modelo, la sangre y las células circulantes son de origen murino y no podemos descartar que puedan comportarse de manera diferente a las células humanas. Una ventaja de esto, sin embargo, como se demuestra en nuestra publicación reciente 18, es la capacidad de diferenciar de señalización de origen desde el endotelio humano de la de las células de ratón circulantes. El fondo inmunocomprometido de los ratones utilizados en este modelo también permitiría la transferencia alogénico de poblaciones de células inmunes humanas, la adición de un aspecto adicional &quot;humanización&quot;. Sin embargo, el fondo de los ratones inmunocomprometidos puede enmascarar un papel para las células NK, T o B, que están ausentes o defectuosas en este modelo. El relativamente short plazo (24 horas) que se utiliza en este modelo se refiere principalmente a la respuesta innata, sino por infecciones a largo plazo y el desarrollo de la inmunidad otras opciones puede necesitar ser exploradas. La piel es un sitio importante para la infección por N. meningitidis, pero que tiene una cantidad relativamente pequeña de los vasos humanos también significa que la extrapolación de los datos a una infección sistémica que afecta numerosos órganos es difícil. Si bien este modelo permite el estudio del desarrollo de la lesión cutánea, no se incluyen los pasos importantes de la infección meningocócica, como epitelial y hematoencefálica cruce. Se necesita más desarrollo de estos modelos humanizados para tratar estos otros aspectos de la infección. Sin embargo, este modelo ofrece un gran potencial para numerosos patógenos específicos humanos, en particular los dirigidos a los vasos sanguíneos.

Sepsis meningocócica es una infección de la sangre nacido con frecuencia mortal causada por la bacteria patógena Neisseria meningitidis. Pacientes sepsis meningocócica a menudo presentan una erupción petequial o purpúrico en la piel que ha sido previamente asociado con la destrucción vascular causada por bacterias circulantes y productos bacterianos 1. Las biopsias de piel de pacientes clínicos muestran bacterias asociadas con los microvasos, a menudo llenando los vasos 2. Además de la fuga de las bacterias, trombosis extensa, la coagulación, la congestión vascular y se ve en las regiones purpúricas 3-5. Este daño vascular puede dar lugar a una extensa necrosis de la piel y los tejidos circundantes, lo que resulta en el desbridamiento e incluso la amputación en los sobrevivientes de meningococo. La comprensión de cómo la infección que causa este daño vascular es importante optimizar las estrategias de prevención y tratamiento. La mayoría de las investigaciones sobre la sepsis meningocócica se ha realizado in vitro sobrelíneas celulares humanas, debido a la especificidad humana de N. meningitidis. Muchos aspectos de la infección se han estudiado in vitro incluyendo la adhesión bacteriana, la respuesta de la célula huésped, así como la respuesta de citoquinas 6-9. Tipo IV pili (PTF) ha sido implicado como el principal orgánulo adherencia para N. meningitidis tanto en células epiteliales y endoteliales 10. También se ha demostrado que la adhesión de N. meningitidis a las células huésped es el estrés de cizalla dependiente y, por tanto, se cree que está relacionada con las tasas de flujo de sangre en la microvasculatura 11. Esto sugiere que los esfuerzos dinámicos de las bacterias se enfrentan en vivo son esenciales para la patogénesis. Sin embargo, es muy difícil para modelar el microambiente de los vasos pequeños in vitro. El receptor de adhesión para Neisseria Tfp aún se desconoce y, por tanto, las estrategias de knock-in para lograr la adhesión bacteriana en un modelo animal no se puede plantear en este momento. CD46 se sugirió a ser el receptor de la PTF y el animales transgénicos fueron producidos para actuar como modelos de ratón. Sin embargo, la infección en estos animales no conduce a la extensa infección o a la erupción cutánea 12,13 desarrollo. Otros modelos animales que han sido descritas para el aspecto bacteriemia de infección por Neisseria tienen en cuenta la preferencia bacteriana para la transferrina humana como una fuente de hierro 14,15. Ya sea que se completa la transferrina humana o expresarlo de un transgén que se traduce en un aumento de la carga bacteriana en el torrente sanguíneo durante un periodo de tiempo prolongado, pero este modelo no muestra adhesión bacteriana o desarrollo erupción 16,17. En este protocolo, se describe un modelo de ratón humanizado en el que la piel humana, incluyendo la microvasculatura dérmica, es trasplantado en ratones inmunocomprometidos 18,19. Esto resulta en vasos humanos funcionales, perfundidos con la circulación del ratón. En combinación con la administración de suplementos de transferrina humana, este mOdel representa al menos dos de los aspectos específicos humanos de N. meningitidis, es decir, endotelio humana y transferrina humana, en un ambiente in vivo. N. meningitidis introdujo por vía intravenosa en este modelo se adhieren específicamente a la endotelio humano, la producción de una patología que es similar a lo que se informa en los pacientes clínicos, incluyendo el daño vascular y el desarrollo erupción purpúrico 18.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Gibco Invitrogen</td><td>31885-023</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato</td><td>Gibco Invitrogen</td><td>10010-056</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina 500</td><td>Virbac Francia</td><td></td><td>nº de lote VAL4243</td></tr><tr><td>Xilacina</td><td>Bayer Healthcare</td><td>AMM N&deg; FR/8146715 2/1980</td><td>nº de lote KPO809S</td></tr><tr><td>Optigel&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Europhta</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lacrigel&nbsp;</td><td>Medicament Autoris&eacute;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tronothane</td><td>Lisa Pharma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GC base de agar</td><td>Conda</td><td>1106</td><td></td></tr><tr><td>Endotelio humano SFM media</td><td>Gibco Invitrogen</td><td>11111</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>P A</td><td>A A15-101</td><td></td></tr><tr><td>Transferrina humana</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3309</td><td></td></tr><tr><td>UEA lectina - rodamina</td><td>Vector Labs</td><td>RL-1062</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxilina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9627</td><td></td></tr><tr><td>Eosina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4009</td><td></td></tr><tr><td>Xileno</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>534056</td><td></td></tr><tr><td>Dermatoma de Mano Sobrio</td><td>Humeca BV, Holanda</td><td>4.SB01</td><td></td></tr><tr><td>Alojamiento para animales</td><td>Innovador</td><td>M-BTM-C8</td><td></td></tr><tr><td>Punzón de biopsia (4 mm)</td><td>Dominic Dutscher</td><td>30737</td><td></td></tr><tr><td>Matriz de lisación de preparación rápida M tubos</td><td>MP Bio</td><td>116923050</td><td></td></tr><tr><td>MagNA Lyzer Perlas verdes</td><td>Roche</td><td>3358941001</td><td></td></tr><tr><td>MagNA Lyzer</td><td>Roche</td><td>3358976001</td><td></td></tr><tr><td>Medios de montaje VECTASHIELD</td><td>Vector Labs</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Vetbond</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td>Tissue Glue</td></tr><tr><td>OCT tissue tek</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td></td></tr></tbody></table>

humanizado modelo de ratón para el estudio de infecciones bacterianas targeting la microvasculatura

Humanized Mouse Model to Study Bacterial Infections Targeting the Microvasculature

De Neisseria meningitidis provoca una sepsis grave, con frecuencia mortal cuando entra en el torrente sanguíneo humano. La infección produce una extensa daño de los vasos sanguíneos resulta en fuga vascular, el desarrollo de erupciones purpúricas y necrosis tisular eventual. El estudio de la patogénesis de esta infección se limitó previamente por la especificidad humana de las bacterias, lo que hace difícil en modelos in vivo. En este protocolo, se describe un modelo humanizado para esta infección en la que la piel humana, que contiene vasos sanguíneos dérmicos, se injerta en ratones inmunocomprometidos. Estos vasos se anastomosan con la circulación del ratón, manteniendo sus características humanas. Una vez introducido en este modelo, N. meningitidis se adhieren exclusivamente a los vasos humanos, lo que resulta en el daño vascular extensa, la inflamación y en algunos casos el desarrollo de la erupción purpúrico. Este protocolo describe los pasos del injerto, infección y evaluación de este modelo en el conteXT de N. infección meningitidis. La técnica se puede aplicar a numerosos patógenos humanos específicos que infectan el torrente sanguíneo.

UFC cuenta El N. cepa meningitidis utilizado en estos resultados representativos es N. meningitidis 8013 clon 12, un serogrupo C aislado clínico, expresando una clase I SB pilina, Opa - OPC -, PilC1 + / PilC2 + 20. La cepa había sido diseñado para expresar la proteína fluorescente verde (GFP) a partir de una inserción cromosómica 18. Formadoras de colonias bacterianas recuentos de unidades se establecen contando el número de colonias en las placas de agar y el cálculo de cualquiera de UFC / ml de sangre o de CFU / mg de tejido a partir de los volúmenes conocidos chapados. Los recuentos sanguíneos mostraron que 5 minutos después de la inyección iv de 10 6 bacterias CFU había un promedio de 1,5 x 10 5 UFC / ml que circula en la sangre (Figura 1A). Después de 6 horas, el recuento promedio de 4,8 x 10 4 UFC / ml. Por 24 horas los recuentos promedio fueron 2.4 x 10 4 UFC / ml, pero en este grupo de 10 ratones, 5 teníanno detectable bacterias circulantes, mientras que los otros 5 tenían relativamente altas cuentas (Figura 1A). Los recuentos de CFU tomadas de las muestras de piel muestran la mayoría de los ratones que tienen recuentos considerables en la piel humana, con un promedio de 2,1 x 10 4 CFU / mg de tejido a las 6 horas y 4,4 x 10 2 UFC / mg de tejido en 24 horas (Figura 1B) . Las muestras de piel de ratones contralateral no mostraron recuentos bacterianos a las 24 horas, y sólo un número muy bajo a las 6 horas, lo que demuestra la fuerte preferencia por N. meningitidis a los vasos humanos en la piel injertada (Figura 1B). En general los recuentos bacterianos fueron muy bajos para no detectable en los otros órganos incluidos en la muestra, aunque 2 animales que sí mostró recuentos de lo que puede atribuirse a la contaminación de la sangre, ya que correlacionan con alta circulando el número de bacterias (Figura 1C). El modelo también se puede utilizar para determinar el papel de los factores de virulencia in vivo, por ejemplo, la PI de tipo IVli. Cepas bacterianas con mutaciones definidas en el gen PILD 21, lo que resulta en una cepa carente de Tfp, así como el gen pilC1 8, que carece de la propuesta Tfp &#39;adhesina&#39; se introdujeron en el modelo. Estas mutaciones producen ninguna adhesión bacteriana en el injerto de piel humana, lo que confirma el papel crucial Tfp está jugando en la adhesión in vivo (Figura 1D). La inmunohistoquímica / Histología En estos experimentos se utilizó N. meningitidis cepas que expresan la proteína de fluorescencia verde (GFP) para permitir la detección fluorescente sin la necesidad para la tinción secundaria. Vasos Humanos se tiñeron utilizando un marcador de endotelio humano, ya sea CD31 (PECAM-1) o la lectina Ulex europaeus aglutinina (UEA) 18,22. El UEA fue conjugado con rodamina permitiendo la tinción de un solo paso (figuras 2A-C). Los núcleos celulares se pueden tiñened con DAPI para ayudar a identificar las estructuras de tejido (Figuras 2A-B). Histología se realizó utilizando una tinción de hematoxilina / eosina estándar. El borde de la epidermis / dermis de la piel era claramente identificable. La inflamación, la trombosis vascular y fugas se concentraron a las embarcaciones cerca de esta frontera de 24 horas después de la infección (Figura 2D). Trombosis fue visible en varios vasos dérmicos pequeños, a menudo acompañada por la congestión y la inflamación. La fuga de las células rojas de la sangre hacia los tejidos podría ser visto, lo que indica un amplio nivel de daño de los vasos. La histopatología de la piel injertada en ratones no infectados parecía normal, sin inflamación distinguibles 18. En aproximadamente 30% de las infecciones de la adhesión bacteriana en la piel conduce al desarrollo de la púrpura macroscópicamente detectable (Figuras 2E y 2F). <img alt="Figura 1" fo:content-width=<html> &quot;5in&quot; fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/51134/51134fig1highres.jpg&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/51134/51134fig1.jpg&quot; /&gt; Figura 1. UFC cuenta. (A) Bacterial UFC recuentos por ml de sangre a los 5 minutos, 6 horas y 24 horas después de la infección. (B) Bacterial CFU cuenta a partir de muestras de piel que comparan la piel humana (SA) y la piel del ratón (MS), tanto en 6 horas y 24 horas después de la infección. (C) Bacterial CFU cuenta de otros órganos tomadas 24 horas después de la infección. (D) La comparación de los recuentos de UFC de bacterias a partir de muestras de piel humana y de ratón tomadas a la infección 24 h después de los ratones infectados con el tipo salvaje de N. mancha meningitidis 2C43 (WT), una cepa con una mutación en el gen PILD (PILD) o una cepa con una mutación en el gen pilC1 (pilC1). Todos los gráficos se muestran como datos sin procesar con la mediana. La figura es una modificación de Melican et al. 18&quot;_blank&quot;&gt; Haga clic aquí para ver la imagen más grande. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51134/51134fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51134/51134fig2.jpg" /> Figura 2. Microscopía. (A) Proyección de una pila confocal que muestra una microvasos humano teñido con lectina UEA (rojo) cerca de la dermis (d) de la epidermis (e) frontera. El recipiente está infectado con N. meningitidis (verde) 2 h después de la infección. (B) Una división óptica y una proyección rebanada (C) que muestra N. infección microcolonias meningitidis (verde) de una nave humana (UEA - rojo) dentro de una infección de la piel del injerto 2 h después. (D) Hematoxilina / Eosina tinción de injerto de piel humana infectada durante 24 horas con N. meningitidis. El epidérmico (e), dérmica (d) la frontera es claramente la trombosis y la congestión de microvess visible y extensaels (flechas) se ve en la dermis. La inflamación y algo de fuga vascular (punta de flecha) también pueden ser identificados. (E) injerto de piel humana antes de la infección. (F) El mismo injerto de piel después de la infección hr (E) 24 con N. meningitidis mostrando regiones purpúricas (flechas). Figuras 2B, 2D, 2E, 2F y sean modificados de Melican et al. 18 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51134/51134fig2highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande</a> .

Neisseria meningitidis es un patógeno específico humana que infecta a los vasos sanguíneos. En este protocolo microvasos humanos se introducen en un ratón mediante el injerto de piel humana en ratones inmunodeprimidos. Las bacterias se adhieren ampliamente a los vasos humanos, dando lugar a daño vascular y el desarrollo de la erupción purpúrica típicamente observado en casos humanos.

Humanizado modelo de ratón para el Estudio de Infecciones Bacterianas Targeting la microvasculatura

Neisseria meningitidis causes a severe, frequently fatal sepsis when it enters the human blood stream. Infection leads to extensive damage of the blood ...

El objetivo general de este procedimiento es estudiar los mecanismos mediante los cuales la bacteria que causa meningitis infecta los vasos sanguíneos humanos in vivo. Esto se logra primero injertando piel humana en un ratón inmunodeficiente, introduciendo así vasos sanguíneos dérmicos humanos. En el segundo paso, los ratones humanizados se infectan con la bacteria.A continuación, se permite que la infección transcurra durante un período de tiempo predeterminado. En la etapa final, se obtienen muestras de sangre y tejido para evaluar el resultado de la infección. En última instancia, se utiliza una combinación de histología, inmunofluorescencia y análisis de sangre y tejido para estudiar la progresión de la infección en los vasos humanos.La principal ventaja de esta técnica frente a técnicas existentes como los modelos de cultivo celular o los modelos animales es que, por primera vez, podemos observar la patología clínica típica que ocurre durante estas infecciones. Lo antes posible tras la recolección, limpie la superficie de la piel humana con etanol al 70 %, y luego colóquela plana sobre una superficie limpia, preferiblemente bajo una campana de flujo laminar. A continuación, utilice un dermatomo con un grosor preestablecido para cortar rebanadas de 200 a 400 micrómetros desde la parte superior de la piel.Verifique la integridad de los cortes y luego recórtelos adicionalmente en cuadrados de dos por dos centímetros. Coloque los cuadrados en PBS y a continuación limpie el área afeitada de un ratón beige inmunodeficiente severo combinado, anestesiado y preparado quirúrgicamente, de seis a ocho semanas de edad, con etanol al 70 %. Después de aplicar anestesia local en el sitio del injerto, use tijeras curvas para retirar cuidadosamente la capa superficial de la piel del ratón en un área ligeramente más pequeña que los fragmentos del injerto, teniendo cuidado de no alterar la vascularización subyacente.Mueva rápidamente para evitar que el injerto se seque, coloque una de las rebanadas de piel humana sobre el lecho del injerto, asegurándose de que el lado epidérmico quede hacia arriba. Alinee el borde del tejido y fíjelo con pegamento para tejidos. Luego, ajuste cuidadosamente el resto de la piel humana al lecho del injerto, colocando pequeñas cantidades de pegamento para tejidos alrededor de cada borde.Siempre recorte la piel humana al tamaño adecuado en lugar de agrandar el lecho del injerto. Después de confirmar que cada esquina está fijada, limpie el área con una solución de yodo y aplique una tirita firmemente pero sin apretar, colocando el lado acolchado sobre el injerto, teniendo cuidado de que no se vea afectada la respiración del animal; luego fije la tirita con cinta adhesiva para apósitos y permita que el animal se recupere sobre una superficie tibia. Una vez despierto, devuelva al animal a su jaula hasta la inyección bacteriana para re-inocular una placa de cultivo de la noche anterior en un cultivo líquido.La mañana de la infección, cuando las bacterias alcancen la concentración deseada, diluya las células a una concentración de un por diez a la séptima unidades formadoras de colonias por mililitro. Luego, tras la anestesia, confirme la sedación de los ratones injertados mediante el pellizco del dedo del pie y coloque los animales sobre una almohadilla térmica.Coloque pomada ocular en los ojos del animal y luego administre ip. Inyecte a cada ratón ocho miligramos de transferencia humana en solución salina. A continuación, para cada animal, corte la punta de la cola y extienda una pequeña gota de sangre de la cola sobre una placa de agar para confirmar que la sangre es estéril antes de la infección.Luego, inyecte 100 microlitros de la cultura bacteriana por vía intravenosa mediante inyección retroorbital. Después de unos minutos, corte nuevamente el extremo de la cola y extienda esta muestra de sangre sobre placas de agar frescas también. Para determinar las unidades formadoras de colonias en sangre inmediatamente después de la infección, selle la cola con adhesivo tisular y luego diluya el inóculo bacteriano y extiéndalo sobre placas de agar con los antibióticos adecuados.Para establecer las unidades formadoras de colonias del inóculo a las seis horas posteriores a la infección, extraiga otra pequeña cantidad de sangre de las colas de cada ratón, y luego diluya y siembre las gotas de sangre tal como se acaba de demostrar para determinar las unidades formadoras de colonias a las seis horas. A continuación, incube todas las placas a 37 grados Celsius en un ambiente con 5% de dióxido de carbono durante la noche para realizar la formación de colonias en órganos. Recuentos de unidades de los animales infectados.Comience realizando una incisión media en cada ratón sacrificado. Luego, para cada animal, corte a través de la costilla e haga una incisión en el corazón. Utilice una jeringa estéril para extraer la mayor cantidad posible de sangre del corazón y de la cavidad torácica, y dispense la sangre en tubos estériles individuales para cada muestra.A continuación, retire los órganos de interés y transfiera los injertos de piel y las secciones correspondientes de piel de ratón a una placa estéril por animal. Deje que la sangre recolectada coagule durante 15 minutos y luego centrifúguela. A continuación, retire el plasma de la sangre y almacénelo a menos 80 grados Celsius para su análisis posterior.A continuación, pese los tubos de homogenización que contienen 500 microlitros de PBS cada uno. Luego, utilice un punch estéril para biopsias y tome muestras de biopsia de cuatro milímetros de cada tejido diseccionado. Coloque las biopsias individualmente en los tubos de homogenización, con una perla de dos milímetros en cada tubo que contenga una muestra de piel.Almacene los tejidos restantes en paraformaldehído al 4 % a cuatro grados Celsius para microscopía, y pese los tubos de homogenización para determinar el peso de la biopsia. Luego, homogenice las muestras a 6.000 RPM durante 30 segundos, repitiendo la homogenización de la piel hasta que el homogenato tenga consistencia de heces. Finalmente, extienda las suspensiones celulares de cada tubo sobre placas de agar frescas y cultive las colonias durante toda la noche a 37 grados Celsius en un 5 % de dióxido de carbono.Para establecer los conteos de unidades formadoras de colonias en órganos en estos resultados representativos, se utilizó una cepa positiva para GFP de N. meningitidis del serogrupo C.Los recuentos sanguíneos mostraron que cinco minutos después de la inyección intravenosa de uno por diez a la seis unidades formadoras de colonias de bacterias, había un promedio de 1,5 por diez a la quinta unidades formadoras de colonias por mililitro circulando en la sangre. Después de seis horas, los recuentos promediaron 4,8 por diez a la cuarta unidades formadoras de colonias por mililitro a las 24 horas. Los recuentos promedio fueron de 2,4 por diez a la cuarta unidades formadoras de colonias por mililitro.Pero en este grupo de 10 ratones, cinco no tenían bacterias circulantes detectables, mientras que los otros cinco presentaban recuentos relativamente altos. Estas barras en estos gráficos muestran los valores medianos de las UFC por grupo obtenidas de la piel. Las muestras muestran que la mayoría de los ratones tienen recuentos considerables en la piel humana, con un promedio de 2,1 veces 10 a la cuarta UFC por miligramo de tejido a las seis horas, y 4,4 veces 10 a la segunda UFC por miligramo de tejido a las 24 horas.Las muestras de piel de ratón contralaterales no mostraron recuentos bacterianos a las 24 horas y solo un número muy bajo a las seis horas, lo que demuestra la fuerte preferencia de la meningitis endógena por los vasos humanos en el tejido injertado. En general, los recuentos bacterianos fueron muy bajos o no detectables en los otros órganos muestreados, aunque dos animales mostraron recuentos que podrían estar correlacionados con altos números bacterianos circulantes. Este modelo también puede utilizarse para determinar el papel de los factores de virulencia in vivo.Por ejemplo, en este experimento, se utilizaron cepas bacterianas que carecían de pili funcional tipo cuatro I; los ratones infectados con estas cepas mutantes no exhibieron adhesión bacteriana en los injertos de piel humana, lo que confirma el papel crucial que desempeña el pili tipo cuatro I en la adhesión in vivo. En estas imágenes confocales de un injerto de piel, dos horas después de la infección, pueden observarse los vasos humanos teñidos con la lectina UEA conjugada con romina. El límite dérmico epidérmico de la piel es claramente identificable, y las bacterias infectantes positivas para GFP y la meningitis pueden observarse claramente a lo largo de los vasos.Este injerto de piel humana teñido con hematoxilina y eosina demuestra inflamación y fugas vasculares, así como trombosis concentrada en los vasos cercanos al límite dérmico epidérmico. Veinticuatro horas después de la infección, en aproximadamente el 30 % de las infecciones, las adherencias bacterianas en la piel condujeron al desarrollo de púrpura detectable macroscópicamente. Por lo tanto, el desarrollo de esta técnica allana el camino para que los investigadores involucrados en el estudio de las interacciones huésped-patógeno analicen los mecanismos de la enfermedad en el contexto de vasos humanos.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Aquí se describe una metodología para ofrecer la médula humana derivados de la sangre endoteliales que forman colonias de células (ECFCs) y médula ósea procedentes de células madre mesenquimales (MSC), integrado en un gel de colágeno / fibronectina, por vía subcutánea en ratones inmunodeficientes. Esta combinación de células / gel genera una red humana vascular que conecta con la vasculatura del ratón.

Bioingeniería Humanos redes microvasculares en ratones inmunodeficientes

Fuente: Valentine, M. E., et al., Generación de mutantes de deleción génica en cuadro en Pseudomonas aeruginosa y pruebas de atenuación de virulencia en un modelo simple de infección en ratón. J. Vis. Exp. (2020)Este vídeo demuestra el uso de un enfoque de imagen basado en bioluminiscencia para monitorizar la infección bacteriana en un modelo de ratón vivo. La imagen secuencial bioluminiscente y de rayos X permite la visualización en tiempo real y la localización anatómica de la infección...

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Source: Claes, J., et al, In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates an in vivo method for analyzing shear-dependent bacterial adhesion in a live mouse model. Following surgical preparation and catheterization, the mesenteric vasculature is exposed for real-time imaging under a fluorescence microscope. Perfusion with an ionophore and fluorescently labeled bacteria reveals how shear stress triggers...

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Aquí se presenta una técnica experimental de microscopía intravital de fluorescencia para visualizar heterotípicas plaquetas neutrófilos interacciones en el endotelio activado durante la inflamación vascular y la formación de trombos en ratones vivos. Esta tecnología microscópica será valiosa para estudiar el mecanismo molecular de la enfermedad vascular y para poner a prueba los agentes farmacológicos bajo condiciones fisiopatológicas.

Imágenes en tiempo real de heterotypic plaquetas neutrófilos Interacciones en el endotelio activado durante la inflamación vascular y la formación de trombos en ratones vivos

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