Humanizado modelo de ratón para el Estudio de Infecciones Bacterianas Targeting la microvasculatura

El objetivo general de este procedimiento es estudiar los mecanismos por los cuales la bacteria de la meningitis infecta los vasos sanguíneos humanos in vivo. Esto se logra injertando primero piel humana en un ratón inmunodeficiente, introduciendo así vasos sanguíneos dérmicos humanos. En el segundo paso, los ratones humanizados se infectan con la bacteria.

A continuación, se permite que la infección continúe durante un período de tiempo predeterminado. En el paso final, se obtienen muestras de sangre y tejido para evaluar el resultado de la infección. En última instancia, se utiliza una combinación de histología, inmunofluorescencia y análisis de sangre y tejidos para estudiar la progresión de la infección en los vasos humanos.

La principal ventaja de esta técnica frente a las técnicas existentes como los modelos de cultivo celular o los modelos animales, es que por primera vez, podemos observar la patología clínica típica que tiene lugar durante estas infecciones. Tan pronto como sea posible después de la recolección, limpie la superficie de la piel humana con etanol al 70% y luego colóquela sobre una superficie bien limpia, preferiblemente debajo de una campana de flujo. A continuación, utilice un dermatoma con un grosor preestablecido para cortar rodajas de 200 a 400 micrómetros de la parte superior de la piel.

Verifique que las rodajas estén íntegras y luego recórtelas aún más en cuadrados de dos por dos centímetros. Coloque los cuadrados en PBS y luego limpie el área afeitada de un ratón beige inmunodeficiente severo preparado quirúrgicamente con anestesia severa de seis a ocho semanas de edad con etanol al 70%. Después de aplicar anestésico local en el sitio del injerto, use tijeras curvas para quitar cuidadosamente la capa superficial de piel de ratón en un área un poco más pequeña que las piezas del injerto, teniendo cuidado de no alterar la vasculatura subyacente.

Moviéndose rápidamente para evitar que el injerto se seque, coloque una de las rodajas de piel humana sobre el lecho del injerto, asegurándose de que el lado epidérmico esté hacia arriba. Alinea el borde del pañuelo y fíjalo con pegamento para tejidos. A continuación, ajuste con cuidado el resto de la piel humana al lecho del injerto, colocando pequeñas cantidades de pegamento tisular alrededor de cada borde.

Siempre recorte la piel humana a la medida en lugar de agrandar el lecho de injerto. Después de confirmar que cada esquina está fija, limpie el área con una solución de yodo y aplique una tirita firmemente pero no apretada con el lado del cojín sobre el injerto, teniendo cuidado de que la respiración del animal no se vea afectada, luego fije la curita con cinta adhesiva y deje que el animal se recupere sobre una superficie caliente. Una vez que esté despierto, regrese al animal a su jaula hasta que la inyección bacteriana vuelva a inocular un cultivo en placa durante la noche en cultivo líquido.

La mañana de la infección, cuando las bacterias alcanzan la concentración deseada, diluir las células a una vez 10 por la séptima colonia formando unidades por mililitro. Luego, después de la anestesia, confirmar la sedación de los ratones injertados por el dedo del pie. Pellizque y coloque los animales en una almohadilla térmica.

Coloque ungüento para los ojos del animal y luego ip. Inyecte a cada ratón ocho miligramos de transferencia humana en solución salina. Luego, para cada animal, corte la punta de la cola y esparza una pequeña gota de sangre de la cola en una placa de agar para confirmar que la sangre es estéril antes de la infección.

A continuación, inyecte 100 microlitros del cultivo bacteriano por vía intravenosa mediante inyección retroorbital. Después de unos minutos, vuelva a cortar el extremo de la cola y extienda esta muestra de sangre en placas de agar frescas también. Para establecer las unidades formadoras de colonias sanguíneas inmediatamente después de la infección, selle la cola con pegamento para tejidos y luego diluya el inóculo bacteriano y extiéndalo en placas de agar con los antibióticos adecuados.

Para establecer las unidades formadoras de colonias de inóculo a las seis horas después de la infección, se extrajo otra pequeña cantidad de sangre de cada una de las colas de ratón, y luego se diluyó y se colocaron las gotas de sangre como se acaba de demostrar para establecer las unidades formadoras de colonias a las seis horas. Luego incube todas las placas a 37 grados Celsius en dióxido de carbono al 5% durante la noche para realizar la formación de colonias de órganos. Recuentos unitarios de los animales infectados.

Comience haciendo una incisión en la línea media en cada ratón sacrificado. Luego, para cada animal, corte la costilla y haga una incisión en el corazón. Use una jeringa estéril para extraer la mayor cantidad de sangre posible del corazón y la cavidad torácica, y dispense en tubos estériles individuales para cada muestra.

A continuación, extraiga los órganos de interés y, a continuación, transfiera los injertos de piel y las secciones de piel de ratón que los acompañan a una placa estéril por animal. Deje que la sangre recolectada se coagule durante 15 minutos y luego gírela hacia abajo. A continuación, extraiga el plasma de la sangre y guárdelo a menos 80 grados centígrados para su posterior análisis.

A continuación, pesa tubos homogeneizadores que contengan 500 microlitros de PBS cada uno. Y luego use un punzón de biopsia estéril para tomar muestras de biopsia de cuatro milímetros de cada tejido disecado. Coloque las biopsias individualmente en los tubos homogeneizadores con una perla de dos milímetros en cada tubo que contenga una muestra de piel.

Almacene los tejidos restantes en formaldehído al 4% a cuatro grados centígrados para microscopía y pese los tubos homogeneizadores para establecer el peso de la biopsia. A continuación, homogeneizar las muestras a 6.000 RPM durante 30 segundos, repitiendo la homogeneización de la piel hasta que el homogeneizado sea excremento. Finalmente, extienda los lodos celulares de cada tubo en placas de agar frescas y cultive los cultivos durante la noche a 37 grados Celsius en 5% de dióxido de carbono.

Establecer los recuentos de unidades formadoras de colonias de órganos en estos resultados representativos. Una cepa GFP positiva de meningitis por N. Se utilizó el serogrupo C.

Los recuentos sanguíneos mostraron que cinco minutos después de la inyección intravenosa de una por 10 a las seis unidades formadoras de colonias de bacterias, había un promedio de 1,5 veces 10 a la quinta unidad formadora de colonias por mililitro circulando en la sangre. Después de seis horas, los recuentos promedian 4.8 veces 10 hasta la cuarta colonia formando unidades por mililitro a las 24 horas. Los conteos promedio fueron de 2.4 veces 10 a la cuarta colonia formando unidades por mililitro.

Pero en este grupo de 10 ratones, cinco no tenían bacterias circulantes detectables, mientras que los otros cinco tenían recuentos relativamente altos. Estas barras en estos gráficos muestran los valores medianos para cada grupo de recuentos de UFC tomados de la piel. Las muestras muestran que la mayoría de los ratones tienen recuentos considerables en la piel humana, con un promedio de 2,1 veces 10 a la cuarta UFC por miligramo de tejido a las seis horas, y 4,4 veces 10 a la segunda UFC por miligramo de tejido a las 24 horas.

Las muestras de piel de ratón contralateral no mostraron recuentos bacterianos a las 24 horas y solo un número muy bajo a las seis horas, lo que demuestra la fuerte preferencia por la meningitis final a los vasos humanos en el tejido injertado. En general, los recuentos bacterianos fueron muy bajos o no detectables en los otros órganos muestreados, aunque dos animales mostraron recuentos, lo que puede estar correlacionado con un alto número de bacterias circulantes. Este modelo también se puede utilizar para determinar el papel de los factores de virulencia in vivo.

Por ejemplo, en este experimento, se utilizaron cepas bacterianas que carecían de la píldora I de tipo cuatro funcional, ratones infectados con estas cepas mutantes que no mostraron adhesión bacteriana en los injertos de piel humana, lo que confirma el papel crucial que desempeña la píldora I de tipo cuatro en la adhesión in vivo. En estas imágenes confocales de un injerto de piel, dos horas después de la infección, se pueden observar vasos humanos teñidos con lectina UEA romina conjugada. El borde epidérmico de la piel es claramente identificable y la GFP infecciosa positiva y la meningitis se pueden observar claramente en todos los vasos.

Este injerto de piel humana teñido con h y e muestra inflamación y fugas vasculares, así como la trombosis concentrada en los vasos cercanos al borde dérmico epidérmico. 24 horas después de la infección, en aproximadamente el 30% de las infecciones, las adherencias bacterianas en la piel condujeron al desarrollo de púrpura detectable macroscópicamente. Por lo tanto, el desarrollo de esta técnica allana el camino para que los investigadores involucrados en la investigación y las interacciones entre el huésped y el patógeno estudien los mecanismos de la enfermedad en el contexto de los vasos humanos.