Name: Modelado de ligandos en mapas derivados de la criomicroscopía electrónica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Aprende a modelar ligandos de pequeñas moléculas en mapas de criomicroscopía electrónica de macromoléculas usando técnicas computacionales. Este método mejora el descubrimiento de fármacos mediante el análisis estructural de proteínas de membrana.

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SJ es beneficiario de la beca de doctorado de DAE-TIFR, y se reconoce la financiación. KRV agradece la subvención DBT B-Life DBT/PR12422/MED/31/287/2014 y el apoyo del Departamento de Energía Atómica del Gobierno de la India, bajo la Identificación de Proyecto No. RTI4006.

Modelado de ligandos de moléculas pequeñas en mapas crioEM de macromoléculas

Los autores no tienen nada que revelar.

Las mejoras en el hardware y el software de los microscopios han dado lugar a un aumento en el número de estructuras crioEM en los últimos años. Aunque la resolución más alta alcanzada hasta el momento en crioEM de una sola partícula es de 1,2 Å57,58,59, la mayoría de las estructuras se están determinando alrededor de una resolución de 3-4 Å. El modelado de ligandos en mapas de resolución media a baja puede ser complicado y, a menudo, estar plagado de ambigüedades. Dado el uso generalizado de la crioEM tanto en el mundo académico como en la industria farmacéutica para la investigación traslacional y el descubrimiento de fármacos, es esencial garantizar que los ligandos se modelen correctamente y sin ambigüedades. Por lo tanto, es prudente cuantificar la resolubilidad de los átomos de ligando mediante el cálculo de Q-scores60, que ahora está disponible en EMDB como métrica para evaluar la calidad de los mapas y el ajuste del modelo, así como en Chimera.
En el primer ejemplo, se utilizó ChimeraX para calcular el mapa de diferencias en el espacio real entre el apo y los mapas unidos al ligando en la enzima enolasa M. tuberculosis. La densidad adicional en un umbral alto sugiere la presencia del ligando, fosfoenolpiruvato, en el sitio activo y, Mg2+ unido al ligando. Es importante tener en cuenta que, en este caso, el mapa es de resolución media (3,2 Å) y las moléculas de agua no se pueden modelar con seguridad (Figura 1). La limitación asociada con este método es que solo se puede aplicar cuando la unión del ligando no induce cambios conformacionales significativos en la proteína. En este caso, no se realizó la normalización del mapa, ya que tanto el conjunto de datos apo como el ligado se adquirieron con el mismo tamaño de píxel y se procesaron con parámetros idénticos en Relion. Sin embargo, vale la pena señalar que cuando se comparan mapas generados por diferentes programas de reconstrucción, como Relion46,47 y CryoSparc61, o con diferente calidad, la normalización de los mapas se vuelve esencial antes de que se puedan realizar comparaciones significativas.
El siguiente ejemplo es mGlu5, que experimenta una gran reorganización molecular tras la unión de agonistas, como se evidencia en las estructuras crioEM51,62 (Figura 2). En este escenario, no es factible calcular un mapa de diferencias simple entre los receptores no unidos (apo) y unidos al ligando debido a las diferencias sustanciales entre los mapas. En este caso, se utilizó Servalcat, que utiliza semimapas sin nitidez y sin ponderar como entrada para el refinamiento en el espacio recíproco y, posteriormente, calcula un mapa de diferencias entre el mapa experimental y el mapa derivado del modelo. En un umbral alto, se pueden visualizar las diferencias y actuar como guía para la corrección y mejora del modelo. Se observaron varias manchas no modeladas en el dominio extracelular y cerca del transmembrana de mGlu5 y se utilizaron como guía para modelar ligandos (Figura 2).
El tercer ejemplo muestra cómo la resolución (2,3 Å) desempeña un papel crucial en la interpretación de mapas y el modelado de un inhibidor del tamaño de un fragmento en la β-galactosidasa. En este caso, el reto consistía en identificar un ligando muy pequeño (<200 Da) en el mapa de diferencias de Servalcat en medio del ruido inherente a los datos y modelarlo con precisión. Además de la alta resolución global determinada mediante la correlación de la capa de Fourier (FSC), la resolución local específica del ligando también fue lo suficientemente alta como para garantizar la colocación precisa de los centros quirales de los ligandos (Figura 3). La densidad de las moléculas de disolvente se observó en el mapa de diferencias a lo largo de la enzima y especialmente alrededor del ligando. También se demostró el efecto de la resolución en el modelado de ligandos y átomos de solvente (Figura 4). Es importante tener cuidado al modelar moléculas de agua o solvente porque, en ocasiones, el ruido en un umbral bajo puede parecerse a las moléculas de agua o solvente, lo que puede llevar a posibles interpretaciones erróneas.
Otra consideración importante es que los mapas crioEM por sí solos pueden no ser suficientes para identificar con precisión un ion metálico por sí solos. A menudo se necesitan métodos biofísicos adicionales como la estructura fina de absorción de rayos X extendida (EXAFS) o la espectroscopia de rayos X de dispersión de energía (EDX) para confirmar la presencia e identidad del ion metálico. Tanto en las enzimas enolasa como en las β-galactosidasa, se modeló el Mg2+ debido a la gran cantidad de información ya disponible sobre estas proteínas, lo que confirma la identidad del ion metálico. Además, la coordinación de los iones metálicos en estos casos, ejemplificada por la geometría octaédrica clásica y las distancias de coordinación casi ideales de Mg2+, proporcionó una prueba sustancial de su identidad.
En general, se deben tener en cuenta algunas consideraciones importantes al modelar ligandos en mapas crioEM. Para empezar, es importante elegir el mapa correcto para la identificación y el modelado de ligandos. En todos los casos, se recomienda un mapa o medio mapa sin nitidez y sin ponderar sobre un mapa nitidado y ponderado para visualizar la densidad del ligando, ya que el refinamiento y la ponderación podrían dar lugar a regiones poco o más nitidadas (ruido debido a la terminación de la serie) en el mapa. Esto puede resultar en una densidad de ligando subóptima, y el uso de diferentes agudizaciones de factor B se puede emplear para evaluar la densidad durante la construcción del modelo en Coot. Aunque existe un riesgo al usar el mapa afilado para identificar ligandos en un mapa crioEM, es posible que el mapa no afilado no muestre todos los detalles de la densidad del ligando, pero se puede usar con fines de demostración, como se muestra en la Figura 1B, C.
La posición del ligando modelado debe validarse, especialmente en los casos en que los datos son débiles. Como se muestra aquí para mGlu5, la resolución local varía a lo largo del mapa crioEM, y el modelado imparcial del ligando puede ser un desafío. Servalcat puede utilizarse como una herramienta valiosa para detectar posibles imprecisiones en el modelado de proteínas y ligandos22.
La heterogeneidad composicional puede estar presente en un complejo proteína-ligando donde solo una población específica puede tener el ligando presente (si el ligando es de bajo peso molecular, entonces el paso de clasificación podría no eliminar la heterogeneidad). Sin embargo, es importante realizar la clasificación3D en 63 pasos de forma iterativa durante el procesamiento de imágenes antes del modelado del ligando y verificar si la densidad del ligando mejora. Si hay varias copias de la proteína, se debe tener cuidado al aplicar la simetría a través del mapa durante la generación y el refinamiento iniciales del modelo, ya que esto puede promediar la densidad del ligando en todas las moléculas relacionadas con la simetría. La simetría solo debe imponerse después de que el mapa haya sido inspeccionado minuciosamente para confirmar la presencia de densidad de ligandos en todas las cadenas de proteínas.
Dependiendo del estado (cristal o solución) y de la ubicación (enterrada o superficial), los átomos pueden ser dinámicos, y en el refinamiento del modelo, esto se conoce como parámetro de desplazamiento atómico (ADP). Junto con el mapa de diferencias, que proporciona pistas visuales sobre posibles imprecisiones en el modelo, los valores de ADP se pueden utilizar para evaluar la precisión de los ligandos después del refinamiento 64,65,66,67. Por lo general, el ligando debe tener valores de ADP similares a los residuos circundantes, es decir, si están unidos de manera estable y modelados con precisión. Sin embargo, los ligandos en la periferia o los átomos de un ligando (como los lípidos) que están lejos de las macromoléculas pueden tener valores de ADP más altos. Además de refinar las coordenadas, tanto Refmac33,34 como Phenix permiten refinar los valores de ADP28,68. En Refmac, la aproximación de Mott-Bethe se utiliza para calcular el factor de dispersión de electrones de átomos individuales durante el cálculo del mapa. En la versión reciente de Phenix, se ha introducido el refinamiento individual del factor B, similar a la cristalografía, para explicar el desorden del átomo. Muy a menudo, en los modelos refinados derivados de la crioEM, se observa una amplia gama de valores de ADP (a veces valores cercanos a cero), e incluso la puntuación Q que se utiliza en EMDB para evaluar el ajuste del modelo con el mapa depende del mapa primario depositado y de la naturaleza de la nitidez del factor B60. En la construcción de modelos crioEM, a menudo se utilizan múltiples mapas y, por lo tanto, los mapas utilizados en el modelado y el refinamiento deben mencionarse claramente en los métodos, ya que debido a la resolución anisotrópica en muchas macromoléculas, un solo mapa puede no ser suficiente para explicar todos los detalles. 
En el modelado de ligandos en macromoléculas, una de las principales limitaciones de los mapas crioEM (como en la cristalografía) es que si el sitio de unión del ligando es de baja resolución o si el ligando unido es dinámico, entonces determinar la conformación correcta puede resultar difícil. Además, la mayoría de las estructuras crioEM tienen resoluciones inferiores a 3 Å, y la representación de las moléculas de agua en los mapas es limitada, lo que dificulta la evaluación del papel de la hidratación en la unión de ligandos o fármacos (como se muestra aquí con los ejemplos de enolasa y mGluR). Los métodos computacionales pueden utilizarse en combinación con datos crioEM para abordar estas limitaciones69. A diferencia de la cristalografía, solo el modelo se somete a refinamiento, no el mapa. En la actualidad, el único método para indicar la presencia de un ligando o garantizar un modelado preciso es mediante la generación de mapas de omisión (utilizando herramientas como Servalcat). Por lo tanto, hay una serie de herramientas para ayudar a los investigadores a construir y evaluar el modelo, pero hay varias áreas en el refinamiento del modelo donde se pueden esperar nuevos enfoques o modificaciones de los enfoques actuales en un futuro próximo.
En este artículo, nos hemos centrado en los enfoques actuales para modelar ligandos, que incluyen la inspección manual de la densidad del ligando, la generación del archivo de geometría del ligando, seguido del modelado del ligando en el mapa crioEM. Este es un período emocionante en la biología estructural y el descubrimiento de fármacos, ya que los detectores directos de electrones con velocidades de fotogramas más rápidas y el uso de una adquisición de datos más rápida70 han dado como resultado la obtención de mapas de alta resolución (<2,8 Å) de varias macromoléculas a menudo unidas con ligandos de moléculas pequeñas en un tiempo relativamente corto. La reciente introducción de herramientas automatizadas de modelado de ligandos como GEMspot69 en la suite Schrödinger y EMERALD17 en la suite Rosetta, que intenta encontrar la posición de unión más probable del ligando teniendo en cuenta los datos experimentales de crioEM, promete agilizar y automatizar este proceso. De manera similar a la cristalografía de rayos X, se prevé que la identificación de los modos de unión de ligandos de moléculas pequeñas mediante crioEM, tal vez dos o más en un solo día, se convertirá en una posibilidad realista.

Las células cumplen sus funciones llevando a cabo innumerables reacciones químicas de forma simultánea e independiente, cada una de las cuales está meticulosamente regulada para garantizar su supervivencia y adaptabilidad en respuesta a las señales ambientales. Esto se logra mediante el reconocimiento molecular, que permite que las biomoléculas, especialmente las proteínas, formen complejos transitorios o estables con otras macromoléculas, así como con pequeñas moléculas o ligandos1. Por lo tanto, las interacciones proteína-ligando son fundamentales para todos los procesos de la biología, que incluyen la regulación de la expresión y la actividad de las proteínas, el reconocimiento de sustratos y cofactores por parte de las enzimas, así como la forma en que las células perciben y transmiten las señales 1,2. Una mejor comprensión de las propiedades cinéticas, termodinámicas y estructurales del complejo proteína-ligando revela las bases moleculares de la interacción del ligando y también facilita el diseño racional de fármacos al optimizar la interacción y la especificidad del fármaco. Un enfoque económico y más rápido para estudiar la interacción proteína-ligando es utilizar el acoplamiento molecular, que es un método computacional que examina virtualmente una amplia gama de moléculas pequeñas y predice el modo de unión y la afinidad de estos ligandos con las proteínas diana. Sin embargo, la evidencia experimental de estructuras de alta resolución determinadas por difracción de rayos X (XRD), resonancia magnética nuclear (RMN) o criomicroscopía electrónica (crioEM) proporciona la prueba esencial para tales predicciones y ayuda en el desarrollo de activadores o inhibidores más nuevos y efectivos para un objetivo determinado. Este artículo utiliza la abreviatura 'cryoEM', como se conoce comúnmente a la técnica. Sin embargo, existe un debate en curso sobre la elección de la nomenclatura correcta y, recientemente, se ha propuesto el términoicroscopia M del lectrón Ede la muestra criogénica (cryoEM) para indicar que la muestra está a temperatura criogénica y se ha obtenido una imagen con electrones4. Del mismo modo, los mapas derivados de la crioEM se han denominado potencial electrónico, potencial electrostático o potencial de Coulomb, y para simplificar, aquí utilizamos los mapas crioEM 5,6,7,8,9,10.
A pesar de que la DRX ha sido la técnica de referencia en la determinación de la estructura de alta resolución de complejos proteína-ligando, la crioEM post-revolución de la resolución11 ha ganado impulso, como lo indica el aumento de los mapas de potencial de Coulomb o mapas de crioEM depositados en la Base de Datos de Microscopía Electrónica (EMDB)12,13 en los últimos años14. Debido a los avances en los métodos de preparación de muestras, imágenes y procesamiento de datos, el número de deposiciones del Banco de Datos de Proteínas (PDB)14 que emplean crioEM aumentó del 0,7% al 17% entre 2010 y 2020, y aproximadamente el 50% de las estructuras reportadas en 2020 se determinaron con una resolución de 3,5 Å o mejor15,16. CryoEM ha sido rápidamente adoptado por la comunidad de biología estructural, incluida la industria farmacéutica, ya que permite el estudio de macromoléculas biológicas flexibles y no cristalinas, especialmente proteínas de membrana y complejos multiproteicos, a una resolución casi atómica, superando el proceso de cristalización y obteniendo cristales bien difractantes necesarios para la determinación de estructuras de alta resolución por XRD.
El modelado preciso del ligando en el mapa crioEM es primordial, ya que sirve como modelo del complejo proteína-ligando a nivel molecular. Existen varias herramientas automatizadas de construcción de ligandos utilizadas en la cristalografía de rayos X que dependen de la forma y la topología de la densidad del ligando para ajustar o construir el ligando en la densidad de electrones 17,18,19,20. Sin embargo, si la resolución es inferior a 3 Å, estos enfoques tienden a producir resultados menos deseables porque las características topológicas de las que dependen para el reconocimiento y la construcción se vuelven menos definidas. En muchos casos, estos métodos han demostrado ser ineficaces para modelar con precisión ligandos en mapas crioEM, ya que estos mapas se han determinado en el rango de resolución baja a media, normalmente entre 3,5 Å-5 Å17.
El primer paso en la determinación de la estructura 3D de un complejo proteína-ligando mediante crioEM implica la copurificación del ligando con la proteína (cuando el ligando tiene una alta afinidad de unión a la proteína) o la incubación de la solución proteica con el ligando durante un período específico antes de la preparación en red. Posteriormente, se coloca un pequeño volumen de muestra en una rejilla TEM agujereada con plasma limpiada con plasma, seguida de una congelación instantánea en etano líquido y, finalmente, la obtención de imágenes con un crio-TEM. Las imágenes de proyección 2D de cientos de miles a millones de partículas individuales se promedian para reconstruir un mapa de potencial de Coulomb tridimensional (3D) de la macromolécula. La identificación y el modelado de ligandos y moléculas de solvente en estos mapas plantean desafíos significativos en muchos casos debido a la resolución anisotrópica en todo el mapa (es decir, la resolución no es uniforme en toda la macromolécula), la flexibilidad en la región donde se une el ligando y el ruido en los datos. Muchas de las herramientas de modelado, refinamiento y visualización que se desarrollaron para XRD ahora se están adaptando para su uso en crioEM para los mismos propósitos 18,19,20,21. En este artículo, se presenta una descripción general de varios métodos y software utilizados actualmente para identificar ligandos, construir modelos y refinar las coordenadas derivadas de la crioEM. Se ha proporcionado un protocolo paso a paso para ilustrar los procesos involucrados en el modelado de ligandos utilizando complejos proteína-ligando específicos con resolución y complejidad variables.
El primer paso en el modelado de ligandos en mapas crioEM incluye la identificación de la densidad de ligandos (no proteínas) en el mapa. Si la unión del ligando no induce ningún cambio conformacional en la proteína, entonces el cálculo de un mapa de diferencias simple entre el complejo proteína-ligando y la apo-proteína esencialmente resalta las regiones de densidad adicional, lo que sugiere la presencia del ligando. Tales diferencias se pueden observar de inmediato, ya que solo se requieren dos mapas, e incluso se pueden usar mapas intermedios durante el proceso de refinamiento 3D para verificar si el ligando está presente. Además, si la resolución es lo suficientemente alta (<3,0 Å), el mapa de diferencias también puede proporcionar información sobre la ubicación de las moléculas de agua, así como sobre los iones que interactúan con el ligando y los residuos de proteínas.
En ausencia del mapa de apoproteínas, ahora es posible utilizar Servalcat22, que está disponible como herramienta independiente y también se ha integrado en el paquete de software CCP-EM 23,24 como parte del refinamiento de Refmac y en CCP4 8.0 versión25,26. Servalcat permite el cálculo de un mapa de diferencia ponderada FSC (Fo-Fc) utilizando los semimapas sin nitir y el modelo de apoproteínas como entrada. El mapa de omisión Fo-Fc representa la disparidad entre el mapa experimental (Fo) y el mapa derivado del modelo (Fc). En ausencia de un ligando en el modelo, una densidad positiva en un mapa Fo-Fc que se superpone con el mapa EM experimental generalmente sugiere la presencia del ligando. La suposición aquí es que la cadena de proteínas está bien ajustada en el mapa, y la densidad positiva restante indica la ubicación del ligando. Sin embargo, es importante examinar meticulosamente si la densidad positiva se debe a imprecisiones en el modelado, como el rotámero incorrecto de una cadena lateral de proteína.
El segundo paso consiste en obtener o crear un archivo de coordenadas cartesianas del ligando con una geometría bien definida a partir de la información química disponible. Los ligandos estándar (por ejemplo, ATP y NADP+) que ya están disponibles en la biblioteca de monómeros CCP4 se pueden utilizar para el refinamiento mediante la recuperación de los archivos de coordenadas y geometría a través de su código de acceso de monómeros. Sin embargo, para ligandos desconocidos o no estándar, hay varias herramientas disponibles para crear los archivos de geometría. Algunos de los ejemplos incluyen el eLBOW27 - (generador electrónico de ligandos y banco de trabajo de optimización) en Phenix28, Lidia - una herramienta incorporada en Coot29, JLigand/ACEDRG30,31, CCP-EM23,24, Ligprep32-a módulo de Glide dentro de la suite Schrödinger. A continuación, el archivo de coordenadas del ligando se ajusta en la densidad, guiado tanto por el mapa experimental de crioEM como por el mapa de diferencias en Coot. A esto le sigue el refinamiento del espacio real en Phenix28 o el refinamiento recíproco en Refmac33. Se requiere una estación de trabajo Linux o una computadora portátil equipada con una buena tarjeta gráfica y el software mencionado anteriormente. La mayoría de estos programas están incluidos en varias suites. CCP-EM24 y Phenix28 están disponibles gratuitamente para usuarios académicos e incluyen una variedad de herramientas que se utilizan en este artículo, incluidas Coot, Refmac5 33,34,35,36, Servalcat, phenix.real_space_refine, etcetera. Del mismo modo, Chimera37 y ChimeraX38 proporcionan licencias gratuitas a usuarios académicos.

<table><tbody><tr><td>CCP4-8.0</td><td>Consorcio de varios institutos</td><td>https://www.ccp4.ac.uk</td><td>Gratis para usuarios académicos e incluye Coot y lista de herramientas desarrolladas para la cristalografía de rayos X</td></tr><tr><td>Consorcio CCP-EM</td><td>de varios institutos</td><td>https://www.ccpem.ac.uk/download.php</td><td>Gratis para usuarios académicos e incluye Coot, Relion y muchos otros</td></tr><tr><td>Coot&nbsp;</td><td>Paul Emsley, LMB, Cambridge</td><td>https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/</td> <td>Software general para la construcción de modelos, pero también disponible con otras suites descritas anteriormente</td></tr><tr><td>DockinMap (Phenix)</td><td>Consorcio de varios institutos</td><td>https://phenix-online.org/documentation/reference/dock_in_map.html</td><td>Software dentro de la suite Phenix para acoplar modelos en mapas crioEM</td></tr><tr><td>Banco de datos de microscopía electrónica&nbsp;</td><td>Consorcio de varios institutos</td><td>https://www.ebi.ac.uk/emdb/</td> <td>Repositorio público de mapas de microscopía electrónica</td></tr><tr><td>Falcon</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/MSD/Technical-Notes/Falcon-3EC-Datasheet.pdf</td><td>Commercial, cámara de Thermo Fisher&nbsp;</td></tr><tr><td>Fénix&nbsp;</td><td>Consorcio de varios institutos</td><td>https://phenix-online.org/download</td><td>gratuito para usuarios académicos e incluye</td></tr><tr><td>el Banco de Datos de Proteínas</td> Coot <td>Consorcio de varios institutos</td><td>https://rcsb.org</td><td>Base de datos pública de estructuras macromoleculares</td></tr><tr><td>Pymol</td><td>Schrödinger</td><td>https://pymol.org/2/</td> <td>Herramienta de viusalización molecular. La versión educativa es gratuita, pero tiene limitaciones. La versión completa se puede obtener por una pequeña tarifa.</td></tr><tr><td>Relion</td><td>MRC-LMB, Cambridge</td><td>https://relion.readthedocs.io/en/release-4.0/Installation.html</td><td>Software para el procesamiento de imágenes crioEM, también disponible con CCP-EM</td></tr><tr><td>Titan Krios</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>https://www.thermofisher.com/in/en/home/electron-microscopy/products/transmission-electron-microscopes/krios-g4-cryo-tem.html?cid=msd_ls_xbu_xmkt_tem-krios_285811_gl_pso_gaw_tpne1c&amp; gad_source=1& gclid=CjwKCAiA-P-rBhBEEiwAQEXhHyw5c8MKThmdA AkZesWC4FYQSwIQRk ZApkj08MfYG040DtiiuL8 RihoCebEQAvD_BwE</td><td>Comercial, cryoTEM de Thermo Fisher</td></tr><tr><td>UCSF Chimera</td><td>UCSF, EE. UU.</td><td>https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html</td><td>Software de propósito general para visualización, análisis y más</td></tr><tr><td>UCSF Chimera X</td><td>UCSF, EE. UU</td><td></td><td>. https://www.cgl.ucsf.edu/chimerax/Software de propósito general para visualización, análisis y más</td></tr></tbody></table>

modelado de ligandos en mapas derivados de la criomicroscopía electrónica

Modeling Ligands into Maps Derived from Electron Cryomicroscopy

Descifrar las interacciones proteína-ligando en un complejo macromolecular es crucial para comprender el mecanismo molecular, los procesos biológicos subyacentes y el desarrollo de fármacos. En los últimos años, la microscopía electrónica criogénica de muestras (cryoEM) ha surgido como una técnica poderosa para determinar las estructuras de las macromoléculas e investigar el modo de unión del ligando a una resolución casi atómica. La identificación y el modelado de moléculas no proteicas en los mapas de crioEM suele ser un reto debido a la resolución anisotrópica de la molécula de interés y al ruido inherente a los datos. En este artículo, se presenta a los lectores varios programas y métodos que se utilizan actualmente para la identificación de ligandos, la construcción de modelos y el refinamiento de coordenadas atómicas utilizando macromoléculas seleccionadas. Una de las formas más sencillas de identificar la presencia de un ligando, como se ilustra con la enzima enolasa, es restar los dos mapas obtenidos con y sin el ligando. Es probable que la densidad adicional del ligando se destaque en el mapa de diferencias incluso en un umbral más alto. Hay casos, como se muestra en el caso del receptor metabotrópico de glutamato mGlu5, en los que no se pueden generar mapas de diferencias tan simples. El método recientemente introducido para derivar el mapa de omisión Fo-Fc puede servir como herramienta para validar y demostrar la presencia del ligando. Por último, utilizando como ejemplo la bien estudiada β-galactosidasa, se analiza el efecto de la resolución en el modelado de los ligandos y las moléculas de disolvente en los mapas de crioEM, y se presenta una perspectiva sobre cómo se puede utilizar la crioEM en el descubrimiento de fármacos.

Este protocolo presenta las herramientas disponibles para modelar ligandos de moléculas pequeñas en mapas crioEM de macromoléculas.

Modelado de ligandos en mapas derivados de la criomicroscopía electrónica

Deciphering the protein-ligand interactions in a macromolecular complex is crucial for understanding the molecular mechanism, underlying biological ...

Estamos interesados en comprender los procesos fisiológicos que ocurren en toda la célula, particularmente en la interfaz de la membrana. Utilizamos Cryo-EM como técnica principal y trabajamos en varios problemas biológicos interesantes y desafiantes estudiando múltiples complejos macromoleculares. Determinar las estructuras de las proteínas de membrana y otros complejos lábiles era un desafío hace un par de décadas.Sin embargo, los avances técnicos en Cryo-EM, un nuevo detergente y mimético lipídico y con dotaciones, allanaron el camino para la determinación rápida de la estructura de estos complejos. Estas estructuras ahora se pueden obtener a alta resolución y potencialmente usar en el descubrimiento de fármacos. En Cryo-EM de una sola partícula, los desafíos incluyen la adquisición de muestras estables y homogéneas, la inclusión de la muestra en orientación aleatoria en hielo delgado, el procesamiento de una gran cantidad de imágenes con una baja relación señal-ruido y la determinación precisa de la orientación angular y la clasificación durante la reconstrucción 3D.La identificación y el modelado de moléculas pequeñas en mapas crio-EM de complejos de proteínas ligandos es un desafío debido al ruido inherente en los datos y la baja resolución del mapa isotrópico, la heterogeneidad de la muestra y la flexibilidad del ligando. Este protocolo es una guía paso a paso para identificar y modelar ligandos y moléculas de solvente en Cryo-EM de baja a media resolución.

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