Modelado de ligandos en mapas derivados de la criomicroscopía electrónica
19 de julio de 2024
Este protocolo presenta las herramientas disponibles para modelar ligandos de moléculas pequeñas en mapas crioEM de macromoléculas.
Estamos interesados en comprender los procesos fisiológicos que ocurren en toda la célula, particularmente en la interfaz de la membrana. Utilizamos Cryo-EM como técnica principal y trabajamos en varios problemas biológicos interesantes y desafiantes estudiando múltiples complejos macromoleculares. Determinar las estructuras de las proteínas de membrana y otros complejos lábiles era un desafío hace un par de décadas.
Sin embargo, los avances técnicos en Cryo-EM, un nuevo detergente y mimético lipídico y con dotaciones, allanaron el camino para la determinación rápida de la estructura de estos complejos. Estas estructuras ahora se pueden obtener a alta resolución y potencialmente usar en el descubrimiento de fármacos. En Cryo-EM de una sola partícula, los desafíos incluyen la adquisición de muestras estables y homogéneas, la inclusión de la muestra en orientación aleatoria en hielo delgado, el procesamiento de una gran cantidad de imágenes con una baja relación señal-ruido y la determinación precisa de la orientación angular y la clasificación durante la reconstrucción 3D.
La identificación y el modelado de moléculas pequeñas en mapas crio-EM de complejos de proteínas ligandos es un desafío debido al ruido inherente en los datos y la baja resolución del mapa isotrópico, la heterogeneidad de la muestra y la flexibilidad del ligando. Este protocolo es una guía paso a paso para identificar y modelar ligandos y moléculas de solvente en Cryo-EM de baja a media resolución.
Descripción general
Este protocolo presenta las herramientas disponibles para modelar ligandos de moléculas pequeñas en mapas de criomicroscopía electrónica (crioEM) de macromoléculas. El estudio se centra en comprender los procesos fisiológicos en la interfaz de la membrana mediante el uso de crioEM para abordar diversos desafíos biológicos.
Componentes Principales del Estudio
Área de Ciencia
- Microscopía electrónica criogénica (crioEM)
- Complejos macromoleculares
- Descubrimiento de fármacos
Antecedentes
- Comprensión de los procesos fisiológicos en toda la célula.
- Dificultades para determinar las estructuras de las proteínas de membrana.
- Avances en las técnicas de microscopía crioelectrónica (cryoEM).
- Importancia de las estructuras de alta resolución para el descubrimiento de fármacos.
Objetivo del estudio
- Para modelar ligandos de moléculas pequeñas en mapas de criomicroscopía electrónica.
- Para mejorar la comprensión de las estructuras de proteínas de membrana.
- Para facilitar la determinación rápida de estructuras de complejos lábiles.
Métodos Utilizados
- Técnica de criomicroscopía electrónica de partículas individuales.
- Inclusión de muestras en hielo delgado.
- Procesamiento de imágenes con baja relación señal-ruido.
- Reconstrucción tridimensional y clasificación de la orientación angular.
Resultados principales
- Obtención de estructuras de alta resolución de proteínas de membrana.
- Modelado exitoso de ligandos de moléculas pequeñas en mapas de criomicroscopía electrónica (cryoEM).
- Superación de los desafíos relacionados con la estabilidad y homogeneidad de las muestras.
- Avances en el potencial del descubrimiento de fármacos mediante conocimientos estructurales.
Conclusiones
- La microscopía crioelectrónica es una herramienta poderosa para estudiar complejos macromoleculares.
- La modelización de ligandos mejora la comprensión de las interacciones medicamentosas.
- Los avances técnicos continúan mejorando la investigación en biología estructural.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La modelización de alta resolución de interacciones proteína-ligando mediante mapas de criomicroscopía electrónica (crioEM) es cada vez más fundamental para el descubrimiento temprano de fármacos y la reducción de riesgos mecanicistas. La capacidad de identificar y refinar con precisión la unión del ligando en ensamblajes macromoleculares complejos respalda la confianza predictiva en la validación del blanco y orienta las decisiones de selección de carteras. La integración de flujos de trabajo avanzados de crioEM permite a los equipos de biofármacos abordar la ambigüedad estructural y acelerar la identificación de fármacos basada en la estructura.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biofármacos
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la visualización directa de los sitios de unión del ligando y las redes de interacción en complejos macromoleculares.
- Apoya la reducción de riesgos mecanicistas al aclarar la base estructural del acoplamiento con el objetivo.
- Mejora la confianza predictiva para la validación funcional del objetivo y la triage posterior.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Facilita la preparación de modelos estructurales validados para flujos de trabajo de cribado computacional y experimental.
- Permite la identificación reproducible de densidades de ligandos y la evaluación cuantitativa de los modos de unión.
- Apoya la estandarización de ensayos al proporcionar estructuras de referencia para los estados con ligando unido y sin ligando (apo).
Investigación Traductacional y Preclínica
- Relaciona conocimientos estructurales con sistemas relevantes para la enfermedad mediante la modelización de complejos fisiológicamente importantes.
- Proporciona continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica al apoyar la optimización guiada por la estructura.
- Reduce el riesgo de traslación al confirmar la interacción del ligando en ensamblajes biológicos relevantes.
Integración de la Canalización y Flujo de Trabajo
Este flujo de trabajo basado en criomicroscopía electrónica para modelado de ligandos conecta el descubrimiento inicial, la identificación de compuestos prometedores y la investigación preclínica al proporcionar datos estructurales de alta confianza para la verificación de hipótesis y la optimización de compuestos.
- Biología del Descubrimiento: Permite la interrogación basada en hipótesis de la unión de ligandos y la modulación de vías.
- Selección: Proporciona mapas cuantitativos y reproducibles de densidad de ligandos para análisis comparativo.
- Análisis: Ofrece coordenadas atómicas refinadas y mapas de diferencias para apoyar la evaluación estadística de eventos de unión.
- Investigación Traducional: Conecta hallazgos estructurales con dianas relevantes para enfermedades y estrategias de biomarcadores.
- Reutilización Empresarial: Establece un flujo de trabajo escalable y estandarizado para iniciativas continuas de diseño de fármacos basado en estructuras.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en la validación de dianas.
- Valor operativo: Estandariza la modelización y el refinamiento de ligandos en diversos sistemas proteicos.
- Valor estratégico: Orienta las decisiones de continuar/no continuar y mejora la eficiencia del capital al reducir riesgos estructurales en fases avanzadas.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización y el avance ajustados al riesgo de dianas validadas estructuralmente.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el procesamiento de datos de criomicroscopía electrónica, construcción y refinamiento de modelos.
- Exige acceso a infraestructura computacional de alto rendimiento y herramientas de visualización.
- Necesita estandarización entre equipos en umbrales de mapas, criterios de validación y refinamiento de coordenadas.
- Puede requerir adaptación para diferentes clases de proteínas, tipos de ligandos o regímenes de resolución.
- Depende de la calidad de la muestra, la resolución del mapa y las limitaciones inherentes de ruido en los datos de criomicroscopía electrónica.
