Name: Revelando el fenotipo ferroptótico del meduloblastoma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-15T14:50:00.000+00:00
Duration: 4 min 1 s
Description: Descubre cómo inducir ferroptosis en células de meduloblastoma usando erastin y citometría de flujo. Este método permite evaluar la peroxidación lipídica y explorar nuevas estrategias terapéuticas contra cánceres pediátricos.

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Este trabajo contó con el apoyo del gobierno del Principado de Mónaco, así como por 'Le Groupement des Entreprises Monégasques dans la Lutte contre le cancer' (GEMLUC) y la Fundación Flavien, que proporcionó los medios para la compra de BD FACS Melody.

El presente estudio se llevó a cabo utilizando líneas celulares de meduloblastoma de tipo salvaje (WT) DAOY, que se cultivaron a 37 °C con 5% de CO2 en medio DMEM suplementado con 8% de FBS. La línea celular con deleción xCT se mantuvo en las mismas condiciones, con experimentos realizados en medios suplementados con 1 mM de N-acetilcisteína (NAC). Las células se examinaron regularmente para detectar micoplasma utilizando un kit de detección de micoplasma disponible comercialmente (ver Tabla de materiales) y se cultivaron hasta eldécimo paso.
1. Cosecha y siembra de las células
NOTA: Todos los pasos se realizan utilizando técnicas asépticas estériles en una campana de flujo laminar de cultivo de tejidos. Las células de meduloblastoma DAOY son adherentes, lo que significa que todas las células no adheridas se pueden desechar lavándolas con solución salina tamponada con fosfato (PBS) sin Ca2+ y Mg2+.
<ol><li>Tome la placa de caldo (placa de Petri, 100 mm de diámetro) con las celdas y retire las celdas flotantes y el medio de la placa con un aspirador.</li>
	<li>Agregue 5-10 ml de PBS al plato, lave el fondo con movimientos circulares del plato y luego retire el PBS del plato con un aspirador.</li>
	<li>Añadir 1 mL de tripsina (dilución 10x) al plato. Incube la placa hasta que un suave golpeteo de la placa desaloje las células. Tome 10 mL de medio de cultivo DMEM suplementado con 8% de FBS y recoja mecánicamente las células de la placa.</li>
	<li>Transfiera la suspensión celular a un tubo de 15 ml.</li>
	<li>Tome 500 μL de la suspensión celular y colóquela en una cubeta para contar. Cuente el número de células por ml de suspensión celular. Para este estudio se utilizó un contador de células automatizado (ver Tabla de Materiales).</li>
	<li>Calcule el volumen necesario tomar de la suspensión celular para tener 1,00,000 celdas.</li>
	<li>Tome una placa de 6 pocillos y agregue el volumen calculado de la suspensión celular en cada pocillo, luego agregue medios de cultivo DMEM suplementados con 8% de FBS a 2 mL en cada pocillo.</li>
</ol>2. Tratamiento de las células
NOTA: El control y los tratamientos se realizan por triplicado. Los grupos son los siguientes: Control (DMSO), 1 μM de erastina, 0,3 μM de RSL3, 250 μM de FAC, 2 μM de Ferrostatina 1, 1 μM de erastina + 2 μM de Ferrostatina 1, 0,3 μM de RSL3 + 2 μM de Ferrostatina 1, 250 μM de FAC + 2 μM de Ferrostatina 1. Se necesitan cuatro placas de 6 pocillos para el experimento, como se indica en la Tabla 1). Los detalles comerciales de todos los reactivos necesarios se enumeran en la Tabla de Materiales.
<ol><li>24 h después de la siembra, añadir el tratamiento correspondiente al pocillo con las celdas.</li>
	<li>Deje las placas a 37 °C y 5% deCO2 en la incubadora.</li>
</ol>3. Tinción de hidroperóxidos lipídicos de las células tratadas con sonda BODIPY 581/591 C11
NOTA: La solución madre de la sonda específica de hidroperóxido lipídico se prepara en DMSO a una concentración de 1 mM. Las alícuotas de la solución madre se almacenan a -20 °C en tubos no transparentes. Para la tinción, prepare una solución de trabajo de 2 μM de la sonda en medios DMEM suplementados con FBS al 8%.
<ol><li>6 h después del tratamiento, observe las células bajo un microscopio óptico (el redondeo celular debe ser visible).</li>
	<li>Retire las placas de la incubadora y colóquelas en una campana de flujo laminar para cultivo de tejidos. Con un aspirador, extraiga los medios y las células flotantes (muertas).</li>
	<li>Agregue suavemente 2 ml de PBS a cada pocillo, lave el fondo con movimientos circulares de las placas de 6 pocillos y luego retire el PBS de los pocillos con un aspirador.</li>
	<li>Añadir 2 mL de la solución de trabajo de la sonda (concentración final de 2 μM en DMEM suplementado con FBS).</li>
	<li>Deje el plato en la incubadora a 37 °C y 5% de CO2 durante 30 min en la oscuridad (los platos se pueden envolver en papel de aluminio).</li>
</ol>4. Análisis por citometría de flujo del contenido de hidroperóxido lipídico en las células tratadas
NOTA: Todos los siguientes pasos se realizan en la oscuridad (sin luces en la campana de flujo laminar).
<ol><li>Saque las placas de la incubadora y colóquelas en una campana de flujo laminar para cultivo de tejidos. Con un aspirador, retire la solución de tinción.</li>
	<li>Agregue suavemente 2 ml de PBS a cada pocillo, lave el fondo con movimientos circulares de las placas de 6 pocillos y luego retire el PBS de los pocillos con un aspirador.</li>
	<li>Repita el paso de lavado una vez más y aspire cualquier PBS restante del pocillo con un aspirador.</li>
	<li>Agregue 150 μL de un reactivo de disociación celular disponible comercialmente (consulte la Tabla de materiales) en el fondo de cada pocillo e incube la placa hasta que un golpeteo suave de la placa desaloje las células. Tome 250 μL de tampón FACS (PBS, 2 mM EDTA, 0,5% BSA) y recoja mecánicamente las células de los pocillos.</li>
	<li>Transfiera las celdas al tubo FACS correspondiente (previamente marcado) con la tapa del filtro. Coloque el tubo con las células en hielo en la oscuridad hasta que se realice el análisis (el análisis debe realizarse dentro de una hora después de la tinción). NOTA: La configuración y calibración de la máquina FACS dependen de la máquina utilizada (consulte la Tabla de materiales).</li>
	<li>Crea un nuevo experimento y dale un nombre (Ferroptosis en DAOY - hidroperóxidos lipídicos).</li>
	<li>En el diseño del experimento, elija el láser (488 nm) y el filtro (FITC).</li>
	<li>En los datos de visualización, seleccione el tamaño de celda adecuado (>12 μm), establezca los voltajes PMT (la población de celdas debe aparecer en el primer cuadrante del diagrama de puntos SSC-H/FSC-H) y cierre el diagrama de puntos.</li>
	<li>Agregue un nuevo gráfico: histograma, con FITC-A en el eje y y escala logarítmica.</li>
	<li>Agite las muestras en el tubo FACS, colóquelas en la máquina FACS y cargue la muestra. Registre 10.000 eventos singlete FSC y asigne un nombre al archivo (por ejemplo, DAOY WT CTL 6h). Exporte el archivo como .fcs.</li>
</ol>5. Tinción de yoduro de propidio (PI) de las células muertas durante el tratamiento
NOTA: El diseño del experimento es exactamente el mismo que para la medición de hidroperóxido lipídico (ver paso 1 y paso 2).
<ol><li>24 h después de la siembra, saque los platos de la incubadora y colóquelos en la campana de flujo laminar.</li>
	<li>Recoja los medios (con células muertas) en un tubo de 15 ml.</li>
	<li>Agregue 1 mL de PBS a cada pocillo, lave el fondo con movimientos circulares de las placas de 6 pocillos y luego recoja el PBS en el tubo con los medios respectivos.</li>
	<li>Agregue 200 μL de tripsina (dilución 10x) en el fondo de cada pocillo e incube la placa hasta que un suave golpeteo de la placa desaloje las células. Utilice el medio respectivo + PBS para recolectar las células de los pozos.</li>
	<li>Centrifugar la suspensión celular a 180 x g durante 10 min a temperatura ambiente. Retire el sobrenadante con un aspirador.</li>
	<li>Vuelva a suspender el pellet celular en 300 μL de tampón FACS y colóquelo en hielo hasta el análisis.</li>
	<li>Justo antes del análisis, agregue la solución de PI (consulte la Tabla de materiales) hasta una concentración final de 2 μg/mL.</li>
</ol>6. Análisis por citometría de flujo de células muertas 24h post-tratamiento
NOTA: La configuración y la calibración de la máquina FACS se realizan como se indicó anteriormente (consulte el paso 4).
<ol><li>Crea un nuevo experimento y dale un nombre (Ferroptosis en DAOY - muerte celular).</li>
	<li>En el diseño del experimento, elija el láser (488 nm) y el filtro (PE).</li>
	<li>En los datos de visualización, seleccione el tamaño de celda adecuado (>12 μm), establezca los voltajes PMT (la población de celdas debe aparecer en el primer cuadrante del diagrama de puntos SSC-H/FSC-H) y cierre el diagrama de puntos.</li>
	<li>Agregue un nuevo gráfico: histograma, con PE-A en el eje y y escala logarítmica.</li>
	<li>Agite las muestras en el tubo FACS, colóquelas en la máquina FACS y cargue la muestra.</li>
	<li>Registre 10.000 eventos singlete FSC y asigne un nombre al archivo (por ejemplo, DAOY WT CTL 6h). Exporte el archivo como .fcs.</li>
</ol>7. Análisis por citometría de flujo del contenido de hidroperóxido lipídico en las células DAOY xCT-/-
NOTA: Las celdas xCT-/- se han generado como se describió anteriormente24.
<ol><li>Para este experimento, siembre las células como se indica en el paso 2, pero en lugar del tratamiento, complemente el medio con 1 mM de NAC durante la noche.</li>
	<li>Al día siguiente, mantenga el NAC en un grupo y retírelo del otro.</li>
	<li>Realice el análisis de citometría de flujo del contenido de hidroperóxido lipídico exactamente de la misma manera que se describe en el paso 6.</li>
</ol>8. Análisis de los resultados del citómetro de flujo
<ol><li>Abra el documento .fcs en el software FlowJo (consulte Tabla de materiales).</li>
	<li>Haga doble clic en el archivo individual para abrir todos los eventos (no solo los singletes FCS) registrados en la muestra individual (diagrama de puntos SSC-A/FSC-A). Dado que la configuración es tal que la compuerta realizada en la máquina no se conserva, es necesario hacer la puerta una vez más y nombrar la población (por ejemplo, DAOY WT).</li>
	<li>Haga doble clic en la población cerrada para abrir otra ventana con el histograma.</li>
	<li>Cambie el eje Y al filtro fluorescente utilizado (Comp-FITC/PE-A).</li>
	<li>Cambie el eje X a modal (normalice cada pico a su modo, es decir, al % del número máximo de celdas que se encuentran en un contenedor en particular).</li>
	<li>Copie el histograma en el editor de diseño. Repita esto para todas las muestras, y cada vez que se pegue un nuevo histograma en el editor de diseño, arrástrelo sobre el anterior para que los histogramas se superpongan (medio desplazamiento).</li>
</ol>

Análisis FACS de hidroperóxidos lipídicos en células de meduloblastoma ferroptótico

<ol><li>Dixon, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ferroptosis%3A+An+iron-dependent+form+of+nonapoptotic+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Ferroptosis: An iron-dependent form of nonapoptotic cell death.</a> Cell. 149, 1060-1072 (2012).</li>
<li>Yang, W. S., Stockwell, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+lethal+screening+identifies+compounds+activating+iron-dependent%2C+nonapoptotic+cell+death+in+oncogenic-ras-harboring+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Synthetic lethal screening identifies compounds activating iron-dependent, nonapoptotic cell death in oncogenic-ras-harboring cancer cells.</a> Chem Biol. 15 (30), 234-245 (2008).</li>
<li>Yang, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+ferroptotic+cancer+cell+death+by+GPX4%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of ferroptotic cancer cell death by GPX4.</a> Cell. 156, 317-331 (2014).</li>
<li>Meister, A., Anderson, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutathione%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Glutathione.</a> Annu Rev Biochem. 52, 711-760 (1983).</li>
<li>Lewerenzm, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cystine%2Fglutamate+antiporter+system+xc-+in+health+and+disease%3A+From+molecular+mechanisms+to+novel+therapeutic+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">The cystine/glutamate antiporter system xc- in health and disease: From molecular mechanisms to novel therapeutic opportunities.</a> Antioxid Redox Signal. 18 (5), 522-555 (2013).</li>
<li>Yang, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+ferroptotic+cancer+cell+death+by+GPX4%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of ferroptotic cancer cell death by GPX4.</a> Cell. 156, 317-331 (2014).</li>
<li>Bersuker, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CoQ+oxidoreductase+FSP1+acts+parallel+to+GPX4+to+inhibit+ferroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The CoQ oxidoreductase FSP1 acts parallel to GPX4 to inhibit ferroptosis.</a> Nature. 575, 688-692 (2019).</li>
<li>Doll, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FSP1+is+a+glutathione-independent+ferroptosis+suppressor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">FSP1 is a glutathione-independent ferroptosis suppressor.</a> Nature. 575, 693-698 (2019).</li>
<li>Hu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blockade+of+GCH1%2FBH4+axis+activates+ferritinophagy+to+mitigate+the+resistance+of+colorectal+cancer+to+erastin-induced+ferroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Blockade of GCH1/BH4 axis activates ferritinophagy to mitigate the resistance of colorectal cancer to erastin-induced ferroptosis.</a> Front Cell Dev Biol. 10, (2022).</li>
<li>Lei, G., Zhuang, L., Gan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+ferroptosis+as+a+vulnerability+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Targeting ferroptosis as a vulnerability in cancer.</a> Nat Rev Cancer. 22, 381-396 (2022).</li>
<li>Viswanathan, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dependency+of+a+therapy-resistant+state+of+cancer+cells+on+a+lipid+peroxidase+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dependency of a therapy-resistant state of cancer cells on a lipid peroxidase pathway.</a> Nature. 547, 453-457 (2017).</li>
<li>Lee, J., You, J. H., Kim, M. S., Roh, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+reprogramming+of+epithelial-mesenchymal+transition+promotes+ferroptosis+of+head+and+neck+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biol%22%5BJournal%5D)">Epigenetic reprogramming of epithelial-mesenchymal transition promotes ferroptosis of head and neck cancer.</a> Redox Biol. 37, 101697(2020).</li>
<li>Hangauer, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug-tolerant+persister+cancer+cells+are+vulnerable+to+GPX4+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Drug-tolerant persister cancer cells are vulnerable to GPX4 inhibition.</a> Nature. 551, 247-250 (2017).</li>
<li>Zhang Tuo, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombin+induces+ACSL4-dependent+ferroptosis+during+cerebral+ischemia%2Freperfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduct+Target+Ther%22%5BJournal%5D)">Thrombin induces ACSL4-dependent ferroptosis during cerebral ischemia/reperfusion.</a> Signal Transduct Target Ther. 7, 59(2022).</li>
<li>Sun, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+ferroptosis+and+emerging+links+to+the+pathology+of+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Aging+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of ferroptosis and emerging links to the pathology of neurodegenerative diseases.</a> Front Aging Neurosci. 14, (2022).</li>
<li>Zhuo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+role+of+ferroptosis+in+glioblastoma%3A+Therapeutic+opportunities+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Biosci%22%5BJournal%5D)">Emerging role of ferroptosis in glioblastoma: Therapeutic opportunities and challenges.</a> Front Mol Biosci. 9, (2022).</li>
<li>Bisaro, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+extracellular+vesicles+from+medullospheres+reveals+a+role+for+iron+in+the+cancer+progression+of+medulloblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Ther%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of extracellular vesicles from medullospheres reveals a role for iron in the cancer progression of medulloblastoma.</a> Mol Cell Ther. 3, 8(2015).</li>
<li>Schonberg, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+iron+trafficking+characterizes+glioblastoma+stem-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Preferential iron trafficking characterizes glioblastoma stem-like cells.</a> Cancer Cell. 28 (4), 441-455 (2015).</li>
<li>Werbowetski-Ogilvie, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+sorting+to+sequencing+in+the+molecular+era%3A+the+evolution+of+the+cancer+stem+cell+model+in+medulloblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">From sorting to sequencing in the molecular era: the evolution of the cancer stem cell model in medulloblastoma.</a> FEBS J. 289 (7), 1765-1778 (2022).</li>
<li>Dixon, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+inhibition+of+cystine-glutamate+exchange+induces+endoplasmic+reticulum+stress+and+ferroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Pharmacological inhibition of cystine-glutamate exchange induces endoplasmic reticulum stress and ferroptosis.</a> Elife. 3, e02523(2014).</li>
<li>Bauckman, K. A., Haller, E., Flores, I., Nanjundan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+modulates+cell+survival+in+a+Ras-+and+MAPK-dependent+manner+in+ovarian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">Iron modulates cell survival in a Ras- and MAPK-dependent manner in ovarian cells.</a> Cell Death Dis. 4, e592(2013).</li>
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<li>Cheff, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ferroptosis+inducing+compounds+RSL3+and+ML162+are+not+direct+inhibitors+of+GPX4+but+of+TXNRD1%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biol%22%5BJournal%5D)">The ferroptosis inducing compounds RSL3 and ML162 are not direct inhibitors of GPX4 but of TXNRD1.</a> Redox Biol. 62, 102703(2023).</li>
<li>Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+degradation+mechanism+of+GPX4+degrader+in+induction+of+ferroptosis+exerting+anti-resistant+tumor+effect%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Dual degradation mechanism of GPX4 degrader in induction of ferroptosis exerting anti-resistant tumor effect.</a> Eur J Med Chem. 247, 115072(2023).</li>
<li>Vucetic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Together+we+stand%2C+apart+we+fall%3A+how+cell-to-cell+contact%2Finterplay+provides+resistance+to+ferroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">Together we stand, apart we fall: how cell-to-cell contact/interplay provides resistance to ferroptosis.</a> Cell Death Dis. 11, 789(2020).</li>
<li>Meira, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cystine-cysteine+intercellular+shuttle+prevents+ferroptosis+in+xctko+pancreatic+ductal+adenocarcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">A cystine-cysteine intercellular shuttle prevents ferroptosis in xctko pancreatic ductal adenocarcinoma cells.</a> Cancers (Basel). 13 (6), 1434(2021).</li>
</ol>

No declaramos ningún conflicto de interés para el estudio que se presenta aquí.

La principal característica distintiva de la muerte celular ferroptótica es la acumulación incontrolada de hidroperóxidos lipídicos en la membrana plasmática. Este daño oxidativo puede ocurrir de forma enzimática o no enzimática, pero en ambos casos, la reacción es dependiente/catalizada por hierro, lo que explica el nombre de este tipo de muerte celular. La hidroperoxidación lipídica a menudo se estima indirectamente midiendo los productos de degradación de la hidroperoxidación lipídica, como el 4-hidroxi-2,3-trans-nonenal (4-HNE) o el malonaldehído (MDA). Estos productos, generados por la descomposición peroxidativa de ácidos grasos poliinsaturados, pueden reaccionar con diversas macromoléculas, dando lugar a una gran variedad de patologías, como trastornos neurodegenerativos, diabetes e insuficiencia cardíaca crónica, entre otras. Sin embargo, estas son las consecuencias del evento de peroxidación, y se ha invertido un esfuerzo significativo en el desarrollo de buenas sondas específicas de hidroperóxido lipídico.
Una sonda de uso frecuente es BODIPY 581/591 C11, que también tiene sus desventajas que deben tenerse en cuenta. En concreto, el color de fluorescencia BODIPY 591/581 presenta dos picos de emisión, uno en su estado reducido (590 nm) y otro en su estado oxidado (510 nm). La relación entre la fluorescencia en estas dos longitudes de onda es de particular importancia si el objetivo es una cuantificación precisa. Sin embargo, la intensidad de la fluorescencia de emisión simple de BODIPY 591/581 nm ha sido ampliamente utilizada en toda la literatura 1,25,26,27,28, especialmente porque la intensidad reducida de la emisión roja a 510 nm está frecuentemente enmascarada por el desbordamiento de la fluorescencia de la molécula oxidada22,29. Esta es una de las principales razones por las que la fluorescencia de BODIPY 591/581 generalmente se representa de manera cualitativa en función de la intensidad de fluorescencia única (verde).
Otra limitación importante de esta sonda es su supresión de la emisión de fluorescencia por antioxidantes de manera dependiente de la concentración30. Por lo tanto, la tinción debe realizarse en medios sin suplementos antioxidantes. En el presente protocolo se utilizó ferrostatina 1, un potente eliminador de hidroperóxidos lipídicos; sin embargo, antes de agregar la sonda, se eliminó la ferrostatina 1 y las células se lavaron con PBS para que la sonda no quedara expuesta a su actividad antioxidante.
Con respecto a la inducción de la ferroptosis, se podrían utilizar muchos fármacos disponibles en el mercado. En este caso, se empleó erastina, un inhibidor irreversible del transportador xCT31. Dado que se une covalentemente al transportador, se podrían utilizar concentraciones aún más altas (hasta 100 μM) durante un período de tiempo más corto (5 min), seguido de una etapa de lavado31. Para evaluar la cinética exacta de la ferroptosis tras la inhibición completa de xCT, se utilizaron células xCT-/- en ausencia de NAC. Se detectó una acumulación masiva de hidroperóxidos lipídicos después de 6 h, y prácticamente ninguna célula viable fue detectable 24 h después de la siembra. En cuanto a RSL3, un inductor altamente potente de ferroptosis en el rango nanomolar, exhibió una cinética similar a la observada con las células xCT-/-. Su modo de acción sigue siendo bastante controvertido, pero parece que no afecta a la actividad, sino que induce la degradación de la enzima GPx432,33.
Un aspecto importante de la inducción de ferroptosis in vitro es la confluencia celular. Desde hace mucho tiempo se ha observado que una capa de células confluentes es mucho más resistente a la inanición de cisteína, a la inhibición de xCT o GPx4, a la depleción de GSH, etc.34. La razón principal dada es que el contacto físico, es decir, la confluencia, conduce a la activación de la vía del hipopótamo, que, a su vez, regula a la baja el metabolismo y la producción interna de especies reactivas de oxígeno (ROS). Además, la lanzadera de cisteína reducida también podría contribuir a la resistencia a la inhibición incompleta de xCT35. En el presente estudio, se utilizó una concentración de 1.00.000 células por pocillo (placa de 6 pocillos) para mantener una baja confluencia con células que son bastante grandes y planas. Sin embargo, con celdas más pequeñas y de forma redonda, como HD-MB03, este número podría aumentarse a 1,50,000-2,00,000 celdas por pocillo (placa de 6 pocillos).
La última limitación del presente estudio es la detección de la muerte celular por el método de yoduro de propidio (PI). Este método es fácil de usar para detectar cualquier tipo de muerte celular, y la ferroptosis podría distinguirse de otros tipos de muerte celular mediante el uso de inhibidores específicos de la ferroptosis, como la ferrostatina-1. La tinción de PI se basa en el hecho de que las células moribundas pierden la integridad de la membrana, lo que permite que PI penetre en las células, se intercale entre las bases de ADN y emita una señal fluorescente. Sin embargo, vale la pena señalar que la hidroperoxidación lipídica induce una "fuga" de membrana, lo que permite la penetración de PI incluso antes de que ocurra la muerte celular. Por lo tanto, estimar la cinética de la ferroptosis basándose únicamente en este método es un desafío.

La ferroptosis es un tipo de muerte celular dependiente de especies reactivas de oxígeno (ROS) recientemente contextualizado1. Además de las ROS, el hierro desempeña un papel crucial en este tipo de muerte celular, de ahí el nombre2. El paso final y ejecutivo de la ferroptosis es la acumulación catalizada por hierro del daño oxidativo de los lípidos en la membrana plasmática que finalmente conduce a un compromiso de la integridad de la membrana y la permeabilidad selectiva y, finalmente, a la muerte celular por burbujeo. El evento de hidroperoxidación lipídica es un fenómeno que ocurre naturalmente; Sin embargo, su propagación a través de la membrana celular es evitada por la defensa antioxidante de la célula. El actor principal en este contexto es la proteína Se glutatión peroxidasa 4 (GPx4), que puede acercarse a la membrana y convertir los hidroperóxidos lipídicos en sus derivados alcohólicos menos tóxicos3. El poder reductor de GPx4 lo aporta principalmente, pero no exclusivamente, el glutatión (GSH), un tripéptido compuesto por los aminoácidos no esenciales: glicina, glutamato y cisteína. El aminoácido limitante de la biosíntesis de GSH es la cisteína4. Aunque la cisteína se clasifica como un aminoácido no esencial, sus requisitos pueden superar fácilmente su producción interna en células altamente proliferativas (como las células cancerosas). Por lo tanto, se ha reclasificado en el grupo de los aminoácidos semiesenciales. La importación necesaria de cisteína se produce principalmente a través del sistema Xc-, que permite la importación de la forma oxidada (dominante) de cisteína (también conocida como cistina) a expensas de la exportación deglutamato 5. El sistema Xc- está compuesto por una subunidad de transporte independiente de Na+ y dependiente de Cl, conocida como xCT, y una subunidad chaperona, conocida como CD98. Hasta hace poco, las propiedades antiferroptóticas del eje xCT-GSH-GPx4 se han considerado únicas e irrepetibles6. Sin embargo, en 2019, se describió una vía antiferroptótica alternativa, compuesta por ubiquinol (coenzima Q10) y su enzima regenerativa, la proteína supresora de ferroptosis 1 (FSP1) 7,8. Poco después, se ha descrito otro sistema de desintoxicación de hidroperóxidos lipídicos que involucra GTP ciclohidrolasa-1 / tetrahidrobiopterina (GCH1 / BH4)9. No obstante, el papel central del eje xCT-GSH-GPx4 en la prevención de la ferroptosis no parece ser cuestionado.
Durante la última década, la ferroptosis ha sido ampliamente estudiada en una variedad de tipos de tumores, mostrando un gran potencial como estrategia anticancerígena (revisado por Lei et al.10). Además, se ha reportado que las células cancerosas que exhiben una alta resistencia a los quimioterapéuticos convencionales y/o una propensión a hacer metástasis son sorprendentemente sensibles a los inductores de ferroptosis, como los inhibidores de GPx4 11,12,13. Sin embargo, en el contexto de los tumores cerebrales, el potencial de los inductores ferroptóticos sigue siendo muy poco estudiado. Si bien este tipo de muerte celular se ha asociado estrechamente con lesiones por isquemia-reperfusión cerebral14y enfermedades neurodegenerativas15, su potencial en el contexto de los tumores cerebrales se ha limitado principalmente al glioblastoma, el tumor craneoencefálico maligno más común (revisado por Zhuo et al.16). Por otro lado, la sensibilidad del meduloblastoma, el tumor cerebral pediátrico maligno más común y una de las principales causas de mortalidad infantil, a los inductores de ferroptosis sigue siendo en gran medida inexplorada. Hasta donde sabemos, hay escasa literatura revisada por pares que relacione la ferroptosis y el meduloblastoma. Sin embargo, algunos estudios han revelado que el hierro desempeña un papel crucial en la supervivencia, la proliferación y el potencial tumorigénico de las células madre cancerosas (CSC) del meduloblastoma y del glioblastoma17,18, lo que podría hacerlas más vulnerables a la inducción de ferroptosis. Esto es particularmente significativo ya que el meduloblastoma es notorio por su subpoblación de CSC, o células iniciadoras/propagadoras de tumores, que parecen ser en gran medida responsables de la quimiorresistencia tumoral, la diseminación y la recaída19.
La sensibilidad a la inducción de ferroptosis se investiga típicamente midiendo el contenido/acumulación de hidroperóxido lipídico, que puede o no conducir a la muerte celular. Los inductores de ferroptosis más utilizados son (1) erastina, un inhibidor del transportador xCT20, (2) RSL3, un inhibidor de la enzima GPx42, y/o (3) donantes de hierro, como el citrato de ferroamonio (FAC)21. El contenido de hidroperóxido lipídico se evalúa utilizando la sonda selectiva BODIPY 581/591 C1122, que tiene máximos de excitación y emisión a 581/591 nm en su estado reducido. Tras la interacción y oxidación por hidroperóxidos lipídicos, la sonda cambia sus máximos de excitación y emisión a 488/510 nm. Típicamente, un aumento significativo en el contenido de hidroperóxido lipídico precede a la muerte de las células ferroptóticas. Dado que la ferroptosis no es una muerte celular programada, no hay una cascada de señalización molecular que conduzca a su ejecución. Por lo tanto, la única forma de confirmarlo es monitorizar el contenido de hidroperóxidos lipídicos y utilizar inhibidores específicos para este tipo de muerte celular, como la ferrostatina 123. La ferrostatina 1 es un antioxidante lipofílico que puede penetrar en el compartimento lipídico de la célula y desintoxicar los hidroperóxidos lipídicos, previniendo así los eventos ferroptóticos.

<table><tbody><tr><td>BODIPY 581/591 C11</td><td>Thermo Fisher</td><td>D3861</td><td></td></tr><tr><td>Contador de celdas</td><td>Beckman</td><td>Coulter Z1</td><td></td></tr><tr><td>DMEM medium&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>10569010</td><td></td></tr><tr><td>Erastin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7781-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Citrato de ferromenio</td><td>Acros Organics</td><td>211842500</td><td></td></tr><tr><td>Ferrostatina-1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML0583-25MG</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovin (FBS)</td><td>Dominique Dutcher</td><td>500105N1N</td><td></td></tr><tr><td>Citómetro de flujo</td><td>BD Biosciences</td><td>FACS Melody</td><td></td></tr><tr><td>Gibco StemPro Accutase Reactivo de disociación celular</td><td>Thermo Fisher</td><td>11599686</td><td></td></tr><tr><td>N-acetilcisteína</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7250</td><td></td></tr><tr><td>PlasmoTest Kit de detección de micoplasma</td><td>InvivoGen</td><td>Rep-PT1</td><td></td></tr><tr><td>yoduro de propidio</td><td>Invitrogen</td><td>P3566</td><td></td></tr><tr><td>RSL3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML2234-25MG</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina - EDTA 10X - 100 mL</td><td>Dominique Dutcher</td><td>X0930-100</td><td></td></tr></tbody></table>

revelando el fenotipo ferroptótico del meduloblastoma

Revealing the Ferroptotic Phenotype of Medulloblastoma

La interacción del hierro y el oxígeno es una parte integral del desarrollo de la vida en la Tierra. No obstante, esta química única sigue fascinando y desconcertando, lo que lleva a nuevas empresas biológicas. En 2012, un grupo de la Universidad de Columbia reconoció esta interacción como un evento central que conduce a un nuevo tipo de muerte celular regulada llamada "ferroptosis". La característica principal de la ferroptosis es la acumulación de hidroperóxidos lipídicos debido a (1) una defensa antioxidante disfuncional y/o (2) un estrés oxidativo abrumador, que coincide con mayor frecuencia con un mayor contenido de hierro lábil libre en la célula. Normalmente, esto se evita mediante el eje antiferroptótico canónico que comprende el transportador de cistina xCT, el glutatión (GSH) y la GSH peroxidasa 4 (GPx4). Dado que la ferroptosis no es un tipo programado de muerte celular, no involucra las vías de señalización características de la apoptosis. La forma más común de demostrar este tipo de muerte celular es mediante el uso de antioxidantes lipofílicos (vitamina E, ferrostatina-1, etc.) para prevenirla. Estas moléculas pueden acercarse y desintoxicar el daño oxidativo en la membrana plasmática. Otro aspecto importante para revelar el fenotipo ferroptótico es la detección de la acumulación previa de hidroperóxidos lipídicos, para lo cual se utiliza el colorante específico BODIPY C11. El presente manuscrito mostrará cómo se puede inducir ferroptosis en células de meduloblastoma de tipo salvaje mediante el uso de diferentes inductores: erastina, RSL3 y donante de hierro. Del mismo modo, se utilizarán las células xCT-KO que crecen en presencia de NAC y que sufren ferroptosis una vez que se elimina el NAC. El fenotipo característico "burbujeante" es visible bajo el microscopio óptico dentro de las 12-16 h desde el momento del desencadenamiento de la ferroptosis. Además, se utilizará la tinción con BODIPY C11 seguida de un análisis FACS para mostrar la acumulación de hidroperóxidos lipídicos y la consiguiente muerte celular utilizando el método de tinción PI. Para demostrar la naturaleza ferroptótica de la muerte celular, se utilizará la ferrostatina-1 como un agente específico para prevenir la ferroptosis.

La línea celular de meduloblastoma DAOY se cultivó en un medio DMEM estándar suplementado con 8% de FBS hasta que alcanzó aproximadamente un 60% de confluencia. El día del experimento, se recolectaron células y se sembraron 1.00.000 células por pocillo en placas de 6 pocillos, según la Tabla 1. Al día siguiente, las células (por triplicado) se trataron con 1 μM de erastina, 0,3 μM de RSL3 o 250 μM de FAC. A continuación, las placas se colocaron en la incubadora a 37 °C y 5% de CO2. Después de 6 h, las células se observaron bajo el microscopio para detectar células burbujeantes, como lo indican las flechas en la Figura 1. Esto sirvió como indicador de que el fármaco era eficaz para inducir ferroptosis antes de que las células se prepararan para la tinción con hidroperóxido lipídico y el posterior análisis de FACS.
Para la detección del contenido de hidroperóxido lipídico se utilizó el colorante específico BODIPY 581/591 C11 a una concentración final de 2 μM durante 30 min. Como este tinte es sensible al redox, fue necesario eliminar cualquier tratamiento de las células y lavarlas con PBS precalentado. Después de media hora de tinción, las células se lavaron dos veces con PBS, se separaron con la solución de desprendimiento de células y se prepararon para el análisis de FACS. Los datos obtenidos en este paso mostraron un aumento de la fluorescencia verde del colorante en las muestras tratadas con los tres fármacos (Figura 2). Sin embargo, el efecto más potente se observó con 0,3 μM de RSL3 (Figura 2B), mientras que 1 μM de erastina (Figura 2A) y 250 μM de FAC (Figura 2C) mostraron un efecto algo menor después de 6 h de tratamiento.
Para establecer que la acumulación de hidroperóxidos lipídicos detectada conduce a la muerte celular, específicamente a la ferroptosis, se aplicaron los mismos tratamientos descritos en la Tabla 1 durante 24 h. Para el análisis de las células muertas por citometría de flujo, se recolectaron tanto las células como el sobrenadante. Las células vivas y muertas se peletizaron por centrifugación y luego se resuspendieron en tampón FACS para su posterior análisis por citometría de flujo. Los datos presentados en la Figura 3 demostraron que los tres tratamientos indujeron la muerte celular masiva, que se previno por completo mediante el uso del inhibidor específico de la ferroptosis, la ferrostatina-1. Esto apoya claramente la aparición de la muerte de las células ferroptóticas tras la inhibición de xCT, la inhibición de GPx4 o la sobrecarga de hierro en las células de meduloblastoma.
Dado que los tres fármacos mostraron efectos algo diferentes sobre la acumulación de hidroperóxido lipídico, probablemente debido a las diferencias en la potencia, se empleó un enfoque genético para investigar la potencia total de los inductores ferroptóticos. Las células DAOY xCT-/- obtenidas previamente (Figura suplementaria 1A) se cultivaron en el mismo medio que sus contrapartes WT pero con suplementación con NAC. Esta selección positiva permitió que las células xCT-/- crecieran en cultivo. Sin embargo, 6 h después de que se eliminó NAC del medio de cultivo, las células comenzaron a acumular hidroperóxidos lipídicos al mismo nivel que las células WT tratadas con RSL3 (Figura 4). De manera similar a la inhibición farmacológica, la eliminación de NAC del medio indujo el burbujeo característico de las células xCT-/- después de 6 h (Figura suplementaria 1B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66645/66645fig01.jpg"> Figura 1: Fenotipo ferroptótico de las células de meduloblastoma. Micrografías representativas de células DAOY WT tratadas (o no) durante 6 h con 1 μM de erastina (ERA), 0,3 μM de RSL3 o 250 μM de citrato de ferroamonio (FAC) en presencia o no de 2 μM de ferrostatina-1 (Ferro-1). Las flechas blancas indican células redondas y "burbujeantes", lo que indica un fenotipo ferroptótico visible bajo un microscopio óptico. Aumento: 20x, insertos: 40x. Barras de escala: 50 μm, recuadros: 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66645/66645fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66645/66645fig02.jpg"> Figura 2: Hidroperóxido lipídico como marcador clave de ferroptosis en células de meduloblastoma. Datos representativos de la tinción de hidroperóxido lipídico por citometría de flujo en las células tratadas durante 6 h con (A,B) 1 μM de erastina (ERA), (C,D) 0,3 μM de RSL3, o (E,F) 250 μM de citrato de ferroamonio (FAC), en presencia o no de 2 μM de ferrostatina-1 inhibidor de la ferroptosis (Ferro-1). (A, C, E) Diagramas de puntos de los eventos registrados; (B, D, F) Representación del histograma del contenido de hidroperóxido lipídico. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66645/66645fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66645/66645fig03.jpg"> Figura 3: Inducción de la muerte celular ferroptótica por abordaje farmacológico. Diagramas representativos de puntos de citometría de flujo de células teñidas con yoduro de propidio después de 6 h de tratamiento con 1 μM de erastina (ERA), 0,3 μM de RSL3 o 250 μM de citrato de ferroamonio (FAC), en presencia o no de 2 μM de ferrostatina-1 (Ferro-1). La compuerta separa las poblaciones vivas (Q4) y muertas (Q3) de las células. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66645/66645fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66645/66645fig04.jpg"> Figura 4: Inducción de ferroptosis por abordaje genético. Datos representativos de la tinción de hidroperóxido lipídico por citometría de flujo en las células DAOY WT y xCT-/- después de 6 h en presencia o no de 2 μM de ferrostatina-1 (Ferro-1). A la izquierda se muestra la representación del histograma del contenido de hidroperóxido lipídico. A la derecha están los diagramas de puntos de los eventos registrados. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66645/66645fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Lámina I</td>
			<td>CTL I</td>
			<td>CTL II</td>
			<td>CTL III</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>1 μM de erastina I</td>
			<td>1 μM de erastina II</td>
			<td>1 μM de erastina III</td>
		</tr><tr><td>Lámina II</td>
			<td>0,3 μM RSL3 I</td>
			<td>0,3 μM RSL3 II</td>
			<td>0,3 μM RSL3 III</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>250 μM FAC I</td>
			<td>250 μM FAC II</td>
			<td>250 μM FAC III</td>
		</tr><tr><td>Lámina III</td>
			<td>2 μM Ferro-1 I</td>
			<td>2 μM Ferro-1 II</td>
			<td>2 μM Ferro-1 III</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>1 M erastin + 2 M Ferro-1 I</td>
			<td>1 M erastin + 2 M Ferro-1 II</td>
			<td>1 M erastin + 2 M Ferro-1 III</td>
		</tr><tr><td>Lámina IV</td>
			<td>0,3 m RSL3 + 2 m Ferro-1 I</td>
			<td>0,3 m RSL3 + 2 m Ferro-1 II</td>
			<td>0,3 m RSL3 + 2 m Ferro-1 III</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>250 m FAC + 2 m Ferro-1 I</td>
			<td>250 m FAC + 2 m Ferro-1 II</td>
			<td>250 m FAC + 2 m Ferro-1 III</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 1: Detalles del tratamiento de las células control y experimentales.
Figura suplementaria 1: Muerte celular ferroptótica de las células DAOY xCT-/- . (A) Análisis de Western blot del nivel de xCT en células DAOY WT y xCT-/- en medios DMEM suplementados o no con 2 μM de ferrostatina-1. (B) Micrografías representativas de las células DAOY xCT-/- en presencia (izquierda) y ausencia (derecha) de N-acetilcisteína 1mM durante 6 h. Las flechas blancas indican células redondas y "burbujeantes", lo que indica un fenotipo ferroptótico visible bajo un microscopio óptico. Ampliación: 40x. Barras de escala: 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66645/Supplementary%20Figure%201.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

El contenido de hidroperóxido lipídico representa el indicador más comúnmente utilizado de la muerte celular ferroptótica. Este artículo demuestra el análisis paso a paso de la citometría de flujo del contenido de hidroperóxido lipídico en las células tras la inducción de ferroptosis.

Revelando el fenotipo ferroptótico del meduloblastoma

The interaction of iron and oxygen is an integral part of the development of life on Earth. Nonetheless, this unique chemistry continues to fascinate and ...

El objetivo final de nuestra investigación es desarrollar nuevas terapias para los cánceres pediátricos como el mioblastoma. Para ello, nuestro equipo desarrolla nuevos sistemas modelo que ponen de manifiesto los antecedentes genéticos de la enfermedad, además de explotar nuevas vías terapéuticas. En los últimos años, la genómica de células individuales ha revelado cómo el deterioro del compromiso del linaje influye en el resultado clínico de los cánceres pediátricos, así como en la respuesta a los tratamientos y, en última instancia, en el desarrollo de poblaciones de células resistentes al tratamiento dentro del tumor.El espectro del estado diferenciado de los progenitores neurales parece ser la base del desenlace clínico del cáncer pediátrico. Los principales retos son entender estos progenitores altamente plásticos conocidos o insuficientemente conocidos dentro de los tumores, así como desarrollar nuevas terapias que sean más eficientes y menos dañinas para estas enfermedades. Desde este punto de vista, nuestra investigación sobre la ferroptosis parece extremadamente prometedora.La dependencia del hierro es una de las principales vulnerabilidades de las células cancerosas, también conocidas como células madre cancerosas, todo el elemento esencial. El hierro es un arma de doble filo, ya que su reacción con especies reactivas de oxígeno puede conducir al tipo específico de muerte celular, que se llama ferroptosis. Nuestros datos mostraron claramente que la ferroptosis tiene un gran potencial contra este tipo de células cancerosas.

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Caracterizar a los mutantes relacionados con enfermedades de los kinases familiares de la RAF mediante el uso de un conjunto de métodos prácticos y factibles

Descubre cómo inducir ferroptosis en células de meduloblastoma usando erastin y citometría de flujo. Este método permite evaluar la peroxidación lipídica y explorar nuevas estrategias terapéuticas contra cánceres pediátricos.

Revelando el fenotipo ferroptótico del meduloblastoma

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