Name: Respirometría de alta resolución en una cámara de pequeño volumen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-07-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 8 s
Description: Aprende respirometría de alta resolución en cámaras de 0.5 mL para análisis de función mitocondrial con menor volumen de muestra. Este método validado mejora el diagnóstico de enfermedades mitocondriales y el desarrollo de fármacos.

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Para el estudio sobre plaquetas humanas, ocho voluntarios dieron su consentimiento informado por escrito para participar en el estudio, que fue aprobado por la Autoridad de Revisión Ética de Suecia (Nr. 2013/181). Se compraron dos líneas celulares de fibroblastos de piel humana de recién nacidos varones a ATCC y se utilizaron de acuerdo con la aprobación ética del Ministerio de Salud de la República Checa (proyecto: AZV MZ CR NU22-07-00474). Los procedimientos con ratones se llevaron a cabo de acuerdo con la Ley de Experimentación Animal de Austria y de conformidad con el Convenio Europeo para la Protección de los Animales Vertebrados utilizados para Experimentación y otros Fines Científicos (Tierversuchsgesetz 2012; Directiva 2010/63/UE; BMWFM-66.011/0128-WF/V/3b/2016). Se aplicó el principio de las 3R para minimizar el número de animales de experimentación.
1. Calibración de volumen
<ol>
	<li>Monte las cámaras de pequeño volumen (sV) o las cámaras de volumen clásico (cV) en el Oroboros (Figura 1A, B; Tabla 1).</li>
	<li>Enciende el Oroboros y conéctate a DatLab.</li>
	<li>Seca las cámaras.</li>
	<li>Pipetear 0,54 ml de H2O en els V (0,50 ml de volumen experimental efectivo más 0,04 ml de volumen muerto capilar) o 2,07 ml de H2O en el cV (2,00 ml de volumen efectivo más 0,07 ml de volumen muerto capilar). NOTA: Para evitar la pérdida de líquido entre la parte superior del cilindro de vidrio y el soporte de la cámara de polioximetileno (POM), inserte la punta de la pipeta lo suficientemente profunda como para tocar la pared de la cámara de vidrio.</li>
	<li>Encienda los agitadores.</li>
	<li>Antes de cerrar la cámara, humedezca las juntas tóricas de los tapones mientras mantiene seco su capilar. Afloje los anillos de calibración de volumen e inserte los tapones hacia abajo hasta que el líquido llene el capilar del tapón y aparezca una pequeña gota en el recipiente en el extremo superior del capilar (Tabla 1).</li>
	<li>Apriete los anillos de calibración de volumen para fijar su posición de modo que el volumen calibrado se obtenga en inserciones consecutivas de los tapones.</li>
</ol>
2. Entorno general de Oroboros
<ol>
	<li>Inicie el software DatLab .</li>
	<li>Ajuste la temperatura experimental (37 °C) y la velocidad de rotación de agitación a 550 rpm (9,2 Hz o rotaciones por s) en la cámara sV o 750 rpm (12,5 Hz) en la cámara cV. Establezca el intervalo de muestreo de datos en 2 s con suavizado de más de 80 s (40 puntos de datos) en pruebas instrumentales de fondo O2 o 40 s (20 puntos de datos) para respirometría. NOTA: Las barras de agitación magnética (AlNiCo recubiertas de difluoruro de polivinilideno [PVDF]; Tabla 1) son agitados por un campo magnético giratorio pulsado con una intensidad de campo de 3,5 mT al nivel del agitador en la cámara.</li>
	<li>Realice la calibración del aire28 en MiR05 o en el mismo medio de incubación utilizado en experimentos posteriores.</li>
	<li>Realice calibraciones de oxígeno cero de vez en cuando, pero nunca inmediatamente antes de comenzar los experimentos.<ol>
		<li>Prepare una solución madre fresca de Na-ditionita disolviendo el polvo de O2-Zero en tampón de fosfato de 50 mM (pH 8,0) a una concentración de 2,5 mM o 10 mM para las cámaras sV o cV , respectivamente.</li>
		<li>Valore el Na-ditionito en exceso para obtener la señal bruta R0 o corriente cero [μA] a una concentración de O2 0 μM14,28.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Prueba de antecedentes instrumental O2
<ol>
	<li>Sala sV
	<ol>
		<li>Después de la calibración del aire, cierre la cámara. Controle la señal de oxígeno durante unos 60 min hasta que la concentración de O2 disminuya de la saturación del aire a aproximadamente 150 μM. Establezca cuatro marcas J°1 a J°4 en el gráfico 'O2 pendiente negativa'. NOTA: Realice esta prueba instrumental de fondo O2 todos los días antes de comenzar un experimento.</li>
		<li>OPCIONAL: Con una jeringa Hamilton, valore el Na-ditionito preparado de acuerdo con el paso 2.4.1 para alcanzar una concentración de O2 de 100 μM (Figura 1C). NOTA: En otro protocolo, el Na-ditionito se titula en la cámara utilizando la microbomba de valoración-inyección (TIP2k; Figura complementaria 1 y Figura complementaria 2) para la comparación con un método estándar para determinar el flujo instrumental de fondo O2 28.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sala cV
	<ol>
		<li>Después de la calibración del aire, cierre la cámara, espere a que se estabilice la pendiente de O2 y coloque la marca J ° 1 en la parcela 'Pendiente de O2 neg.'28. Con una jeringa Hamilton, valorar la Na-ditionita preparada de acuerdo con el paso 2.4.1. en pasos de 0,7 μL para que coincida con el régimen deoxígeno de la V de la cámara y reduzca la concentración de O2 a 150 μM.</li>
		<li>Agregue otro paso de valoración de Na-ditionito (aprox. 7 μL) para reducir la concentración de O2 a 100 μM (Figura 1D).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Análisis de datos de fondo instrumental O2<ol>
		<li>Calcule la pendiente de fondo instrumental O2 en DatLab28. Seleccione Flujo/Pendiente en el menú superior.</li>
		<li>Abra la ventana de corrección de fondo de O2. Seleccione Archivo activo como origen del fondo O2 y seleccione las marcas J° que se utilizarán para el cálculo de la regresión lineal. Aplique la corrección de fondo O2.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67442/67442fig1v2.jpg"> 
Figura 1: Cámaras de pequeño volumen (sV) y volumen clásico (cV) y prueba de fondo instrumental de O2. (A) Sala sv. (B) Sala cv. (C) Trazas representativas de pendientes negativas y marcas J°1, sV (0,5 mL; verde) y cV (2,0 mL; azul). (D) Concentración de oxígeno correspondiente y marcas R1. Tres valoraciones manuales de Na-ditionito (aprox. 0,7 μL, 10 mM de stock; cV) y una valoración final de 7,0 μL de 2,5 mM y 10 mM de stock en la cámara sV y cV , respectivamente. Se eliminaron los picos causados por las valoraciones. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67442/67442fig1v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
4. Adición de muestra a las cámaras de Oroboros
NOTA: La muestra se puede agregar a la cámara por dos métodos: reemplazo de volumen parcial (plaquetas y fibroblastos en el presente estudio) o reemplazo de volumen completo (mitocondrias aisladas en el presente estudio).
<ol>
	<li>Reemplazo parcial de volumen<ol>
		<li>Retire el tapón completamente insertado. Pipetea y desecha un volumen Vde MiR05. Vout es de 60-70 μL para plaquetas y 80-150 μL para fibroblastos, calculados de acuerdo con las concentraciones celulares en la suspensión de células madre.</li>
		<li>Equivalente a Vout, pipetear el mismo volumen VJ.i de suspensión de células madre (con concentración celular conocida) en la cámara (Figura 2).</li>
		<li>Calcule la concentración de la célula experimental en el volumen real V' (0,54 ml y 2,07 ml), mayor que el volumen experimental efectivo V (0,5 ml y 2,0 ml). NOTA: Las concentraciones de la suspensión de células madre y la concentración de células experimentales deben planificarse para obtener volúmenes de VJ.i = Vout que sean compatibles con un pequeño error de valoración. En los experimentos con plaquetas, se utilizó un prototipo de tapón para la Cámara sV con un volumen muerto capilar de 0,05 mL.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Reemplazo completo del volumen<ol>
		<li>Extrae todo el medio de la cámara y reemplázalo con al menos 0,54 ml o 2,07 ml de solución madre de mitocondrias aislada a la concentración de muestra experimental en las cámaras sV o cV, respectivamente.</li>
		<li>Cierre la cámara y sifone el exceso de solución madre mitocondrial del receptáculo del tapón. NOTA: El reemplazo completo del volumen excluye cualquier variabilidad en la concentración mitocondrial en la que pueda incurrir al ajustar en la cámara cerrada a través del capilar de tapón con una jeringa Hamilton. Este último método es aplicable a muestras con un diámetro pequeño preparadas en suspensiones de stock concentrado (por ejemplo, mitocondrias aisladas); sin embargo, expone las células frágiles a posibles daños en las membranas plasmáticas por las fuerzas de cizallamiento ejercidas en la aguja de 51 mm de largo de la jeringa Hamilton (0,41 mm de diámetro interior). Esto se evita quitando el tapón y pipeteando la muestra en la cámara mediante un reemplazo parcial o completo del volumen. Se estudiaron tres tipos de preparaciones mitocondriales. Las preparaciones de muestra se describen en el Archivo Suplementario 1 1,26,29,30.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Células vivas: plaquetas humanas<ol>
		<li>Introducir los crioviales que contienen plaquetas en un baño de agua a 37 °C y descongelar el contenido hasta que quede poco hielo.</li>
		<li>Abra los viales criogénicos y agregue 1 ml de medio precalentado (DPBS + 10 mM EGTA, 37 °C) lentamente en gotas.</li>
		<li>Mezcle suavemente las plaquetas y transfiéralas a un tubo de centrífuga de 50 ml con un volumen total de 10 ml de medio precalentado (DPBS + 10 mM EGTA, 37 °C). Centrifugar a 1000 g durante 10 min a temperatura ambiente (RT) utilizando un rotor basculante (aceleración 6, freno 2).</li>
		<li>Vuelva a suspender las plaquetas en 0,25 ml de DPBS + 10 mM EGTA (RT) y agréguelas a las cámaras mediante reemplazo parcial de volumen a una concentración inicial de células experimentales que oscila entre 157 · 106 a 210 · 106 x·mL-1 en la cámara de 0,5 mL y de 164 · 106 a 220 · 106 x·mL-1 en la cámara de 2.0 mL (ver31 para detalles sobre la unidad elemental x). NOTA: Un Oroboros estaba equipado con la cámara sV y cV en las posiciones A y B, respectivamente, utilizada en paralelo con otro Oroboros equipado con la cámara sV y cV en las posiciones B y A, respectivamente.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Células permeabilizadas: fibroblastos humanos<ol>
		<li>Agregue las celdas a las cámaras de Oroboros mediante reemplazo parcial de volumen a una concentración nominal de celdas de 0.75 · 106 x·mL-1 en ambos tipos de cámara y calcular la concentración real (paso 4.1.3). NOTA: Se utilizaron diferentes instrumentos Oroboros en paralelo, cada uno equipado con las cámaras sV o cV .</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Mitocondrias aisladas: corazón de ratón<ol>
		<li>Agregue 15 μL de suspensión mitocondrial a 5985 μL de medio de respiración mitocondrial (MiR05), lo que da como resultado una concentración de proteína mitocondrial de reserva que oscila entre 0,013 y 0,026 mg∙mL-1.</li>
		<li>Agregue la suspensión mitocondrial a las cámaras de Oroboros mediante un reemplazo completo de volumen. NOTA: Un Oroboros estaba equipado con las cámaras sV y cV en las posiciones A y B, respectivamente, utilizadas en paralelo con otro Oroboros equipado con las cámaras sV y cV en las posiciones B y A, respectivamente.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67442/67442fig02.jpg"> 
Figura 2: Adición de la suspensión celular mediante reemplazo parcial de volumen. (A) Adición en la cámara de 0.5 ml sV y (B) la cámara cV de 2.0 ml. (1) Cámara cerrada con volúmenes de medio respiratorio V y tapón capilar lleno Vstc, para la medición del fondo instrumental O2 flujo JO2°. (2) Tapón retirado, Vstc drenado en la cámara, lo que da como resultado un volumen total V' = V + Vstc. (3) Eliminación parcial del medio Vout = -V J.i. Un volumen V''= V'+Vpermanece en la cámara. (4) Pipeteo de la submuestra con volumen V J.i de suspensión de células madre respirométricas en la cámara, lo que da como resultado un volumen total V# = V+Vstc de suspensión de células diluidas. (5) Cámara cerrada con tapón capilar lleno (volumen muerto Vstc) para la medición del flujo de O2 específico de volumen JV, O2 en un volumen experimental V. Esta figura se ha modificado de la Figura 2A en Recuento de células y normalización en HRR41. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67442/67442fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
5. Protocolos SUIT
<ol>
	<li>Valore las soluciones madre de los productos químicos enumerados en la Tabla complementaria 1 en las cámaras con microjeringas Hamilton, ajustando los volúmenes de valoración para obtener las mismas concentraciones experimentales en las cámaras sV y cV (ver leyendas de figuras de las Figuras 6, 8, 10).</li>
	<li>Seleccione el protocolo SUIT-003_D018 32,33 (para plaquetas en el presente estudio).</li>
	<li>Seleccione los protocolos SUIT-001_D004 4,15,34,35 y SUIT-002_D007 4,15,35,36 (para fibroblastos en el presente estudio).</li>
	<li>Seleccione el protocolo SUIT-002_D005 4,15,35,37 (para mitocondrias aisladas en el presente estudio).</li>
</ol>
6. Análisis de datos de SUIT
<ol>
	<li>En DatLab, establezca marcas para definir secciones de los gráficos seleccionados.</li>
	<li>Seleccione Flujo/pendiente en el menú superior. Abra la ventana Flujo/pendiente . Aplique la corrección del volumen de valoración para la dilución de muestras suspendidas por cada valoración en el protocolo SUIT.</li>
	<li>Selecciona Marcas en el menú superior. Abra las estadísticas de Marcar para mostrar la mediana de los puntos de datos marcados corregidos por la resta del consumo de oxígeno residual (rox).</li>
	<li>Calcule la intersección y la pendiente entre los resultados pareados obtenidos en las cámaras sV y cV mediante análisis de regresión invertida25,28 utilizando una hoja de cálculo.</li>
	<li>Compare las frecuencias respiratorias en el estado rox (flujos mínimos de O2) en las cámaras sV y cV mediante una prueba t de Student emparejada utilizando el software jamovi 2.3.1338. NOTA: Dado que las dos cámaras de un instrumento Oroboros son funcionalmente independientes (excepto por la temperatura y los intervalos de registro de DatLab), las mediciones en cada cámara se pueden considerar por separado, de manera similar al uso de diferentes instrumentos. Los resultados finales pueden informarse como medianas o promedios de múltiples cámaras con información sobre su variabilidad.</li>
</ol>

<meta charset="utf8"></head><body>Exploración de volúmenes de cámara para respirometría mitocondrial de alta resolución

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<li>Oroboros Instruments SUIT-001 O2 ce-pce D004. , 
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<li>Oroboros Instruments SUIT-002 O2 mt D005. , 
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</ol>

<table><tbody><tr><td>Anaconda3</td><td>Anaconda Software Distribution</td><td>https://www.anaconda.com/</td> <td>software</td></tr><tr><td>ADP</td><td>Merck, Alemania</td><td>117105</td><td></td></tr><tr><td>Antibióticos-antimicóticos 100x</td><td>Biosera, Francia</td><td>XC-A4110</td><td>PRECAUCIÓN H317 Puede causar una reacción alérgica en la piel</td></tr><tr><td>Antimicina A</td><td>Sigma-Aldrich, EE. UU.</td><td>A8674</td><td>PRECAUCIÓN H300&nbsp; Mortal en caso de ingestión, peligro acuático H400 a corto plazo (agudo)</td></tr><tr><td>Ascorbate</td><td>Sigma-Aldrich, Estados Unidos</td><td>A7631</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich, Estados Unidos</td><td>&nbsp; A 2383</td><td></td></tr><tr><td>BSA libre de ácidos grasos</td><td>Sigma-Aldrich, EE. UU.</td><td>A 6003</td><td>albúmina sérica bovina</td></tr><tr><td>CaCO3</td><td>Sigma-Aldrich, EE. UU.</td><td>C 4830</td><td></td></tr><tr><td>CCCP</td><td>Sigma-Aldrich, EE. UU.</td><td>C2759</td><td>cianuro de carbonilo m-clorofenil hidrazona PRECAUCIÓN H301 + H311 + H331 Tóxico en caso de ingestión, contacto con la piel o inhalación</td></tr><tr><td>Condesa Contador celular automatizado</td><td>Thermo Fisher Scientific, EE. UU</td>. <td>AMQAX100</td><td></td></tr><tr><td>Citocromo c</td><td>Sigma-Aldrich, EE. UU.</td><td>C7752</td><td></td></tr><tr><td>DatLab&nbsp;</td><td>Oroboros Instruments, Austria</td><td>Versión 7.4</td><td>Software para adquisición y análisis de datos</td></tr><tr><td>DatLab&nbsp;</td><td>Oroboros Instruments, Austria</td><td>Versión 8.1</td><td>Software para adquisición y análisis</td></tr><tr><td>de datos DC Protein Assay</td><td>Bio-Rad, EE. UU</td>. <td>5000112</td><td>Kit de ensayo de proteínas; PRECAUCIÓN H314 Causa quemaduras graves en la piel y daño ocular</td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>Sigma-Aldrich, EE. UU.</td><td>D5628</td><td>PRECAUCIÓN H301 Tóxico si se ingiere</td></tr><tr><td>Ditiotreitol</td><td>Sigma-Aldrich, EE. UU.</td><td>D 0632</td><td>PRECAUCIÓN H318 Causa daño ocular grave</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Pan Biotech, Alemania</td><td>P04-05551</td><td>Dulbecco' s modificado Eagle' s</td></tr><tr><td>medio DMSO</td><td>Sigma-Aldrich, EE. UU.</td><td>D2650</td><td>dimetilsulfóxido</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Lonza Bioscience, Suiza</td><td>LONBE17-512F</td><td>Dulbecco sin calcio' s solución salina tamponada con fosfato</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich, EE. UU.</td><td>E 4378</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Thermo Fisher Scientific, EE. UU.</td><td>A5256701</td><td>suero fetal bovino</td></tr><tr><td>Glucosa</td><td>Sigma-Aldrich, EE. UU.</td><td> G7528</td><td></td></tr><tr><td>Glutamato</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>G1626</td><td></td></tr><tr><td>Glicerofosfato</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-215789</td><td></td></tr><tr><td>Heraeus Multifuge 3s Large</td><td>Thermo Fisher Scientific, USA</td><td>HM3S</td><td>centrifuge</td></tr><tr><td>Hettich Rotina 380R&nbsp;</td><td>Andreas Hettich GmbH & Co. KG, Alemania</td><td>1701</td><td>centrífuga</td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Honeywell Fluka, Austria</td><td>56750</td><td>PRECAUCIÓN H302 Nocivo en caso de ingestión, H314 Causa quemaduras graves en la piel y daños oculares, H360D Puede dañar al feto</td></tr><tr><td>jamovi&nbsp;</td><td>El proyecto jamovi</td><td>Versión 2.3.13</td><td>software</td></tr><tr><td>K+-MES</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>M 8250</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de leucosep</td><td>Greiner Bio-One GmbH, Austria</td><td>Tubo centrífugo Z642843-300EA</td><td>con barrera de polietileno</td></tr><tr><td>Malate&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>M1000</td><td>PRECAUCIÓN H319 Causa irritación ocular grave.</td></tr><tr><td>Manitol</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>M 4125</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2&nbsp;</td><td>Scharlau, España</td><td>MA 0036</td><td></td></tr><tr><td>MiR05-Kit</td><td>Oroboros Instruments, Austria</td><td>60101-01</td><td>medio de respiración mitocondrial</td></tr><tr><td>Mezclador</td><td>Swelab Instruments, Suecia</td><td>Mesa mecedora</td><td>440S</td></tr><tr><td>Mr. Frosty Freezing Container</td><td>Thermo Fisher Scientific, EE. UU.</td><td>5100-0001</td><td>contenedor de congelación</td></tr><tr><td>Oroboros</td><td>Oroboros Instruments, Austria</td><td></td><td>el NextGen-O2k y el O2k se abordan colectivamente con el término ' Oroboros</td></tr><tr><td>Cámara Oroboros cV</td><td>Oroboros Instruments, Austria</td><td>23100-01</td><td>cámara de volumen clásica</td></tr><tr><td>Cámara Oroboros sV</td><td>Oroboros Instruments, Austria</td><td>33100-01</td><td>cámara de volumen pequeño</td></tr><tr><td>Oroboros TIP2k-Module</td><td>Oroboros Instruments, Austria</td><td>11100-03</td><td>Valoración-Inyección microPump</td></tr><tr><td>O2-Zero Powder</td><td>Oroboros Instruments, Austria</td><td>26600-02</td><td>&nbsp; Na-ditionita PRECAUCIÓN H251 Autocalentamiento: puede incendiarse, H302 Nocivo si se ingiere, H319 Causa irritación ocular grave</td></tr><tr><td>octanoilcarnitina</td><td>Biotrend - APExBIO Technology, Alemania</td><td>B6371</td><td></td></tr><tr><td>Oligomicina</td><td>Sigma-Aldrich, EE. UU.</td><td>O4876</td><td></td></tr><tr><td>Fosfocreatina</td><td>Sigma-Aldrich, EE. UU.</td><td>P 7936</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato</td><td>Sigma-Aldrich, EE. UU</td>. <td>P2256</td><td>PRECAUCIÓN H317 Puede causar una reacción alérgica en la piel</td></tr><tr><td>Rotenone</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>R8875</td><td>PRECAUCIÓN H300 Fatal si se ingiere</td></tr><tr><td>Líneas celulares de fibroblastos de la piel</td><td>&nbsp; ATCC, EE. UU.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Azida sódica</td><td>Sigma-Aldrich, EE. UU.</td><td>S2002</td><td>PRECAUCIÓN H300 + H310 + H330 Mortal en caso de ingestión, contacto con la piel o inhalación</td></tr><tr><td>Subtilisina A</td><td>Sigma-Aldrich, EE. UU.</td><td>P 5380</td><td>PRECAUCIÓN H318 - Causa daño ocular grave, H334 - Puede causar síntomas de alergia o asma o dificultades respiratorias si se inhala</td></tr><tr><td>Succinato</td><td>Sigma-Aldrich, EE. UU.</td><td>S2378</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>S 7903</td><td></td></tr><tr><td>Swelab Alfa contador de células sanguíneas&nbsp;</td><td>Boule Diagnostics AB, Suecia</td><td>1420041</td><td></td></tr><tr><td>Taurina&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, EE. UU.</td><td>T 0625</td><td></td></tr><tr><td>Tecan Infinite TM F200</td><td>Tecan, Suiza</td><td></td><td>espectrofotómetro</td></tr><tr><td>TMPD</td><td>Sigma-Aldrich, EE. UU.</td><td>T3134</td><td>N, N, N', N'-Tetrametil-p-fenilendiamina diclorhidrato PRECAUCIÓN H315 Causa irritación de la piel, H319 Causa irritación ocular grave</td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Sigma-Aldrich, EE. UU.</td><td>T4799</td><td>PRECAUCIÓN H334 Puede causar síntomas de alergia o asma o dificultades respiratorias si se inhala</td></tr><tr><td>Vacuette</td><td>Greiner Bio-One GmbH, Austria</td><td>15452520</td><td></td></tr></tbody></table>

respirometría de alta resolución en una cámara de pequeño volumen

High-Resolution Respirometry in a Small-Volume Chamber

Respirometría de alta resolución en una cámara de pequeño volumen

Investigating respiratory fluxes is decisive for understanding the complex interplay between metabolic processes. Studies of cells and tissues with ...

high-resolution-respirometry-in-a-small-volume-chamber

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

De alta resolución de respirometría se utiliza para determinar el consumo de oxígeno mitocondrial. Se trata de una técnica sencilla para determinar los complejos de la cadena respiratoria mitocondrial '(I-IV) la frecuencia respiratoria, la capacidad del sistema de transporte de electrones mitocondrial máxima, y ​​la integridad de la membrana mitocondrial externa.

-Alta resolución respirometría para evaluar la función mitocondrial en células intactas y permeabilizadas

Aquí, se toma una muestra de músculo cuádriceps de un cerdo anestesiado y se aíslan las mitocondrias por centrifugación diferencial. A continuación, se determinan las frecuencias respiratorias de los complejos de cadenas respiratorias mitocondriales I, II y IV mediante respirometría de alta resolución.

Aislamiento de mitocondrias intactas de músculo esquelético por centrifugación diferencial para Medidas respirometría de alta resolución

El objetivo de este protocolo es medir el efecto de la glucosa mediada por cambios en la respiración mitocondrial en presencia de compuestos naturales en las células beta de la intacta 832/13 mediante respirometría de alta resolución.

Respirometría de alta resolución para medir la función mitocondrial de las células intactas de Beta en presencia de compuestos naturales

Este protocolo describe calorespirometry, la medición directa y simultánea de disipación de calor y la respiración, lo que proporciona un enfoque no invasivo para evaluar el metabolismo energético. Esta técnica se utiliza para evaluar la contribución de las vías aeróbicas y anaeróbicas para utilización de la energía mediante el control del flujo total de energía celular.

Calorespirometry: Es un enfoque potente y no invasivo para investigar el metabolismo energético celular

Este protocolo presenta la construcción y el uso de un aparato de pletismografía simplificada de cuerpo entero para monitorear la progresión de la enfermedad respiratoria bacteriana de forma no invasiva.

Pletismografía de cuerpo entero simplificada para caracterizar la función pulmonar durante la melioidosis respiratoria

La evaluación de la fosforilación oxidativa utilizando respirómetros de alta resolución se ha convertido en una parte integral del análisis funcional de las mitocondrias y el metabolismo energético celular. Aquí, presentamos protocolos para el análisis del metabolismo energético celular utilizando respirómetros de alta resolución basados en cámaras y microplacas y discutimos los beneficios clave de cada dispositivo.

Respirometría de alta resolución para evaluar la bioenergética en células y tejidos utilizando respirómetros basados en cámaras y placas

Este protocolo describe la configuración y el funcionamiento de un sistema de microrrespirometría que puede emplearse para investigar las características fisiológicas del holobionte de coral.

Caracterización fisiológica del holobionte de coral mediante una nueva herramienta de microrrespirometría

El análisis de la función mitocondrial de los espermatozoides mediante respirometría de alta resolución permite medir el consumo de oxígeno de los espermatozoides que se mueven libremente en un sistema de cámara cerrada. La técnica se puede aplicar para medir la respiración en los espermatozoides humanos, lo que proporciona información sobre las características mitocondriales y la integridad de los espermatozoides.

Respirometría de alta resolución para evaluar la función mitocondrial en espermatozoides humanos

Aquí, describimos un método integral para medir la fosforilación oxidativa mitocondrial en fibras de músculo esquelético permeabilizadas frescas a partir de músculo humano o de ratón. Este método permite la cuantificación en tiempo real de la respiración mitocondrial y la evaluación de la preferencia de combustible y la flexibilidad metabólica, al tiempo que preserva las redes mitocondriales existentes y la integridad de la membrana.

Medición de la respiración mitocondrial en fibras musculares esqueléticas humanas y de ratón mediante respirometría de alta resolución

En este artículo de vídeo, se describe un nuevo método que permite la construcción de los gradientes de olor con geometrías estable y controlable. Nos muestra brevemente cómo estos gradientes se pueden utilizar para la detección de defectos olfativos (anosmia total y parcial) y el estudio de las características más sutiles de comportamiento quimiotaxis.

De alta resolución de medición del comportamiento de olor-Driven en larvas de Drosophila

Aprende respirometría de alta resolución en cámaras de 0.5 mL para análisis de función mitocondrial con menor volumen de muestra. Este método validado mejora el diagnóstico de enfermedades mitocondriales y el desarrollo de fármacos.

Respirometría de alta resolución en una cámara de pequeño volumen

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