Respirometría de alta resolución en una cámara de pequeño volumen

En este estudio, queremos investigar si la cámara de pequeño volumen calibrada a 0,5 mililitros se puede utilizar en ensayos respirométricos sin comprometer la precisión obtenida para el volumen clásico de dos mililitros en la plataforma Oroboros.

Nuestro desarrollo de la cámara de pequeño volumen y la evaluación mediante respirometría de alta resolución con un riguroso control de calidad mediante análisis OXPHOS de precisión allanaron el camino hacia desarrollos, nuevas innovaciones, es decir, número uno, un respirómetro O2k de 12 cámaras, número dos, un robot para valoraciones automáticas de sustancias en protocolos complejos aplicados para el análisis OXPHOS. Estas aplicaciones serán cruciales para seguir expandiéndose hacia el análisis mitocondrial, el diagnóstico de enfermedades mitocondriales, la evaluación de los desarrollos de fármacos centrándose tanto en los beneficios de los fármacos para la función mitocondrial como en los efectos fuera del objetivo que interrumpen la función mitocondrial involuntariamente. Cuando mi equipo desarrolló la respirometría de alta resolución hace más de 30 años, había un paradigma de mitocondrias, mitocondrias, mitocondrias. Tal vez había una diferencia entre las mitocondrias musculares y hepáticas, pero eso era todo. Nadie estaba realmente interesado en las mitocondrias fuera de estos paradigmas. Con nuestros protocolos desarrollados para la respirometría de alta resolución, mostramos una gran diversidad de funciones mitocondriales. Eso nos permite evaluar el control respiratorio mitocondrial en diversos tipos de células, tejidos y especies con un nuevo ojo. Hace 30 años, había alrededor de 10 publicaciones que apreciaban esto. Ahora, tenemos con nuestro instrumento más de 1.500 que utilizan estos protocolos.

Se requiere cuatro veces menos muestra en la cámara de pequeño volumen en comparación con la cámara clásica de dos mililitros. En el caso de una muestra con frecuencias respiratorias bajas, se puede utilizar la misma cantidad de muestra para aumentar los flujos de oxígeno específicos del volumen para reducir la incertidumbre de la medición.

El enfoque de nuestro trabajo en el Laboratorio de Investigación y Desarrollo de Oroboros es combinar el desarrollo instrumental y la investigación académica. Evaluamos la función respiratoria mitocondrial y los perfiles biogenéticos con análisis multisensor. Es decir, medir la respiración, los potenciales redox, el potencial de membrana, la absorción de calcio, la producción de peróxido de hidrógeno y varios otros parámetros que nos permiten tener una visión más profunda del perfil biogenético y la función y disfunción mitocondrial.

[Narrador] Para comenzar, monte la cámara de pequeño volumen, o SV, en el Oroboros. Luego encienda el Oroboros y haga clic en Conectar para conectar el Oroboros al software DatLab. Después de secar las cámaras por completo, use una pipeta para agregar 0,54 mililitros de agua a la cámara SV. Luego encienda los agitadores. Antes de cerrar la cámara, humedezca las juntas tóricas de los tapones, manteniendo seco el capilar. Afloje el anillo de calibración de volumen, luego inserte el tapón hacia abajo hasta que el líquido llene el capilar del tapón y se forme un menisco en el receptáculo en el extremo del capilar superior. Apriete el anillo de calibración de volumen para asegurar su posición, asegurando la consistencia del volumen calibrado para inserciones consecutivas. Para empezar, llene las cámaras con el medio respiratorio MiR05 Inicie el software DatLab. Seleccione el protocolo apropiado para la prueba de antecedentes instrumentales. Ajuste la velocidad de rotación de agitación a 550 RPM, el volumen de la cámara a 0,5 mililitros, el intervalo de registro de datos a dos segundos y la temperatura experimental a 37 grados Celsius. Ejecute la prueba del agitador y la calibración del aire. Establezca la marca R1 en el gráfico de concentración de oxígeno moviendo el cursor mientras mantiene presionada la tecla Mayús. Ocasionalmente, realice calibraciones de oxígeno cero. Durante la calibración del aire, prepare una solución madre de ditionito de sodio fresca disolviendo el polvo de O2-Zero en tampón de fosfato de 50 milimolares a una concentración de 2,5 milimolares para el SV. Después de completar la calibración del aire, cierre la cámara. Controle la señal de oxígeno durante aproximadamente 60 a 120 minutos, permitiendo que la concentración de oxígeno disminuya desde la saturación del aire hasta alrededor de 150 micromolares. Establezca cuatro marcas etiquetadas como J01 a J04 en el gráfico negativo de pendiente de oxígeno. Opcionalmente, con una jeringa Hamilton, titule la solución de ditionito de sodio para ajustar la concentración de oxígeno a 100 micromolares y ajuste la marca J05. Para calcular la pendiente de fondo de oxígeno instrumental en DatLab, seleccione Pendiente de flujo. A continuación, abra la ventana de corrección de fondo de oxígeno y seleccione Archivo activo como fuente de los datos de fondo de oxígeno. Compruebe que todas las marcas J0 se utilizan para el cálculo de la regresión lineal. Luego haga clic en Aplicar para la corrección de fondo de oxígeno. Para comenzar, lave las cámaras de Oroboros con agua desionizada y agregue medio MiR05 fresco en la cámara. Después de la prueba de antecedentes instrumental, abra una nueva pestaña de DatLab y seleccione el protocolo SUIT-003 para experimentos de plaquetas humanas. Con la descripción general del protocolo DatLab que aparece en la barra lateral Protocolo, seleccione las soluciones de stock de productos químicos. Luego seleccione las jeringas Hamilton de acuerdo con los productos químicos. Coloque las jeringas en la gradilla de jeringas con etiquetas en secuencia de acuerdo con el protocolo SUIT. Para el reemplazo parcial del volumen, calcule el volumen V en equivalente al volumen V eliminado del volumen real en la cámara abierta, teniendo en cuenta el volumen muerto capilar. A continuación, retire el tapón completamente insertado y colóquelo en la rejilla. Retire el volumen V calculado de MiR05 de la cámara en función del tipo de celda y la concentración de la suspensión de celda madre. Ahora, pipetee un volumen equivalente de la suspensión de células madre con una concentración celular conocida en la cámara. Por el contrario, para un reemplazo completo del volumen, extrae todo el medio de la cámara. Agregue 0,54 mililitros de las existencias de mitocondrias cardíacas aisladas a la cámara SV. Cierre la cámara y sifone cualquier exceso de solución de muestra del receptáculo del tapón. Para iniciar un protocolo de valoración de inhibidores de desacopladores de sustrato, o SUIT, abra la ventana Evento en DatLab para visualizar los volúmenes de valoración. Con la microjeringa Hamilton, valore las soluciones químicas madre en la cámara. A continuación, establezca el evento en DatLab. Permita la estabilización del flujo después de la valoración. Para el análisis de datos, establezca una marca en la parte representativa y estable del gráfico. El flujo de oxígeno de fondo en la saturación del aire fue 3,9 veces mayor en la cámara de 0,5 mililitros en comparación con la cámara de 2,0 mililitros, lo que coincide con la diferencia teóricamente esperada de cuatro veces en el flujo de oxígeno de fondo específico del volumen. La variabilidad de los flujos de fondo instrumental fue casi idéntica en los dos volúmenes de cámara. Las frecuencias respiratorias de plaquetas vivas, fibroblastos permeabilizados y mitocondrias aisladas se correlacionaron estrechamente en ambos tipos de cámara cuando se aplicó la corrección de fondo adecuada. El flujo de oxígeno se estabilizó más rápido en la cámara de dos mililitros que en la cámara de 0,5 mililitros después de la reoxigenación. El consumo de oxígeno residual después de la inhibición del Complejo III fue consistente entre las dos cámaras, alineándose con el límite de detección instrumental.