Técnicas de patch-clamp para el análisis de vesículas endolisosomales únicas

Los compartimentos endolisosomales son los orgánulos más pequeños de las células. Las técnicas electrofisiológicas tradicionales no pueden medir directamente sus cambios de voltaje y corriente. La técnica de patch-clamp endolisosoma permite registros directos, lo que nos permite estudiar previamente en los canales iónicos.

El principal desafío experimental es que no todos los compuestos agrandan eficazmente los lisosomas. La identificación de las células adecuadas es difícil, e incluso con los lisosomas ideales, el registro exitoso de los canales iónicos no está garantizado. Desarrollamos la técnica de pinzamiento de parche endolisosoma para permitir registros electrofisiológicos directos de las membranas endolisosomales.

Este avance nos permitió caracterizar los canales iónicos, como los TRPML y los TPC, revelando su papel en la defensa de patógenos, la degeneración neuronal y los trastornos metabólicos. Nuestro método permite el registro directo de canales iónicos lisosomales, superando las limitaciones de tamaño de la pinza de parche de célula completa y mejorando la selección de vesículas al tiempo que integra técnicas basadas en fluorescencia. Para comenzar, instale el tubo capilar en el polar.

Presione el botón verde en el teclado. Afloje la perilla de apriete y retire las pipetas extraídas del polar. A continuación, coloque las pipetas de parche extraído en el soporte Microforge.

Inspeccione las puntas de pipeta con una lente de objetivo de 35x, combinada con un ocular de 15x para un aumento total de 525x. Utilice el micromanipulador para acercar las pipetas de parche al filamento. Coloque el dial de temperatura en 80.

Una vez que se encienda el calentador, mantenga presionado el interruptor de pie durante uno o dos segundos para aplicar un breve pulso de calor. Después de pulir, coloque las pipetas pulidas en una caja sellada para evitar la contaminación por polvo. Agregue un mililitro de la solución de baño a la cámara.

Retire un cubreobjetos con células HEK 293 tratadas de la placa de 24 pocillos. Transfiera el cubreobjetos a la cámara del microscopio. Utilice una aguja de relleno de plástico casera para llenar la pipeta de aislamiento con solución de pipeta.

Instale la pipeta llena en el extremo delantero de la configuración de la abrazadera de parche. Bajo un microscopio con un objetivo de 40x y un ocular de 10x, acerque la pipeta de aislamiento a endosomas o lisosomas suficientemente agrandados. Baje la pipeta de aislamiento con el micromanipulador hasta que toque el borde de la membrana plasmática.

Mueva rápidamente la pipeta para arrancar un pequeño trozo de la membrana. Con la misma pipeta, presione la célula desde el lado opuesto para exprimir los endosomas/lisosomas aproximadamente a dos micrómetros de la célula. Llene una pipeta de parche recién pulida con la solución de pipeta adecuada.

Instale la pipeta en el extremo frontal del amplificador. Aplique una presión positiva de 20 a 50 milibar a la pipeta y manténgala bloqueando la válvula. A continuación, mueva la punta de la pipeta dentro de la solución de baño y colóquela en el centro del campo de visión.

Aplique pulsos de corriente repetidos para determinar la resistencia de la pipeta, la resistencia del sello y la resistencia en serie. Controle el tamaño de la punta de la pipeta, la formación de sellos y el establecimiento de toda la configuración endolisosomal. Mueva rápidamente la pipeta cerca de la parte superior de la vesícula objetivo.

Observe cómo la vesícula se mueve o rueda debido al flujo de líquido de la pipeta. Ajuste el voltaje de compensación de la pipeta a cero milivoltios. Libere inmediatamente la presión positiva para atraer la vesícula hacia la pipeta, formando un gigaseal en un segundo.

Para el registro de vesículas completas, utilice un pulso corto de alto voltaje de dos a cinco milisegundos para interrumpir la membrana en el punto de contacto entre la pipeta y el orgánulo. Ajuste el voltaje de 500 a 1000 milivoltios. Para registrar la corriente, realice experimentos de pinza de voltaje endolisosomal utilizando una amplia gama de voltajes de entrada para evaluar las propiedades de la membrana.

Durante la formación de gigasellos, la respuesta de corriente disminuyó rápidamente, lo que indica el establecimiento exitoso del modo unido al lisosoma. La aplicación repetida de voltaje de entrada continuo registró corrientes a través de la membrana endolisosomal, mostrando corrientes basales, activadas por agonistas y de fuga.