Detección de infección por Helicobacter pylori y resistencia a antibióticos mediante análisis cuantitativo de la reacción en cadena de la polimerasa en heces

Este estudio demuestra una prueba fecal basada en qPCR para detectar la infección por Helicobacter pylori y la resistencia a los antibióticos, lo que permite un tratamiento personalizado y mejora la tasa de erradicación de H. pylori a nivel poblacional.

Las muestras fecales combinadas con la PCR cuantitativa permitieron la detección tardía de infecciones por helicobacter pylori y resistencia a los antibióticos sin cultivo bacteriano, lo que redujo el diagnóstico realizado de tres semanas a un día.

[Narrador] Para comenzar, invierta el tubo de preservación de muestras y mezcle bien. Luego transfiera un mililitro de la solución de muestra fecal a un tubo de microcentrífuga. Mezclar los tubos de centrífuga por inversión. Coloque los tubos en un baño de metal a 80 grados centígrados durante 10 minutos y mezcle intermitentemente durante 30 segundos al quinto minuto. Después de enfriar los tubos a temperatura ambiente, centrifugarlos a 10.000 G durante cinco minutos. Recoja el sobrenadante para su posterior procesamiento. Tome una placa de 96 pocillos que contenga tampón de lisis e inviértala varias veces para volver a suspender las perlas magnéticas. Retire con cuidado el sello de papel de aluminio sin agitar la placa para evitar derrames. Agregue 200 microlitros de la muestra preparada en cada pocillo de la placa de 96 pocillos, asegurándose de que cada pocillo corresponda a una sola muestra. Coloque la placa de 96 pocillos en el compartimento de muestras designado del instrumento de extracción de ácidos nucleicos para la extracción automatizada. Almacene las muestras restantes y las muestras de ácido nucleico extraídas a menos 20 grados Celsius para su conservación a largo plazo y uso futuro. Centrifugar el tubo que contiene el reactivo liofilizado para asegurarse de que el polvo liofilizado se asiente en el fondo de los tubos. Abra la tapa del tubo de reactivo con cuidado para evitar derramar el polvo. Agregue 25 microlitros de los ácidos nucleicos extraídos de las muestras a analizar. Control positivo y control negativo a cada pozo. Cierre bien los tubos. Agite los reactivos de qPCR durante ocho a 10 segundos. Luego centrifugarlos brevemente durante tres a cinco segundos para evitar la formación de burbujas. Coloque la placa de qPCR de 96 pocillos en la máquina de qPCR. Configure el programa de ciclismo como se muestra en la pantalla. Luego configure los parámetros de detección de fluorescencia como se muestra. Después de guardar los datos, analícelos utilizando un software específico de qPCR, ya que el instrumento selecciona automáticamente el umbral de referencia. Establezca todos los criterios diagnósticos, incluida la presencia de infección por Helicobacter pylori o la resistencia a un valor de TC menor o igual a 30. Confirme que exhiben una curva característica en forma de S. Los resultados del control de calidad de qPCR de controles negativos y positivos se muestran en esta figura. Los resultados confirmaron que no había amplificación en los controles negativos y que las curvas de amplificación estaban claras en todos los canales de detección en los controles positivos, lo que validaba la fiabilidad del ensayo. Esta imagen muestra las curvas de amplificación de cinco muestras fecales analizadas por qPCR para detectar la infección por Helicobacter pylori y su resistencia a la claritromicina y las quinolonas utilizando sondas fluorescentes codificadas por colores. La muestra S1 no mostró amplificación significativa en ningún canal de detección, lo que confirma la ausencia de infección por Helicobacter pylori. La muestra S2 mostró amplificación solo en el canal ROX, lo que indica la presencia de Helicobacter pylori sin resistencia a antibióticos. La muestra S3 mostró amplificación en los canales ROX y HEX, pero no en FAM, lo que indica resistencia a quinolonas. La muestra S4 mostró amplificación en los canales ROX y FAM, pero no en HEX, lo que indica resistencia a la claritromicina. La muestra S5 mostró amplificación en los tres canales, lo que indica una doble resistencia a la claritromicina y las quinolonas.