Aislamiento y caracterización de neutrófilos de densidad baja y normal a partir de sangre total

Nuestra investigación tiene como objetivo comprender el papel de los subgrupos de neutrófilos y cómo contribuyen a la patogénesis de enfermedades inflamatorias como el lupus. En un sentido más amplio, nuestro trabajo también demuestra la heterogeneidad de las poblaciones de neutrófilos en la biología humana y cómo esto puede cambiar en función de los diferentes estados fisiológicos. La investigación emergente muestra que las poblaciones de neutrófilos en los seres humanos son heterogéneas.

Sin embargo, los neutrófilos continúan siendo estudiados como una sola población debido a la dificultad de aislar subtipos de manera confiable sin activación y en cantidad suficiente. Nuestro protocolo proporciona un método para el aislamiento intacto y la caracterización básica de subtipos de neutrófilos, superando estos problemas. Investigaciones recientes, aunque limitadas, han demostrado que los subtipos de neutrófilos, como los neutrófilos de baja densidad, desempeñan un papel en estados fisiológicos alterados como el embarazo y la inflamación, así como en enfermedades como la tuberculosis, la autoinmunidad y el cáncer.

Nuestro protocolo permitirá una investigación robusta y reproducible sobre las contribuciones de estas células a la salud y la enfermedad humanas. Ahora que tenemos un protocolo robusto probado para separar los neutrófilos de baja densidad de los neutrófilos de densidad normal, nos estamos enfocando en responder preguntas básicas relacionadas con cómo estos neutrófilos de baja densidad se presentan en condiciones inflamatorias. Estamos especialmente interesados en cómo se diferencian de los neutrófilos de densidad normal en su número de células, inmunofenotipo, inmunometabolismo y más.

Para comenzar, etiquete cuatro tubos cónicos de 50 mililitros para soluciones de trabajo isotónicas de 100%81%70%y 55%Agregue 27 mililitros de medio de gradiente de densidad al primer tubo etiquetado como 100%Agregue 3 mililitros de PBS 10X. A continuación, mida los volúmenes requeridos de soluciones isotónicas 100% de trabajo y 1X PBS para cada concentración de las soluciones de trabajo. Añádalo a los tubos cónicos respectivos.

Utilice una pipeta Pasteur para mezclar bien y obtener homogeneidad. Ahora coloque con cuidado 3 mililitros de la solución isotónica de trabajo al 81% en el fondo de un tubo cónico de 15 mililitros. A continuación, coloque lenta y suavemente 3 mililitros de la solución isotónica de trabajo al 70% encima, asegurándose de que las capas no se mezclen.

Para preparar el tampón de separación celular, combine 2% de suero bovino fetal, 1 milimol de EDTA y PBS hasta obtener un volumen total de 500 mililitros. Pipetear para mezclar bien y obtener uniformidad. Agite las perlas magnéticas a fondo durante 30 segundos para asegurarse de que se resuspendan por completo antes de usarlas.

Para cada donante, alícuota 4 mililitros de sangre entera en tres tubos inferiores redondos separados de 14 mililitros. Pipetee 200 microlitros de cóctel de aislamiento de neutrófilos y 200 microlitros de perlas magnéticas en cada tubo. Pipetear suavemente la solución para volver a suspender la mezcla antes de la incubación para permitir que los reactivos se unan a las células no deseadas.

A continuación, agregue el tampón de separación celular a cada tubo para aumentar el volumen a 12 mililitros y mezcle bien. Coloque los tubos sin tapa en una rejilla magnética e incube. Ahora use una pipeta serológica para transferir cuidadosamente la suspensión de células claras que contiene neutrófilos de cada tubo a un nuevo tubo limpio.

A continuación, retire el tubo original del imán. Vuelve a agitar las cuentas magnéticas durante 30 segundos. Agregue 200 microlitros de las perlas magnéticas a la suspensión celular recién transferida antes de la resuspensión y la incubación, como se demostró anteriormente.

Vuelva a colocar los tubos en el imán sin tapas. Después de una incubación de 10 minutos a temperatura ambiente, transfiera la suspensión de células claras que contiene neutrófilos aislados a un nuevo tubo. Tire de las suspensiones aisladas de neutrófilos obtenidas de la sangre entera en un solo tubo de 50 mililitros.

Rellene el tubo hasta un volumen total de 50 mililitros utilizando el tampón de separación de células. Centrifugar con el freno puesto, luego desechar el sobrenadante y volver a suspender la pastilla de neutrófilos en 1 mililitro de tampón de separación celular. Después de centrifugar nuevamente la suspensión, deseche el sobrenadante y vuelva a suspender la bolita de neutrófilos en 3 mililitros del medio de gradiente de densidad del 55%.

Coloque lentamente los 3 mililitros de medio de gradiente de densidad del 55% que contiene la suspensión celular en los tubos de gradiente de densidad prefabricados, evitando la perturbación del gradiente. Centrifugar los tubos a 720 G durante 30 minutos sin utilizar el descanso. Después de la centrifugación, manipule los tubos con cuidado para evitar alterar las capas.

Con una pipeta de transferencia, aísle cuidadosamente las capas separadas que contienen neutrófilos de densidad baja y normal y transfiéralas a tubos de 15 mililitros marcados por separado. Para lavar cualquier medio de gradiente de densidad residual, agregue PBS a cada tubo de 15 mililitros hasta la marca de 15 mililitros. A continuación, centrifugar a 400 G durante 5 minutos a temperatura ambiente con el freno puesto.

Cuente las células de cada fracción en un hemocitómetro antes de seguir experimentando. La estratificación de neutrófilos totales sobre el medio de gradiente de densidad dio como resultado la formación exitosa de dos bandas distintas. Con los neutrófilos de baja densidad formando una banda superior y los neutrófilos de densidad normal formando una banda inferior.

La sobrecarga del medio de gradiente de densidad con neutrófilos por encima de 5-6 millones de células por mililitro hizo que las bandas parecieran difusas, lo que aumentó el riesgo de mezcla de subtipos. La pureza media del aislamiento fue del 93,8% para los neutrófilos de baja densidad y del 96,3% para los neutrófilos de densidad normal con una contaminación mínima de otros tipos de células.