Name: Aislamiento y caracterización de micropartículas de neutrófilos derivado de estudios funcionales (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
Description: Aprenda a aislar y caracterizar micropartículas derivadas de neutrófilos humanos y murinos usando ultracentrifugación y citometría de flujo. Este protocolo rápido permite analizar su composición fenotípica en estudios funcionales.

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Estamos agradecidos por la asistencia técnica de Dr. Suchitra Swaminathan que dirige el núcleo de Northwestern Feinberg escuela de medicina citometría de flujo. La financiación fue proporcionada por DK101675 (NIH).

Todos los trabajos de animales fue aprobado por el IACUC noroeste. Todos los experimentos fueron terminados en conformidad y cumplimiento con todas las directrices pertinentes del reguladoras e institucionales. Para donar sangre los sujetos humanos, consentimiento informado fue presentado y firmado; Además, todos los seres humanos en este estudio fueron tratados con arreglo a las directrices institucionales y federales para el bienestar humano.
Nota: Los pasos del Protocolo se enumeran en los apartados siguientes: (i) aislamiento de células de la médula ósea de ratón; (ii) aislamiento de PMN de la médula ósea murina; (iii) aislamiento de PMN de la sangre humana; (iv) MP aislamiento de PMN sobrenadantes (por ultracentrifugación); v caracterización de MPs por Western Blotting; (vi) caracterización de MPs por citometría de flujo; (viii) aplicación de diputados aislados a estudio de la herida curativo
1. aislamiento de células de médula ósea de ratón
<ol style="margin-left: 40px;"><li>
Disección del fémur y la tibia de las patas traseras del ratón
	<ol>
<li>Preparar una caja de eutanasia (p. ej., una caja de punta de vacío 1 mL) para la inhalación de la anestesia. Añadir unas gotas de 100% de isoflurano en un paño estéril con cinta en el interior de la tapa de una caja de plástico. Según las nuevas directrices IACUC, animales no debe venir en contacto directo con isoflurano, así lugar un sostenedor de la extremidad entre el ratón y la gasa con el isoflurano. Nota: Isoflurano es un anestésico por inhalación de gran alcance y debe ser manejado con prudencia dentro de una campana de humos.</li>
		<li>Eutanasia a ratones según recomendación de IACUC. Coloca un ratón dentro de la caja de la eutanasia que se describe en el paso 1.1.1 para 1 – 5 min hasta que ha dejado de respirar. Asegúrese de que la muerte del animal mediante la realización de una luxación cervical.</li>
		<li>Levantar la piel abdominal usando el acero inoxidable, 12 cm, curvada, pinzas de 0,17 mm X 0,1 mm y cortar la piel a medio camino entre las extremidades superiores e inferiores. Pelar la piel de aquí a la sección más distal del cuerpo del ratón, incluyendo las extremidades inferiores. Con 10 cm de largo, tijeras de disección recta, quitar los músculos de las piernas traseras y dislocar la articulación de la cadera dejando intacta la cabeza del fémur.</li>
		<li>Utilice tijeras para disecar los músculos del fémur y la tibia y separar el fémur a la tibia. Asegúrese de que los extremos de los huesos permanecen intactos, ya que contienen cantidades significativas de médula ósea.</li>
		<li>Quitar toda la carne restante haciendo rodar los huesos dentro de una toalla de papel. Coloque los huesos limpios en un plato Petri conteniendo medio sin suero (MFS, es decir, medio modificado Eagle de Dulbecco (DMEM) sin suero ni antibióticos).</li>
		<li>Lave los huesos en etanol al 70% y luego en SFM.</li>
		<li>Preparar 50 mL de la OFS en un tubo cónico de 50 mL. Carga 10 mL de la OFS en una jeringa de 10 mL y fíjelo a una aguja de calibre 25 y 5/8 de pulgada.</li>
		<li>Corte el extremo de los huesos con tijeras hasta que aparezca una abertura a la médula ósea (color rojizo).</li>
		<li>Enjuague las células de médula ósea en un nuevo tubo de 50 mL. Utilice una jeringa de 10 mL con una aguja de calibre 26 y 5/8 de pulgada con aproximadamente 3 mL, hueso de la OFS. Terminado el lavado, suspender las células en el tubo mediante pipeteo (puntas de plástico desechables 1 mL uso) para romper los agregados de la célula.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. PMN aislamiento de médula ósea murina
<ol><li>
Lisis de eritrocitos
	<ol>
<li>De la pelotilla de la médula ósea recogida por centrifugación a 350 x g por 8 min a 4 ° C.</li>
		<li>Resuspender el precipitado de células en 20 mL de 0.2% NaCl para aproximadamente 20-30 s para lisar la fracción de eritrocitos. No exceder 30 s ya que esto dará lugar a la lisis de los PMN. Añadir 20 mL de 1.6% NaCl para restaurar la osmolalidad. Nota: Este paso puede llevar a muy poca activación de PMN.</li>
		<li>Lavar las células con 2 mL de PBS y centrifugue como en el paso 2.1.1 anterior. Eliminar el sobrenadante.</li>
		<li>Proceder a PMNs aíslan por centrifugación de gradiente de densidad.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Aislamiento de los neutrófilos por centrifugación de gradiente de densidad
	<ol>
<li>Caliente polysucrose y sodio Diatrizoato soluciones, con densidades de 1,119 g/mL y 1,077 g/mL (véase Tabla de materiales), a temperatura ambiente (RT) antes de su uso.</li>
		<li>Preparar polysucrose y sodio Diatrizoato gradientes frescos, inmediatamente antes de la aplicación de células de médula ósea por capas lentamente 3 mL de la solución de densidad de 1,077 g/mL más 3 mL de la solución de densidad de 1,119 g/mL en tubos cónicos de 15 mL. Nota: Preparación de la solución gradiente demasiado adelantado resultará en la mezcla de las capas y pobre pureza neutrófilo y recuperación.</li>
		<li>Resuspender el precipitado de células de médula ósea en 1 mL de PBS helado y recubrimiento la suspensión resultante encima de la polysucrose y sodio Diatrizoato gradiente (lentamente, para evitar la mezcla de las capas).</li>
		<li>Centrifugar por 30 min a x 850 g a 25 ° C a temperatura ambiente, sin freno. Mantener los reactivos a temperatura ambiente para la separación eficaz de los neutrófilos de otras células presentes en la médula ósea. Establecer la centrifugadora en deceleración lenta para permitir que el degradado eficientemente ser formado y mantenido después del paso de centrifugación.</li>
		<li>Localizar visualmente una capa de células mononucleares en el interfaz de PBS y 1,077 g/mL densidad solución (capa superior). Retirar esta capa y el resto de la solución de densidad sin molestar a la banda PMN.</li>
		<li>Recoger una capa entera de PMN y algunos de los polysucrose subyacente y sodio Diatrizoato 1,119 g/mL de solución en tubos de 15 mL con una pipeta de transferencia. Nota: La pureza de los PMNs aislados dependerá en un retiro completo de la capa superior.</li>
		<li>Cubra los tubos con filtrado PBS (filtrado a través de un filtro de tamaño de poro de 0.1 μm) y centrifugar a 300 x g durante 5 minutos, a 4 ° C.</li>
		<li>Lave los alimentos peletizados PMNs con 2 mL de PBS, usando condiciones de centrifugación como en el paso 2.2.7.</li>
		<li>Resuspender en 1 mL de PBS filtrada y contar los PMNs aislados por hemocitómetro. Nota: Para este método de aislamiento, la pureza PMN resultante asciende a ~ 85-90%, según se evaluó por citometría de flujo. Los restantes contaminantes fracciones consisten principalmente de linfocitos mononucleares.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Estimulación de PMN al inducir liberación de MP Nota: PMNs pueden ser estimuladas para liberar MPs con diversas condiciones de activación, incluyendo N-formyl-l-methionyl-leucyl-l-phenylalanine (fMLF) y forbol 12-miristato-13-acetato (PMA), interferón gamma (IFNγ). Lo importante, antes de la simulación, PMNs deben mantenerse en hielo en todo momento.<ol>
<li>PMNs de pellet (300 x g, 5 min, 4 ° C) y resuspender en 0.1 μm filtran sal balanceada (HBSS) solución de Hank, que contiene al agente estimulante de elección. Para la estimulación óptima, utilizar solución de estimulación de 100 μl por PMNs 10 millones para 20-30 min a 37 ° C en tubos de 15 mL. Nota: Las siguientes concentraciones de activadores se utilizaron con éxito en nuestro trabajo anterior: fMLF (0.5-1 μm 2-5 μm de PMNs de ratón y humanos), PMA (200 nM) y el IFNγ (100 ng/mL). Si se desea la liberación de diputados previamente etiquetados, incubar PMNs sin estimular (1-5 x 106) con N-(2-aminoethyl) maleimida-FITC (véase Tabla de materiales) (1 μm 100 μl HBSS, 15 min, 37 º C). Proceder con pasos 2.3.1-2.3.3.</li>
		<li>Desactivación a 850 x g durante 5 min a 4 ° C, quitar PMNs y transferir sobrenadantes libres de células a nuevos tubos de microcentrífuga de 1,5 mL.</li>
		<li>Para el aislamiento de MP de sobrenadantes libres de células, continúe con el paso 4.2.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. aislamiento PMN de sangre humana
<ol><li>
Reclutar a voluntarios sanos para la extracción de sangre según las pautas de la IRB institucional.
	<ol>
<li>Recoger la sangre del antebrazo de un voluntario sano en tubos que contenían citrato de sodio 5 mL disponibles comercialmente (véase Tabla de materiales).</li>
		<li>Pipetear 5 mL de solución de dextrano y sodio Diatrizoato (densidad de 1,113 g/mL, ver Tabla de materiales) en tubos de 15 mL estéril y poco a poco la capa 5 mL de sangre periférica humana recién aislada en la parte superior.</li>
		<li>Centrifugar los tubos durante 50 min a 400 x g a temperatura ambiente (25 ° C) con una aceleración baja y sin freno.</li>
		<li>Al final de la centrifugación, eliminar el plasma y las células mononucleares (capa superior) con una pipeta de succión de plástico estéril.</li>
		<li>Transferir la capa inferior (PMNs) en un nuevo tubo cónico estéril 50 mL.</li>
		<li>Añadir un volumen igual de 0,45% NaCl a PMNs (mezclar bien y suavemente girando el tubo).</li>
		<li>Centrifugar 10 min a 400 x g a 25 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Lisis de eritrocitos
	<ol>
<li>Añadir 10 mL de agua helada y estéril a las células de alimentos peletizadas para 45 s seguido de 10 mL de helado estéril 1,8% NaCl para restaurar la osmolalidad. Nota: Los siguientes pasos para el aislamiento de PMN deben realizarse en hielo para evitar la activación de PMN y liberación prematura de MP. El paso de lisis se produce activación de PMN menor aunque no significativa, sin embargo, es esencial para aislar una población de PMN pura para ensayos funcionales.</li>
		<li>Centrifugar las células durante 10 min a 250 x g a 4 ° C con la suave desaceleración.</li>
		<li>Repita los pasos 3.2.1 y 3.2.2.</li>
		<li>Resuspender PMNs en 5 mL de helado HBSS sin calcio ni magnesio. Cuenta total células vivas (utilizar un hemocitómetro y viabilidad de tinción en dilución 1:2, véase Tabla de materiales) antes de la estimulación. Nota: PMNs aislados deben usarse para estimulación u otros experimentos dentro de 2 h de aislamiento para evitar cambios funcionales y celulares y muerte celular.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. MP aislamiento de PMN activados sobrenadantes
Nota: Un protocolo similar se utiliza para el aislamiento de MPs de PMNs humanos y murinos.
<ol><li>PMNs de pellet (300 x g, 5 min, 4 ° C) y resuspender en 0.1 μm filtraron solución HBSS, que contiene el agente estimulante de elección (por ejemplo 1 μm fMLF, ver Nota: 2.3.1). Para la óptima estimulación use solución de estimulación de 100 μl por PMNs 10 millones para 20-30 min a 37 ° C en tubos de 15 mL.</li>
	<li>Después del estímulo, girar por PMN activado a 600 x g durante 5 min a 4 ° C y transferir sobrenadantes libres de células a nuevos tubos de microcentrífuga de 1,5 mL.</li>
	<li>Centrifugar el sobrenadante despejó de PMN en 13.000 x g, 10 min, 4 ° C para eliminar restos celulares y transferir el sobrenadante despejado en un nuevo tubo de ultracentrífuga.</li>
	<li>Centrifugar por 1 h a 100.000 x g, a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante antes de su almacenamiento de MP. Según sea necesario, tienda peleteado MPs en parafina sellado tubos ultracentrífuga a-80 ° C hasta su uso en experimentos.</li>
</ol>5. examen de PMN-MPs por Western Blot
<ol><li>Añadir el tampón de SDS 1% (50-200 μL con 100 mM de Tris de pH: 7.4) a diputados de la pelotilla (del paso 4.4), transferencia a nuevos tubos de microcentrífuga de 1,5 mL y hervir los diputados sometidas a lisis por 5 min. Nota: El número de diputados y el volumen de buffer de lisis debe ser ajustado y optimizado para cada proteína de interés.</li>
	<li>
Cantidades iguales de PMN-MPs por carril en la carga de búfer que contiene β-mercapto-etanol al 10% de la carga. Nota: Con nuestro método cargamos MPs que fueron aisladas del mismo número de PMNs estimulados.<ol>
<li>Separar los lisados por SDS-PAGE en gel de poliacrilamida al 10% (usar 50-100 V por 1-1.5 h) y la transferencia de proteínas totales sobre membranas de nitrocelulosa como descrito9.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bloque de membranas de 1 h con leche descremada de 5% en solución salina tamponada con Tris de Tween 20 0,05% e incubar con un primario adecuado (durante la noche a 4 ° C), seguido de secundarios anticuerpos conjugado con HRP.</li>
	<li>Visualizar las bandas agregando solución de quimioluminescencia de la membrana y la exposición a una película de rayos x dentro de una cinta resistente a la luz (1-24 h).</li>
</ol>6. examen de PMN-MPs por citometría de flujo
<ol><li>
Para la tinción de anticuerpo, diluido anticuerpos apropiadamente en tampón FACS (PBS con 0,1 mM de EDTA, 0.1% de azida sódica). Resuspender peleteado PMN-MPs (derivado de 1-3 x 106 PMNs/condición) en la solución de anticuerpo de 100 μl.
	<ol>
<li>Si la coloración de anexina V, resuspender pildoradas PMN-MPs en tampón de anexina V, que contiene 5 μl de conjugado FITC anexina V. Si Co coloración con los anticuerpos, agregar los anticuerpos deseados (para un ejemplo véase Tabla de materiales) directamente a la solución de anexina V. Agregar colorante de lípidos fluorescentes, N-(2-aminoethyl) maleimida (véase Tabla de materiales), en concentración de 1 μm en 100 μl de tampón FACS para etiquetar e identificar los MPs.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incubar el MPs en la coloración de la solución por al menos 20 min a 4 ° C.</li>
	<li>Lavar el MPs por ultracentrifugación (1 h a 100.000 x g, a 4 ° C); Deseche el sobrenadante.</li>
	<li>Resuspender en tampón FACS y ejecutar los ejemplos en un citómetro de flujo designado equipado con una unidad electrónica mejorada para una mayor sensibilidad (véase Tabla de materiales).</li>
</ol>7. aplicaciones para PMN aislados-MPs estudiar la función PMN en la cicatrización de heridas
<ol><li>
In vivo la administración de PMN-MPs a las heridas de colon
	<ol>
<li>Anestesiar ratones por una inyección intraperitoneal de una mezcla de ketamina (100 mg/kg) y xilacina (5 mg/kg). Anestesia para confirmar reflejo pedal (pellizco firme del dedo del pie) y ajustar según sea necesario.</li>
		<li>Coloque el ratón sobre su estómago y usando fórceps de la biopsia de 28 cm y un endoscopio equipado con una cámara de alta resolución (como un endoscopio veterinario para uso animal pequeño, véase Tabla de materiales), generan heridas superficiales 3-5 en la parte dorsal de la colon. Al terminar de herir, ratones vuelta a una jaula colocan en un tapete de control de temperatura (37 ° C) hasta que se recuperó.</li>
		<li>Anestesiar ratones (como en el paso 7.1.1). Utilizar un endoscopio para adquirir imágenes de heridas infligidas a 24 h (día 1) poste-herir. Que ratones recuperar como en el paso 7.1.2.</li>
		<li>Al mismo tiempo (24 h después herir), administrar murinos PMN-MPs derivadas de 2 x 106 PMNs en 100 μl de HBSS + directamente en cada sitio de la herida mediante una microinyección basada en colonoscopia sistema (uso una aguja 29 G)9. Tres días más tarde (día 4 posterior hiriendo) anestesiar ratones (como en el paso 7.1.1) y utiliza un endoscopio para adquirir imágenes de curación de heridas. Que ratones recuperar como en el paso 7.1.2.</li>
		<li>Utilizando el software de análisis de imagen recomendado: (véase Tabla de materiales), regiones de contorno visible herida en imágenes adquiridas, medir el área de la misma herida en los días 1 y 4 la herida y calcular el porcentaje de cierre de la herida.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Las células de epiteliales humanos en vitro la cicatrización de heridas
	<ol>
<li>Cuenta de Caco-2 BBe o T84, células epiteliales intestinales humanas por hemocitómetro y semillas 5 x 105 células/pozo en placas de 24 pocillos cultura. Incubar las células en una cámara estándar de incubación a 37 ° C y 5% CO2. Caco-2 BBe o T84 alcanzan confluencia dentro de 48 h9. A las células epiteliales de la cultura, DMEM y DMEM-F12 (50: 50) con los suplementos anteriormente descrito9.</li>
		<li>Generar heridas de rasguño mecánicas en la monocapa utilizando una pipeta y baja succión como describió anteriormente4,9. Adquisición de imágenes de las áreas de la herida inmediatamente después de rasguño usando un microscopio de interferencia diferencial de contraste de fase invertida (objetivos de uso 5 X o 10 X), para ser utilizado como un tiempo = punto de referencia 0.</li>
		<li>Añadir MPs (derivados de 2-4 X 106 PMNs) a monocapas de células epiteliales rasguñado herido e incubar durante un adicional 24 h (48 h después hiriendo, a 37 ° C con 5% CO2). En este momento volver a adquirir imágenes de las heridas de rasguño.</li>
		<li>Utilizar software de análisis de imagen recomendado: (véase Tabla de materiales) para medir áreas de la herida en t = 0 y t = 48 h. calcular el porcentaje de cierre de la herida mediante la determinación de la diferencia en el área de la herida en los puntos de tiempo seleccionado.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen ningún conflicto de interés de cualquier tipo relacionadas con esta comunicación

Protocolos para el aislamiento y caracterización de derivados de PMN MPs se describen en la presente comunicación. Varios puntos críticos claves deben tenerse en cuenta para el éxito del procedimiento. En primer lugar, PMNs deben aislados fresco y utilizadas en experimentos de dentro de 2 h de aislamiento para evitar la degranulación y la activación espontánea. Toda la gestión de PMNs durante el aislamiento y hasta el punto de estimulación se debe realizar en hielo para evitar la activación y prematuro MP release<sup cla...

Recientemente, se han convertido en de gran interés científico, "micropartículas/microvesículas" origina en el citosol celular o membrana plasmática como datos emergentes sugieren que estas estructuras, que van desde 50-1.000 nm de diámetro, pueden llevar información biológica y servir como un método no-canónico de la comunicación celular. Inmune celula derivados de MPs y particularmente los producidos por los neutrófilos polimorfonucleares (PMNs) son de gran interés dado el importante papel de PMNs en host defense1,2,3de las respuestas inflamatorias y cicatrización 4. sorprendentemente, hasta ahora, numerosos informes han demostrado funciones pro inflamatorias y antiinflamatorias de PMN-MPs5, sugiriendo un potencial contexto, enfermedad, especies-y papel de órgano-específica de MPs.
Los protocolos descritos en esta comunicación proporcionan un método rentable, innovadora y adaptable para estudiar la función del MPs en salud y enfermedad. Son aplicables a muchos organismos modelo, órganos y las condiciones de estimulación. Permiten la identificación de varios tipos de MPs y puede utilizarse en el futuro para atender sus funciones pro inflamatorias y antiinflamatorias. Por ejemplo, describe cómo estudiar la función de PMN-MPs en epitelial de la herida curativa en vitro y en vivo. El protocolo presentado para el aislamiento de ratón PMNs de médula ósea fue adaptado con modificaciones de un método previamente descrito6.
Además, protocolos descritos en este estudio permiten la detección y caracterización de marcadores específicos que se pueden encontrar en PMN-MPs por dos métodos complementarios: Western blot y citometría de flujo. Encontramos que el immunoblotting de MPs mediante protocolos estándar5 es fácil y confiable, sin embargo, recientes avances en la sensibilidad de los instrumentos de la citometría de flujo y mejor relación señal de ruido ahora permiten más análisis de MPs usando este método. Los protocolos descritos en este estudio incorporan avances recientes y las recomendaciones de artículos originales de investigación, incluyendo modificaciones en la velocidad de centrifugación y tiempo, la adición de muestra de filtrado y almacenamiento de congelación condiciones7 , 8y cómo reducir el "ruido de fondo", mejorar el límite de detección de PMN-MPs y discriminar entre diferentes tamaños de MPs.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>10-041-CV</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (Inactivado por calor)</td><td>Atlanta Biologics</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina (10.000 unidades de penicilina / 10.000 mg/ml de estreptococo)</td><td>GIBCO</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>0,5 M EDTA</td><td>Fisher</td><td>BP2482</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td>Estéril y filtrado a través de un 0,1 unidad de filtrado de micras</td></tr><tr><td>Estéril filtrado Histopaque 1077</td><td>Sigma</td><td>10771</td><td></td></tr><tr><td>Estéril filtrado Histopaque 1119</td><td>Sigma</td><td>11191</td><td>Densidad 1.119 g/ml.&nbsp; Solución de polisacarosa y&nbsp; Diatrizoato de sodio. Llevar a temperatura ambiente</td></tr> solución <tr><td>salina tamponada con fosfato (PBS) sin calcio y magnesio</td><td>Cellgro</td><td>210-40-CV</td><td></td></tr><tr><td>Alcohol etílico (200 grados)</td><td>Decon labs</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>HBBS</td><td>Corning</td><td>21-022-CV</td><td></td></tr><tr><td>Solución azul de tripano, 0.4%</td><td>Sigma</td><td>T8154&nbsp; SIGMA</td><td>Diluido 1:2 para el recuento de viabilidad celular</td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Abbot</td><td>50033</td><td></td></tr><tr><td>Anti-humano CD11b-APC conjugado</td><td>Biolegend</td><td>301350</td><td>Clon ICRD44 (Concentración final: 1 y micro; g/mL)</td></tr><tr><td>BODIPY FL</td><td>Invitrogen</td><td>B10250</td><td>N-(2-aminoetil) maleimida&nbsp;</td></tr><tr><td>Tampón de unión de anexina V</td><td>Biolegend</td><td>422201</td><td></td></tr><tr><td>perlas de calibración para citometría de flujo</td><td>BioCytex</td><td>7803</td><td></td></tr><tr><td>FITC Anexina V</td><td>Biolegend</td><td>640906</td><td></td></tr><tr><td>Polymorphprep</td><td>Axis-Shield PoC AS</td><td></td><td>Diatrizoato de sodio/Dextrano 500, densidad 1,113 g/ml</td></tr><tr><td>C57BL/6 ratones</td><td>Centrífuga Jackson Labs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 ml tubos</td><td>Corning</td><td>430053</td><td></td></tr><tr><td>tubos centrífugos de 50 ml</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>pipetas serológicas de 25 ml</td><td>Celltreat</td><td>229225B</td><td></td></tr><tr><td>pipetas serológicas de 10 ml</td><td>Celltreat</td><td>229210B</td><td></td></tr><tr><td>pipetas serológicas de 5 ml</td><td>Celltreat</td><td>229205B</td><td></td></tr><tr><td>pipetas Pasteur&nbsp;</td><td>BD Falcon</td><td>357575</td><td></td></tr><tr><td>25 G x 5/8 pulg. Agujas (agujas deslizantes de precisión)</td><td>BD</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>100 &micro; Filtros de células m</td><td>Celltreat</td><td>229485</td><td></td></tr><tr><td>Vacutainer</td> tubos <td>BD</td><td>367251</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSR Fortessa Special Order Research Product (SORP)</td><td>BD(</td><td>SORP)</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga de cangilón oscilante</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>75007210</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrífuga</td><td>Beckman</td><td>(L8-80 M)</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrífuga</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>&nbsp; VV-17703-15 (Fresco 17)</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga de cangilón oscilante</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>&nbsp; 75004503 (Megafuge 40R)</td><td></td></tr><tr><td>Pinza de biopsia, 28 cm</td><td>Storz</td><td>27071zj</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image J</td><td>Instituto Nacional de Salud</td><td>Código abierto&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

aislamiento y caracterización de micropartículas de neutrófilos derivado de estudios funcionales

Isolation and Characterization of Neutrophil-derived Microparticles for Functional Studies

Micropartículas de derivados de neutrófilos polimorfonucleares (PMN)-MPs) son bicapa lipídica, microvesículas esféricas con tamaños que van desde 50-1.000 nm de diámetro. MPs son una nueva evolución, parte importante de comunicación célula a célula y la maquinaria de señalización. Debido a su tamaño y la naturaleza de su liberación, hasta hace poco existencia de MP fue pasado por alto. Sin embargo, con la mejor tecnología y métodos analíticos su función en la salud y la enfermedad ahora está emergiendo. Los protocolos aquí presentados están dirigidos a aislar y caracterizar PMN-MPs por immunoblotting y citometría de flujo. Por otra parte, se dan varios ejemplos de aplicación. Estos protocolos para el aislamiento de MP son rápidos y de bajo costo y no requieren el uso de equipos costosos. Además, permiten el etiquetado de diputados tras aislamiento, así como el etiquetado de células de origen antes de la liberación de MP, con un colorante fluorescente de membrana específicos para visualización y análisis por citometría de flujo. Estos métodos, sin embargo, tienen varias limitaciones, incluyendo la pureza de PMNs y parlamentarios y la necesidad de instrumentación analítica sofisticada. Un citómetro de flujo gama alta es necesario para analizar MPs y minimizar falsos positivo Lee debido a ruido o auto fluorescencia fiable. Los protocolos descritos pueden utilizarse para aislar y definir la biogénesis MP y caracterizan a sus marcadores y variación en la composición en diferentes condiciones de estimulación. Heterogeneidad de tamaño puede ser explotado para investigar si el contenido de partículas de membrana versus exosomas es diferente, y si cumplen diferentes funciones en la homeostasis del tejido. Por último, pueden explorarse la siguientes aislamiento y caracterización de MPs, su función en respuestas celulares y varios modelos de enfermedad (incluyendo, trastornos inflamatorios asociados de PMN, como enfermedades inflamatorias del intestino o la lesión pulmonar aguda).

El análisis cytometric del flujo representativo de parlamentarios que fueron aislados de humano y ratón PMNs se muestran en la figura 1. La heterogeneidad de tamaño de PMN-MPs puede evaluarse en comparación a granos tamaño conocidos como se muestra en la figura 1A, B humana MPs. Nota, no observaron diferencias significativas en la heterogeneidad de tamaño fueron entre ratón y humanos MPs. De manera similar, usand...

Aquí se describen nuevos protocolos para aislar y caracterizar micropartículas derivadas de humano y ratón neutrófilos. Estos protocolos utilizan técnicas immunoblotting para analizar contenido de micropartículas, ultracentrifugación y citometría de flujo, y pueden ser utilizados para estudiar el papel de micropartículas derivadas de diversos tipos celulares en función de las células.

Aislamiento y caracterización de micropartículas de neutrófilos derivado de estudios funcionales

Polymorphonuclear neutrophil-derived microparticles (PMN)-MPs) are lipid bilayer, spherical microvesicles with sizes ranging from 50&#8211;1,000 nm in ...

El objetivo general de este protocolo es aislar y caracterizar micropartículas derivadas de neutrófilos para estudios funcionales. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre el papel de las vesículas de exocélulas, o micropartículas, en la comunicación célula-célula en diferentes procesos fisiológicos, como el cáncer, la inflamación y la cicatrización de heridas. Las principales ventajas de esta técnica son que es relativamente rápida, rentable y que permite la valoración de la composición fenotípica de micropartículas, o microvesículas, en activos funcionales.Ariel Finkielsztein, becario postdoctoral en mi laboratorio, y Joseph Lee, estudiante en mi laboratorio, demostrarán el procedimiento. Para la separación en gradiente de densidad de células polimorfonucleares de médula ósea murina, o PMN, primero se colocan lentamente tres mililitros de solución de 1,077 gramos por mililitro recién preparada, a temperatura ambiente, sobre tres mililitros de solución de densidad de 1,119 gramos por mililitro recién preparada, a temperatura ambiente, en un tubo cónico de 15 mililitros por muestra de células de médula ósea. A continuación, superponga un mililitro de células de médula ósea recién aisladas en PBS helado en la capa de gradiente de densidad superior de cada tubo y separe las células mediante centrifugación en gradiente de densidad.Al final de la separación, retire con cuidado las capas de células mononucleares en las interfaces entre el PBS y las capas de gradiente de densidad superior en cada tubo sin alterar las bandas de PMN. Con una pipeta de transferencia, recoja las capas de PMN en un nuevo tubo de 15 mililitros por muestra y eleve el volumen final de cada tubo a 15 mililitros con PBS filtrado de 0,1 micras de tamaño de vertido. Granular los PMN por centrifugación, seguida de una segunda centrifugación en dos mililitros de PBS fresco filtrado por tubo.A continuación, vuelva a suspender los gránulos en un mililitro de PBS recién filtrado para contar. Después de contar, centrifugar las células nuevamente y volver a suspender el pellet en 100 microlitros de HBSS filtrado de 0,1 micras del tamaño de vertido, complementado con el estimulante de interés por cada 10 millones de células. Incubar durante 20 a 30 minutos a 37 grados centígrados.Al final de la estimulación, recoja las células por centrifugación y transfiera los sobrenadantes libres de células a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 milímetros por muestra. Centrifugar los sobrenadantes para eliminar cualquier residuo celular y transferir los sobrenadantes aclarados a nuevos tubos de ultracentrífuga, luego ultracentrífuga los sobrenadantes y almacenar las micropartículas peletizadas en tubos de ultracentrífuga sellados con parafina a 80 grados Celsius hasta un análisis experimental adicional. Para administrar las micropartículas en el colon del ratón, primero coloque un ratón completamente anestesiado en posición prona y use pinzas de biopsia y un endoscopio equipado con una cámara de alta resolución para generar de tres a cinco heridas superficiales a lo largo del lado dorsal del colon.Regrese el ratón a su jaula con monitoreo hasta que se recupere por completo. 24 horas después, use el endoscopio para obtener imágenes de las heridas infligidas bajo anestesia. A continuación, utilice un sistema de microinyección basado en colonoscopia para administrar un volumen experimental de micropartículas de PMN resuspendidas en 100 microlitros de HBSS directamente en cada sitio de la herida.La heterogeneidad del tamaño de las micropartículas de PMN se puede evaluar comparando las micropartículas con perlas de citometría de flujo de tamaño conocido. Como se ha demostrado, la expresión de proteínas de interés por parte de las micropartículas también puede examinarse mediante citometría de flujo. En este experimento, se evaluó mediante inmunoblot la expresión de moléculas inflamatorias y antiinflamatorias clave por micropartículas derivadas de PMN estimuladas por activadores.Los efectos de las micropartículas de PMN en la cicatrización de las células epiteliales se pueden monitorizar mediante la adquisición de imágenes de monocapas epiteliales heridas por arañazo en puntos de tiempo predeterminados in vitro, así como después de la herida con pinzas de biopsia in vivio. Una vez dominadas, las micropartículas derivadas de PMN se pueden aislar en cuatro horas, si la técnica se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que antes de la estimulación, el PMN debe mantenerse en hielo para evitar la activación prematura y la pérdida de micropartículas.Siguiendo este procedimiento, se pueden utilizar técnicas de citometría de flujo, inmunotransferencia y reacción de proliferación en tiempo real para definir el contenido de micropartículas, en diversas condiciones de estimulación o a partir de diferentes células de origen. Esta técnica es útil para examinar el papel de la contribución de las micropartículas en la regulación de las respuestas inmunitarias, la función de barrera, la lesión y reparación de tejidos, así como en la progresión del cáncer. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo aislar y etiquetar micropartículas murinas y usar las micropartículas en un activo funcional de cicatrización de heridas in vivo.No olvide que trabajar con animales vivos puede ser peligroso, y que las precauciones sugieren que siempre se debe colocar el equipo de protección personal y completar las capacitaciones de seguridad adecuadas antes de realizar este procedimiento.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Los neutrófilos se encuentran entre las primeras células en llegar al sitio de la respuesta inmune inflamatoria, y sus funciones y mecanismos han sido ampliamente estudiados in vitro. Se demuestra un gradiente de densidad estándar método de separación para aislar los neutrófilos humanos de sangre entera utilizando los medios disponibles en el mercado de separación.

Aislamiento de neutrófilos Protocolo

Este video muestra el aislamiento de proteínas de los neutrófilos, que luego se procesa y digiere en péptidos más pequeños. Estos péptidos se pueden utilizar para análisis futuros.

Aislamiento y digestión de proteínas neutrófilas

Se describe un protocolo para el aislamiento y purificación de los neutrófilos de médula ósea de ratón por centrifugación en gradiente de densidad y para el etiquetado de neutrófilos usando colorantes CellTracker. Esto representa un método sencillo, rápido, reproducible y económico para la obtención de un gran número de neutrófilos para los estudios funcionales aguas abajo o experimentos de transferencia adoptivos y seguimiento.

Aislamiento, Purificación y Etiquetado de neutrófilos de médula ósea de ratón de Estudios funcionales y experimentos de transferencia adoptivos

Los neutrófilos desempeñan un papel importante no solo en la defensa del huésped contra los microorganismos invasores, sino que también están implicados en la vigilancia inmunitaria de las células tumorales. En este trabajo describimos técnicas relacionadas con el aislamiento de neutrófilos con propiedades antitumorales y métodos para monitorizar la función de neutrófilos antitumorales in vitro e in vivo.

Aislamiento y caracterización de los neutrófilos con propiedades antitumorales

Los neutrófilos son el tipo más abundante de glóbulos blancos. Aquí se describe el aislamiento de neutrófilos de la sangre humana mediante el método de separación en gradiente de densidad y la diferenciación de células promielocíticas humanas (HL60) a lo largo de la vía granulocítica; para probar su papel en la sensibilidad de las células de linfoma a los agentes antilinfomas.

Aislamiento de neutrófilos y análisis para determinar su papel en el linfoma de células sensibles a los agentes terapéuticos

Se describe aquí un método para la obtención y la identificación de una subpoblación recién caracterizado de los fagocitos gigantes derivadas de neutrófilos. Estas células se desarrollan en cultivo a partir de neutrófilos de sangre humana fresca, y se caracterizan por la fagocitosis, la autofagia, inmensamente gran tamaño, y la vida útil extendida. Este método es esencial para investigar más a fondo esta subpoblación única de neutrófilos derivado.

El desarrollo y la identificación de una subpoblación de Novela derivada de neutrófilos humanos fagocitos gigante In Vitro

En esta investigación, se demuestra un método de separación libre de etiqueta neutrófilo de clínica las secreciones mediante la operación de circuito cerrado de la microfluídica inercial espiral. El método propuesto expandiría los ensayos clínicos en vitro para diversas enfermedades respiratorias.

Etiqueta-libre neutrófilo enriquecimiento de la secreción de la vía aérea paciente derivado mediante microfluídica inercial de lazo cerrado

Este protocolo detalla un método para el aislamiento de neutrófilos de sangre total, capas buffy o membranas de leucoféresis, logrando un buen rendimiento, alta pureza y mínima activación celular. Utilizamos la purificación por gradiente, la sedimentación de glóbulos rojos (RBC) y la lisis de RBC para obtener una preparación de neutrófilos de alta calidad / pureza.

Aislamiento de neutrófilos humanos de sangre entera y buffy coats

Este protocolo presenta un conjunto de ensayos funcionales de neutrófilos que se utilizarán como método de cribado para cubrir las funciones de diferentes vías de señalización. El protocolo incluye una evaluación inicial y sencilla de la viabilidad celular, la pureza, la producción de especies reactivas de oxígeno, la migración en tiempo real, la fagocitosis y una sugerencia preliminar de trampas extracelulares de neutrófilos.

Un conjunto de técnicas de cribado para una visión general rápida de la función de los neutrófilos

Aquí, proporcionamos un enfoque confiable para aislar neutrófilos de densidad baja y normal de la sangre total utilizando aislamiento magnético (selección negativa) y medio de gradiente de densidad discontinuo. Garantiza el aislamiento intacto de las células de alta pureza (≥93%), lo que facilita el análisis preciso de las subpoblaciones de neutrófilos, crucial para comprender sus funciones en la salud y la enfermedad.

Aislamiento y caracterización de neutrófilos de densidad baja y normal a partir de sangre total

Los neutrófilos de baja densidad (LDN) aumentan significativamente en varias enfermedades. Las LDN generalmente se aíslan mediante clasificación celular. Presentamos un método práctico para obtener LDN pura y viable. Después de la centrifugación en gradiente de densidad de la sangre periférica, las células se incuban con microperlas magnéticas y luego las LDN se separan a través de columnas magnéticas.

Método rápido de microperlas magnéticas para la purificación eficiente de neutrófilos de baja densidad

Aprenda a aislar y caracterizar micropartículas derivadas de neutrófilos humanos y murinos usando ultracentrifugación y citometría de flujo. Este protocolo rápido permite analizar su composición fenotípica en estudios funcionales.

Aislamiento y caracterización de micropartículas de neutrófilos derivado de estudios funcionales

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