Name: Aislamiento de neutrófilos Protocolo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-07-23T22:05:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: Aprende a aislar neutrófilos de sangre humana mediante separación por gradiente de densidad. Este protocolo estandarizado facilita el estudio de respuestas inflamatorias y funciones inmunes en laboratorio.

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Financiación de los NIH R01 HL56621.

Aislamiento de neutrófilos Protocolo <ol><li> Mantener los reactivos a temperatura ambiente. </li><li> Recoger 5,0 ml de medios de aislamiento de los neutrófilos en tubo de centrífuga. Cuidadosamente la capa de 5,0 ml de sangre sobre los medios de separación. Realizar este paso, lenta y cuidadosamente, y con la punta de la pipeta cerca de la superficie de los medios de comunicación para evitar la mezcla de la sangre y los medios de comunicación. </li><li> Centrifugar a 500 RCF durante 35 minutos a 20-25 ° C. La sangre se debe separar en 6 secciones distintas: el plasma, los monocitos, los medios de aislamiento, los neutrófilos, más medios de aislamiento, y el pellet de glóbulos rojos (Figura 1). Si estas bandas no están claras, el proceso de separación no estaba limpia, y tendrá que ser repetido. </li><li> Retire con cuidado la parte superior de tres capas (plasma, los monocitos, y los medios de aislamiento) con una pipeta. Disponer de estas capas. </li><li> Pipeta cuidadosamente la capa de neutrófilos y todos los medios de aislamiento por debajo de los neutrófilos. Ponga la solución en un tubo de centrífuga limpio. </li><li> Diluir la solución de los neutrófilos a 10 ml con HBSS sin Ca 2 + / Mg 2 +. Invertir el tubo varias veces para suspender las células. </li><li> Centrifugar la solución de los neutrófilos a 350 RCF durante 10 minutos. Una pastilla de color rojo debe estar presente en la parte inferior del tubo, que contiene los neutrófilos y los residuos de glóbulos rojos (GR). Eliminar el sobrenadante con una pipeta con cuidado para que la pastilla no se altera. </li><li> La lisis de los glóbulos rojos residual, agregar 2 ml Red tampón de lisis celular en el tubo. Para resuspender el precipitado y agitar el vial en un ajuste de 4.3. Evitar el aumento de la configuración de vórtice por encima de 4, ya que esto puede causar a los neutrófilos para activar. Puede que sea necesario para vórtice durante varios segundos, o &quot;pulso&quot; de la vorágine de disolver el precipitado. </li><li> Centrifugar el tubo a 250 RCF durante 5 min. Eliminar el sobrenadante con una pipeta. Repita el proceso de lisis, si es necesario. </li><li> Añadir 500 l HBSS sin Ca 2 + / Mg 2 + en cada tubo. Una vez más, vortex para resuspender el precipitado en un ajuste de 4.3. Diluir a 10 ml con HBSS sin Ca 2 + / Mg 2 +. </li><li> Centrifugar los tubos a 250 RCF durante 5 min. Aspirar el sobrenadante y desecharlo. </li><li> Resuspender el precipitado en 250 HBSS l / Solución de HSA (2% HSA). Las células se pueden contar y se ajusta a la concentración deseada. </li></ol>

<ol><li>Boyum, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+leucocytes+from+blood+and+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Scand.+J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Separation of leucocytes from blood and bone marrow.</a> Scand. J. Clin. Invest. 21, Suppl 97. 77-83 (1968).</li>
<li>England, J. M., Rowan, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+assignment+of+values+to+fresh+blood+used+for+calibrating+automated+blood+cell+counters%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Lab.+Haemat%22%5BJournal%5D)">The assignment of values to fresh blood used for calibrating automated blood cell counters.</a> Clin. Lab. Haemat. 10, 203-212 (1988).</li>
<li>Garcia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+two+leukocyte+extraction+methods+for+cytomegalovirus+antigenemia+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Comparison of two leukocyte extraction methods for cytomegalovirus antigenemia assay.</a> J. Clin. Microbiol. 34, 182-184 (1996).</li>
<li>Ferrante, A., Thong, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+conditions+for+simultaneous+purification+of+mononuclear+and+polymorphonuclear+leucocytes+from+human+peripheral+blood+by+the+Ficoll-Hypaque+method%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimal conditions for simultaneous purification of mononuclear and polymorphonuclear leucocytes from human peripheral blood by the Ficoll-Hypaque method.</a> J. Immunol. Methods. 36, 109-109 (1980).</li>
</ol>

El gradiente de densidad método de separación se utiliza para aislar los neutrófilos humanos de sangre total usando una mezcla de sodio y metrizoato Dextran 500. Este método se basa en el método de separación de leucocitos mononucleares por Boyum (1968), que fue modificada para la separación de los neutrófilos por Ferrante y Correa (1980). Después de la recolección de un donante, la sangre entera pueden ser anticoagulados con EDTA, citrato o heparina. Ya que son de corta duración, los neutrófilos se debe utilizar dentro de 2-4 horas...

<table><tbody><tr><td>Poli(R) de linfocitos</td><td>Reactivo</td><td>Cedarlane Labs</td><td></td><td>Se puede usar PolymorphprepTM como alternativa</td></tr><tr><td>Solución salina equilibrada de Hank&amp;rsquo;s sin cloruro de calcio</td><td>Reactivo</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica humana</td><td>Reactivo</td><td>ZLB Bioplasma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tampón de lisis de glóbulos rojos</td><td>Reactivo</td><td>Roche Group</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Herramienta</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Herramienta</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipetas de Pasteur y perilla</td><td>Herramienta</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PolymorphprepTM</td><td>Reactivo</td><td>Axis-Shield</td><td></td><td>Reactivo alternativo al Poli(R) de linfocitos</td></tr><tr><td>Filtro de jeringa</td><td>Otro</td><td>EMD Millipore</td><td>SLGV033RS</td><td>Millex-GV, 0,22 &amp;#x03BC;m, PVDF, 33 mm, esterilizable por rayos gamma</td></tr><tr><td>Solución salina equilibrada de Hank&amp;rsquo;s con cloruro de calcio</td><td>Reactivo</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

aislamiento de neutrófilos protocolo

Neutrophil Isolation Protocol

Granulocitos neutrófilos polimorfonucleares (PMN) son los leucocitos más abundantes en los seres humanos y entre las primeras células en llegar al sitio de la respuesta inmune inflamatoria. Debido a su papel clave en la inflamación, las funciones de los neutrófilos como la locomoción, la producción de citoquinas, fagocitosis, y combatir las células tumorales son ampliamente estudiados. Para la caracterización de las funciones específicas de los neutrófilos, un método limpio, rápido y confiable de que los separa de otras células sanguíneas es deseable que los estudios in vitro, sobre todo porque los neutrófilos son de corta duración y deben ser utilizados dentro de 2-4 horas de su recolección. Este sentido, demuestran un gradiente de densidad estándar método de separación para aislar los neutrófilos humanos de sangre entera utilizando los medios disponibles en el mercado de separación que es una mezcla de sodio y metrizoato Dextran 500. El procedimiento consiste en capas de sangre entera en el medio de gradiente de densidad, centrifugación, separación de la capa de neutrófilos, y la lisis de los eritrocitos residual. Las células se lavan, se cuentan y se resuspendieron en tampón de concentración que se desee. Cuando se realiza correctamente, este método ha demostrado que el rendimiento de las muestras de&gt; 95% de neutrófilos con la viabilidad&gt; 95%.

Los neutrófilos se encuentran entre las primeras células en llegar al sitio de la respuesta inmune inflamatoria, y sus funciones y mecanismos han sido ampliamente estudiados in vitro. Se demuestra un gradiente de densidad estándar método de separación para aislar los neutrófilos humanos de sangre entera utilizando los medios disponibles en el mercado de separación.

Aislamiento de neutrófilos Protocolo

Los granulocitos polimorfonucleares neutrófilos (PMN) son los leucocitos más abundantes en los seres humanos y se encuentran entre las primeras células en llegar al sitio de la inflamación...

Protocolo de aislamiento de neutrófilos. Este procedimiento extraerá glóbulos blancos de una muestra de sangre completa utilizando equipo de centrífuga y viales. Vortex, jeringa con aguja y filtro de jeringa.Milli pour marca MX gv 0,22 micrómetros de materiales. La separación de neutrófilos mediante solución salina Hank requiere dos tipos de soluciones HBSS. HBSS con cloruro de calcio se utilizará para preparar una solución con albúmina sérica humana.Se utilizará HBSS sin cloruro de calcio para suspender y lavar los neutrófilos. Tenga especial cuidado en usar la solución de HBSS adecuada en este procedimiento. El albúmina sérica humana o HSA es una proteína del plasma sanguíneo que mantiene el pH y la presión osmótica.No utilice tampón de lisis de glóbulos rojos con amalgama de suero bovino. Este producto es fabricado por Roche Diagnostics, Medio de Aislamiento de Neutrófilos NIM Cedar Line Labs, Medio de Separación Lymph Light Poly, protegido de la luz y conservado en refrigerador para obtener mejores resultados. Todos los reactivos deben estar a temperatura ambiente en el momento de su uso.Saque los reactivos del refrigerador una hora antes del experimento. Prepare la solución de H-B-S-S-H-S-A para la separación de neutrófilos. Pipetee HBSS con cloruro de calcio en un vial.Aspire la HSA hacia la jeringa. Evite atrapar burbujas de aire. Retire la aguja de la jeringa y sustitúyala por el filtro.Inyecte HSA a través de un filtro en un vial de HBSS y vortexee para mezclar cuando tenga los demás materiales preparados y a temperatura ambiente; obtenga aproximadamente 15 mililitros de sangre completa. Esto producirá entre 10 y 15 mililitros de 10 a la octava de neutrófilos. El donante no debe haber consumido alcohol ni medicamentos de venta libre durante las 24 horas previas a la donación de la muestra de sangre.Estos pueden interrumpir el proceso de separación. La sangre completa puede anticoagularse con citrato de EDTA o heparina agregando nueve partes de sangre a una parte de citrato sódico K3 EDTA o heparina, siguiendo las instrucciones del fabricante. Los siguientes pasos se describirán en este procedimiento.Separar y eliminar el plasma y los monocitos. Separar y obtener una capa de neutrófilos lisando los glóbulos rojos para obtener neutrófilos en suspensión libre mediante la primera separación. Obtener los neutrófilos en la capa de NIM.Recolecte cinco mililitros de medio de aislamiento en un tubo de centrífuga. Colocar el medio de aislamiento más abajo en el tubo permite que actúe como un filtro, ya que la centrífuga forzará la sangre a través de él cuidadosamente. Añada cuidadosamente cinco mililitros de sangre sobre el NIM para obtener una separación limpia.Tenga mucho cuidado para evitar mezclar las soluciones. Realice este paso lentamente y con precaución, manteniendo la punta de la pipeta cerca de la superficie del medio de resolución para prevenir la mezcla. La solución a 500 RCF durante 35 minutos.A 20-25 grados Celsius, la sangre debe separarse en seis bandas distintas. Las seis bandas son plasma, monocitos, medio de aislamiento, neutrófilos, más medio de aislamiento y el sedimento de glóbulos rojos en la parte inferior. Si estas seis bandas no son claras y definidas, el proceso de separación no fue limpio y debería repetirse.Las causas comunes de una mala separación incluyen el uso de un medio de aislamiento procedente de un donante que haya consumido alcohol en las últimas 72 horas o que haya ingerido otros medicamentos como Tylenol o aspirina. Retire con cuidado y deseche el plasma, los monocitos y el medio de aislamiento. Coloque estas capas en un tubo hermético y deseche; luego, aspire cuidadosamente con una pipeta la capa de neutrófilos y todo el medio de aislamiento situado debajo de los neutrófilos, y transfiera esta mezcla a un tubo limpio de centrífuga para recuperar el mayor número posible de neutrófilos.A menudo es más fácil incluir también algo del medio de aislamiento de la capa inferior. No perturbe el pallet en la parte inferior. Segunda declaración, refinar la capa de neutrófilos.Diluya la solución de neutrófilos a 10 mililitros con HBSS sin calcio. Invierta el tubo varias veces para suspender las células y centrifugue. La solución de neutrófilos.350 RCF durante 10 minutos. A 20-25 grados Celsius, debería observarse un sedimento rojo en el fondo del tubo que contiene neutrófilos y glóbulos rojos residuales. Retire el sobrenadante con la pipeta.Tenga cuidado de no perturbar el precipitado en el fondo. Licuando los glóbulos rojos.Las células rojas en la muestra deben destruirse ahora mediante lisis. Para lisar las células rojas residuales, agregue dos mililitros de tampón de lisis de células rojas al tubo para resuspender. Suspenda el precipitado y vortexee el vial a una configuración de tres a cuatro.Evite aumentar la velocidad del vórtex por encima de cuatro, ya que esto podría provocar la activación de los neutrófilos. Puede ser necesario agitar en vórtex durante varios segundos o aplicar pulsos breves para disolver el precipitado. Centrifugue la solución de lisis a 250 RCF durante cinco minutos.Utilice la opción de arranque suave para minimizar el daño a la muestra. Retire el sobrenadante con pipeta. Repita el proceso de lisis.Si es necesario, para liberar la suspensión de neutrófilos, agregue 500 microlitros de HBSS sin calcio a cada tubo. Vortexee el precipitado en una configuración de tres a cuatro, diluya a 10 mililitros con HBSS sin calcio y centrifugue los neutrófilos a 250 RCF durante cinco minutos. Aspire el sobrenadante y deseche.Re suspender el sedimento en 250 microlitros de solución de HBSS con HSA, dos veces 10 a la seis. Se recogen típicamente neutrófilos por mililitro.

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Este video muestra un ensayo in vitro para estudiar la interacción entre neutrófilos y biopelícula. Las bacterias patógenas incrustadas en la biopelícula y los neutrófilos aislados se marcaron mediante marcadores fluorescentes, y la respuesta inmunitaria de los neutrófilos y la evasión de la respuesta inmunitaria de las bacterias se evaluaron mediante un microscopio de fluorescencia.

Un ensayo in vitro para estudiar la interacción entre los neutrófilos y el biofilm

Este video demuestra la inducción y visualización de trampas extracelulares de neutrófilos o NETs en neutrófilos premarcados utilizando suero del paciente que contiene anticuerpos anti-citoplasma de neutrófilos. Además, el uso de un tinte de ADN impermeable y la microscopía de fluorescencia permite la visualización de los NET.

Inducción y visualización de trampas extracelulares de neutrófilos en neutrófilos premarcados

En el siguiente protocolo, se describe una manera muy simple para aislar las trampas de neutrófilos extracelular (TNE) a partir de sangre humana entera utilizando reactivos fácilmente disponibles. A continuación, demostramos cómo las redes aisladas se pueden utilizar en un ensayo de adhesión in vitro con células cancerosas.

Simplificado Humanos neutrófilos extracelular Trampas (TNE) Aislamiento y manipulación

Los neutrófilos desempeñan un papel importante no solo en la defensa del huésped contra los microorganismos invasores, sino que también están implicados en la vigilancia inmunitaria de las células tumorales. En este trabajo describimos técnicas relacionadas con el aislamiento de neutrófilos con propiedades antitumorales y métodos para monitorizar la función de neutrófilos antitumorales in vitro e in vivo.

Aislamiento y caracterización de los neutrófilos con propiedades antitumorales

Los neutrófilos son el tipo más abundante de glóbulos blancos. Aquí se describe el aislamiento de neutrófilos de la sangre humana mediante el método de separación en gradiente de densidad y la diferenciación de células promielocíticas humanas (HL60) a lo largo de la vía granulocítica; para probar su papel en la sensibilidad de las células de linfoma a los agentes antilinfomas.

Aislamiento de neutrófilos y análisis para determinar su papel en el linfoma de células sensibles a los agentes terapéuticos

Se describe aquí un método para la obtención y la identificación de una subpoblación recién caracterizado de los fagocitos gigantes derivadas de neutrófilos. Estas células se desarrollan en cultivo a partir de neutrófilos de sangre humana fresca, y se caracterizan por la fagocitosis, la autofagia, inmensamente gran tamaño, y la vida útil extendida. Este método es esencial para investigar más a fondo esta subpoblación única de neutrófilos derivado.

El desarrollo y la identificación de una subpoblación de Novela derivada de neutrófilos humanos fagocitos gigante In Vitro

Aquí, presentamos un protocolo para generar trampas extracelulares de neutrófilos (NET) y operar NETQUANT, una opción de software totalmente automática para la cuantificación de NETs en imágenes de inmunofluorescencia.

Cuantificación automatizada basada en imágenes de trampas extracelulares de neutrófilos mediante NETQUANT

Este protocolo detalla un método para el aislamiento de neutrófilos de sangre total, capas buffy o membranas de leucoféresis, logrando un buen rendimiento, alta pureza y mínima activación celular. Utilizamos la purificación por gradiente, la sedimentación de glóbulos rojos (RBC) y la lisis de RBC para obtener una preparación de neutrófilos de alta calidad / pureza.

Aislamiento de neutrófilos humanos de sangre entera y buffy coats

Este protocolo definido describe un enfoque de microscopía de alto rendimiento en tiempo real para visualizar y cuantificar la liberación de trampas extracelulares (NET) de neutrófilos humanos in vitro. El método reproducible permite la investigación de las características y la cinética de la liberación de NET tras la estimulación con distintos inductores de NETosis y permite la evaluación de la farmacología de los antagonistas de NETosis.

Cuantificación microscópica en tiempo real y de alto rendimiento de la liberación de trampas extracelulares de neutrófilos humanos y evaluación de la farmacología de los antagonistas

Aquí, proporcionamos un enfoque confiable para aislar neutrófilos de densidad baja y normal de la sangre total utilizando aislamiento magnético (selección negativa) y medio de gradiente de densidad discontinuo. Garantiza el aislamiento intacto de las células de alta pureza (≥93%), lo que facilita el análisis preciso de las subpoblaciones de neutrófilos, crucial para comprender sus funciones en la salud y la enfermedad.

Aislamiento y caracterización de neutrófilos de densidad baja y normal a partir de sangre total

Los neutrófilos de baja densidad (LDN) aumentan significativamente en varias enfermedades. Las LDN generalmente se aíslan mediante clasificación celular. Presentamos un método práctico para obtener LDN pura y viable. Después de la centrifugación en gradiente de densidad de la sangre periférica, las células se incuban con microperlas magnéticas y luego las LDN se separan a través de columnas magnéticas.

Método rápido de microperlas magnéticas para la purificación eficiente de neutrófilos de baja densidad

Aprende a aislar neutrófilos de sangre humana mediante separación por gradiente de densidad. Este protocolo estandarizado facilita el estudio de respuestas inflamatorias y funciones inmunes en laboratorio.

Aislamiento de neutrófilos Protocolo

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