Aislamiento de neutrófilos Protocolo
23 de julio de 2008
Los neutrófilos se encuentran entre las primeras células en llegar al sitio de la respuesta inmune inflamatoria, y sus funciones y mecanismos han sido ampliamente estudiados in vitro. Se demuestra un gradiente de densidad estándar método de separación para aislar los neutrófilos humanos de sangre entera utilizando los medios disponibles en el mercado de separación.
Protocolo de aislamiento de neutrófilos. Este procedimiento extraerá glóbulos blancos de un equipo de muestras de sangre completa, centrífuga y viales. Filtro de jeringa de aguja y jeringa Vortex señor.
Materiales Milli pour marca MX gv 0.22 Micrometer. La separación de neutrófilos en solución salina y hechizo de Hank requiere dos tipos de soluciones HBSS. El HBSS con cloruro de calcio se utilizará para hacer una solución con albúmina sérica humana.
Se utilizará HBSS sin cloruro de calcio para suspender y lavar los neutrófilos. Tenga especial cuidado al utilizar la solución HBSS adecuada en este procedimiento. La albúmina sérica humana o HSA es una proteína del plasma sanguíneo que mantiene el pH y la presión SMO.
No utilice tampón de lisis de glóbulos rojos de amalgamato de suero bovino. Esto es fabricado por Roche Diagnostics, medios de aislamiento de neutrófilos NIM Cedar Line Labs Lymph light Poly medios de separación protegidos de la luz y guardados en el refrigerador para obtener mejores resultados. Todos los reactivos deben estar a temperatura ambiente en el momento de su uso.
Retire los reactivos del refrigerador una hora antes del experimento. Prepare la solución H-B-S-S-H-S-A para la separación de neutrófilos. Pipetear HBSS con cloruro de calcio en el vial.
Extraiga la HSA en la jeringa. Evite atrapar burbujas de aire. Retire la aguja de la jeringa y reemplácela con el filtro.
Inyecte HSA a través del filtro en el vórtice del vial HBSS cuando tenga sus otros materiales listos y a temperatura ambiente, adquiera aproximadamente 15 mililitros de sangre entera. Esto producirá de 10 a 15 mililitros de 10 al octavo neutrófilos. El donante no debe haber consumido alcohol ni drogas de venta libre durante las 24 horas anteriores a la donación de la muestra de sangre.
Estos pueden interrumpir el proceso de separación. La sangre entera se puede anticoagular con citrato de EDTA o heparina añadiendo nueve partes de sangre a una parte de K, tres citrato de sodio EDTA o heparina siguiendo las instrucciones del fabricante. En este procedimiento se describirán los siguientes pasos.
Separar y extraer el plasma y los monocitos. Separar y adquirir una capa de neutrófilos lisando los glóbulos rojos libres suspenden la primera separación de los neutrófilos. Adquirir neutrófilos en la capa NIM.
Recoja cinco mililitros de medio aislante en el tubo de centrífuga. Colocar el medio de aislamiento más abajo en el tubo permite que actúe como un filtro, ya que la centrífuga forzará la sangre a través de él con cuidado. Coloque una capa de cinco mililitros de sangre sobre el MIN para una separación limpia.
Tenga mucho cuidado de evitar mezclar las soluciones. Realice este paso lenta y cuidadosamente y con la punta de la pipeta cerca de la superficie del medio de resolución para evitar que se mezcle la centrífuga. La solución a 500 RCF durante 35 minutos.
A 20 a 25 grados centígrados, la sangre debe separarse en seis bandas distintas. Las seis bandas son los monocitos plasmáticos, los medios de aislamiento, los neutrófilos, más medios de aislamiento y la pastilla de glóbulos rojos en la parte inferior. Si estas seis bandas no son claras y distintas, el proceso de separación no fue limpio y tendría que repetirse.
Las causas comunes de una mala separación incluyen que el donante de medios de aislamiento antiguo haya consumido alcohol en las últimas 72 horas o que el donante haya consumido otros medicamentos como Tylenol o aspirina. Retire y deseche con cuidado los monocitos plasmáticos y los medios de aislamiento. Coloque estas capas en un tubo hermético y deseche cuidadosamente la capa de neutrófilos y todos los medios de aislamiento debajo de los neutrófilos en un archivo de centrífuga limpio para recuperar la mayor cantidad posible de neutrófilos.
A menudo también es más fácil incluir algunos de los medios de aislamiento de la capa inferior. No moleste el palet en la parte inferior. Segunda declaración, refinar la capa de neutrófilos.
Diluir la solución de neutrófilos a 10 mililitros con HBSS sin calcio. Invierta el tubo unas cuantas veces para suspender la centrífuga de las células. La solución de los neutrófilos.
350 RCF durante 10 minutos. A 20 a 25 grados centígrados, debe haber una bolita roja en el fondo del tubo que contenga neutrófilos y glóbulos rojos residuales. Retire el supra natin con la pipeta.
Tenga cuidado de alterar el pellet en la parte inferior. Lisis de los glóbulos rojos.
Los glóbulos rojos de la muestra ahora deben ser destruidos por lisis. Para lisar los glóbulos rojos residuales, agregue dos mililitros de tampón de lisis de glóbulos rojos al tubo para recuperar. Suspenda el vórtice de pellets del vial en una configuración de tres a cuatro.
Evite aumentar el ajuste del vórtice por encima de cuatro, ya que esto puede hacer que los neutrófilos se activen. Puede ser necesario hacer un vórtice durante varios segundos o pulsar el vórtice para disolver el paladar. Centrifugar la solución de lisis a 250 RCF durante cinco minutos.
Utilice la opción de inicio suave para minimizar el daño a la muestra. Retirar el supra natin con una pipeta. Repite el proceso de lisado.
Si es necesario, libere la suspensión de neutrófilos, agregue 500 microlitros de HBSS sin calcio a cada tubo. Agite el pellet en un ajuste de tres a cuatro, diluya a 10 mililitros con HPSS sin centrífuga de calcio. Los neutrófilos a 250 RCF durante cinco minutos aspiran el snat y lo descartan.
Vuelva a suspender el pellet en 250 microlitros de HBSS con solución de HSA, dos veces 10 a seis. Por lo general, se recolectan neutrófilos por mililitro.
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Visión general
Este artículo presenta un método para aislar neutrófilos humanos de sangre completa utilizando una técnica estándar de separación por gradiente de densidad. Los neutrófilos juegan un papel crucial en la respuesta inmune inflamatoria, y comprender su aislamiento es vital para investigaciones adicionales.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Inmunología
- Biología celular
- Neurociencia
Antecedentes
- Los neutrófilos están entre los primeros en responder en las respuestas inflamatorias.
- Sus funciones y mecanismos han sido extensamente estudiados in vitro.
- Las técnicas de aislamiento son esenciales para estudiar el comportamiento y las funciones de los neutrófilos.
- Los métodos estandarizados mejoran la reproducibilidad en la investigación.
Propósito del estudio
- Demostrar un método confiable para aislar neutrófilos de la sangre humana.
- Facilitar investigaciones adicionales sobre las funciones de los neutrófilos en la inflamación.
- Proporcionar un protocolo que pueda ser fácilmente adoptado en laboratorios.
Métodos utilizados
- Método de separación por gradiente de densidad.
- Uso de medios de separación comercialmente disponibles.
- El equipo incluye centrífuga y viales.
- Preparación de soluciones utilizando HBSS con cloruro de calcio y albúmina del suero humano.
Resultados principales
- Aislamiento exitoso de neutrófilos de muestras de sangre completa.
- Demostración de la efectividad del método de separación.
- Provisión de un protocolo claro para investigadores.
- Aplicaciones potenciales en el estudio del comportamiento de los neutrófilos en varias condiciones.
Conclusiones
- El método presentado es efectivo para el aislamiento de neutrófilos.
- Este protocolo puede mejorar la investigación sobre las respuestas inmunes.
- Estudios adicionales pueden construir sobre esta técnica de aislamiento.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Reliable neutrophil isolation is foundational for early-stage immunology and inflammation research, enabling precise functional studies and mechanistic de-risking in drug discovery. High-purity, high-viability neutrophil preparations support robust target validation and quantitative assay development, directly impacting predictive confidence at key portfolio inflection points. Standardized isolation protocols facilitate reproducibility and cross-functional data integration across discovery and translational teams.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of neutrophil-specific pathways and immune mechanisms relevant to inflammation and oncology.
- Supports functional target validation by providing pure, viable neutrophil populations for downstream assays.
- Reduces biological ambiguity, strengthening predictive confidence in early-stage hypothesis testing.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized, high-viability neutrophil samples for reproducible in vitro assays.
- Facilitates quantitative measurement of neutrophil functions such as phagocytosis and cytokine production.
- Enables assay scalability and platform reuse for compound screening and mechanistic studies.
Translational & Preclinical Research
- Provides disease-relevant cellular material for modeling inflammatory responses in preclinical systems.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by maintaining cell function and viability.
- Aligns with translational biomarker strategies by enabling functional readouts in human immune cells.
Pipeline & Workflow Integration
This density gradient neutrophil isolation protocol integrates at the interface of early discovery and assay development, supporting workflows from target validation to preclinical research.
- Discovery Biology: Supplies pure neutrophils for hypothesis-driven functional studies and pathway analysis.
- Screening: Provides reproducible, quantitative cell-based assay inputs for compound evaluation.
- Analytics: Enables measurement of cell viability, purity, and functional outputs for comparative analysis.
- Translational Research: Bridges in vitro findings to preclinical models using primary human immune cells.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized protocol adaptable across multiple research programs and disease areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic uncertainty in immune cell studies.
- Operational Value: Enhances reproducibility, standardization, and scalability of neutrophil-based assays.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by enabling robust early data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of inflammation and immunology assets.
Implementation Considerations
- Requires technical expertise in density gradient separation and cell handling.
- Needs access to centrifugation equipment, sterile reagents, and validated separation media.
- Demands strict adherence to timing and temperature controls to preserve cell viability.
- Necessitates cross-team standardization for reproducible outputs across studies.
- Limited by donor variability and short neutrophil lifespan, requiring rapid downstream use.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:08
Equipment
0:24
Materials
1:24
Preparation of HBSS/HSA
2:06
Blood sample
2:38
Stages of neutrophil isolation
2:53
First separation: acquire neutrophils
4:56
Second separation: refine neutrophil layer
5:39
Third separation: lysing the red blood cells
6:27
Fourth separation: resuspending the neutrophils
