Método rápido de microperlas magnéticas para la purificación eficiente de neutrófilos de baja densidad

Estudiamos neutrófilos de baja densidad dentro de células mononucleares de la sangre periférica para caracterizar sus funciones y así definir su papel en diferentes enfermedades. Los neutrófilos de baja densidad son raros en sangre sana, pero aumentan notablemente en enfermedades como el lupus eritematoso sistémico y el cáncer. Para empezar, añade 10 unidades por mililitro de heparina como anticoagulante en un tubo cónico de centrífuga de 15 mililitros.

Luego añade dos mililitros de T500 al 6% de dextrán en PBS. Obtén 10 mililitros de sangre de un voluntario adulto sano mediante venpuntura. En otro tubo centrifugador nuevo de 15 mililitros, añade cinco mililitros de medio de gradiente de densidad.

Extrae cuidadosamente el plasma sin tocar los eritrocitos y aplícalo sobre el medio para formar dos fases separadas. Centrifuga el tubo a 516 g durante 20 minutos a cuatro grados Celsius. Para aislar los PBMC, aspira y descarta el plasma por encima de la banda de PBMC sin alterar las células.

Recoge la banda de la celda mononuclear entre el plasma y el medio, minimizando la recogida del medio. Añade 20 mililitros de PBS al tubo que contiene PBMCs, luego centrifuga a 400 g durante cinco minutos a cuatro grados Celsius. Aspira cuidadosamente el sobrenadante y raspa el tubo para separar el pellet.

Añade 10 mililitros de PBS frío para resuspender las células. Para aislar neutrófilos, raspa el tubo para separar las células después de pipetear el medio. Luego añade 10 mililitros de PBS frío.

Ahora transfiere las celdas a un tubo cónico cónico nuevo de 50 mililitros y centrifugadora. Aspira el sobrenadante y raspa el tubo de nuevo. Ahora pipetea 10 mililitros de solución hipotónica fría en el tubo y mezcla suavemente.

Mezcla suavemente durante exactamente un minuto. Añade rápidamente 10 mililitros de solución hipertónica fría para que la solución sea isotónica. Luego cuenta los neutrófilos usando una cámara de Neubauer y asegúrate de que la pureza sea mayor al 95%. Centrifuga la suspensión para obtener un pellet celular.

Luego vuelve a suspender el pellet en PBS frío. Centrifuga las células mononucleares de la sangre periférica a 400 g durante cinco minutos a cuatro grados Celsius. Tras retirar el sobrenadante, resuspende las células en 120 microlitros de tampón de lavado en frío.

Luego pipeteo 35 microlitros de microperlas magnéticas CD66b a la suspensión celular. Incuba la mezcla en la oscuridad a cuatro grados Celsius durante 30 minutos. Ahora pipetea un mililitro de buffer de lavado en frío al tubo.

Centrifuga el tubo a 400 g durante tres minutos. Raspa el tubo para separar la cápsula celular después de retirar el sobrenadante. Y resuspendiendo las células en un mililitro de tampón de lavado.

Coloca una columna de separación magnética sobre un imán. Añade 0,5 mililitros de buffer de lavado a la columna, permitiendo que pase completamente. Transfiere un mililitro de las celdas resuspendidas a la columna y deja que el tampón pase gota a gota.

Después del lavado, transfiere la columna a un tubo microcentrífuga. Luego se pipetea un mililitro de tampón de lavado en la columna. Ahora inserta el émbolo en la parte superior de la columna.

Aplica presión suavemente para eluir las células. Luego quita el émbolo y coloca la columna sobre un tubo nuevo para microcentrífuga. Añade otro mililitro de buffer de lavado a la columna.

Luego vuelve a insertar el émbolo y aplica presión suavemente para eluir las células restantes. Centrifuga ambos tubos de microcentrífuga a 800 g durante tres minutos. Resuspende los plínulos celulares de ambos tubos en un mililitro de PBS frío.

Mantén la suspensión de la celda sobre hielo. Resuspende las células purificadas en un tampón de marcado hecho de suero bovino fetal al 1% en PBS. Transfiere 250 microlitros de la suspensión a un tubo microcentrífuga de 1,5 mililitros.

Añade los anticuerpos correspondientes contra las moléculas de membrana neutrófila al tubo. Luego incuba las células durante 30 minutos a cuatro grados Celsius, protegidas de la luz. Ahora pieta un mililitro de PBS al tubo.

Haz girar el tubo en una microcentrífuga a 800 g durante tres minutos. Aspira el sobrenadante. Golpea el tubo para romper el perdigón.

Y resuspende las células en 0,5 mililitros de paraformaldehído al 1%. Luego mantén las células a cuatro grados Celsius, protegidas de la luz hasta el análisis mediante citometría de flujo. Analizar las muestras mediante citometría de flujo, capturando 10.000 eventos por muestra.

Los neutrófilos de baja densidad en individuos sanos representaban aproximadamente el 5% de las células mononucleares de la sangre periférica, mientras que el protocolo de aislamiento magnético descrito produjo neutrófilos de baja densidad con aproximadamente un 98% de recuperación. Los neutrófilos expresan los marcadores de membrana CD10, CD11b, CD15, CD62L y CD66b. Los neutrófilos de baja densidad purificados magnéticamente expresaban los mismos marcadores de membrana que los neutrófilos.

Los neutrófilos purificados de baja densidad exhibían un núcleo multilobulado y eran similares en tamaño a los neutrófilos. Tanto los neutrófilos como los neutrófilos de baja densidad generaban especies reactivas de oxígeno en respuesta a la estimulación del PMA, siendo los neutrófilos de baja densidad los que producían niveles más altos que los neutrófilos. Los neutrófilos de baja densidad liberaron trampas extracelulares neutrófilas en respuesta a la estimulación de PMA, como se evidencia en la colocalización del ADN con elastasa y con citrulina.

Tanto neutrófilos purificados como neutrófilos de baja densidad liberaron NETs con cinética y cantidades similares tras el tratamiento con PMA. Nuestro protocolo proporciona una forma rápida y reproducible de obtener neutrófilos de baja densidad altamente puros y funcionales. Abordamos la falta de un protocolo estandarizado y eficiente en tiempo para el aislamiento de neutrófilos de baja densidad de la sangre humana.

Este protocolo no requiere formación especial para instrumentos complejos, y además es más económico y rápido que FACS.