Método rápido de microperlas magnéticas para la purificación eficiente de neutrófilos de baja densidad
11 de noviembre de 2025
Los neutrófilos de baja densidad (LDN) aumentan significativamente en varias enfermedades. Las LDN generalmente se aíslan mediante clasificación celular. Presentamos un método práctico para obtener LDN pura y viable. Después de la centrifugación en gradiente de densidad de la sangre periférica, las células se incuban con microperlas magnéticas y luego las LDN se separan a través de columnas magnéticas.
Estudiamos neutrófilos de baja densidad dentro de células mononucleares de la sangre periférica para caracterizar sus funciones y así definir su papel en diferentes enfermedades. Los neutrófilos de baja densidad son raros en sangre sana, pero aumentan notablemente en enfermedades como el lupus eritematoso sistémico y el cáncer. Para empezar, añade 10 unidades por mililitro de heparina como anticoagulante en un tubo cónico de centrífuga de 15 mililitros.
Luego añade dos mililitros de T500 al 6% de dextrán en PBS. Obtén 10 mililitros de sangre de un voluntario adulto sano mediante venpuntura. En otro tubo centrifugador nuevo de 15 mililitros, añade cinco mililitros de medio de gradiente de densidad.
Extrae cuidadosamente el plasma sin tocar los eritrocitos y aplícalo sobre el medio para formar dos fases separadas. Centrifuga el tubo a 516 g durante 20 minutos a cuatro grados Celsius. Para aislar los PBMC, aspira y descarta el plasma por encima de la banda de PBMC sin alterar las células.
Recoge la banda de la celda mononuclear entre el plasma y el medio, minimizando la recogida del medio. Añade 20 mililitros de PBS al tubo que contiene PBMCs, luego centrifuga a 400 g durante cinco minutos a cuatro grados Celsius. Aspira cuidadosamente el sobrenadante y raspa el tubo para separar el pellet.
Añade 10 mililitros de PBS frío para resuspender las células. Para aislar neutrófilos, raspa el tubo para separar las células después de pipetear el medio. Luego añade 10 mililitros de PBS frío.
Ahora transfiere las celdas a un tubo cónico cónico nuevo de 50 mililitros y centrifugadora. Aspira el sobrenadante y raspa el tubo de nuevo. Ahora pipetea 10 mililitros de solución hipotónica fría en el tubo y mezcla suavemente.
Mezcla suavemente durante exactamente un minuto. Añade rápidamente 10 mililitros de solución hipertónica fría para que la solución sea isotónica. Luego cuenta los neutrófilos usando una cámara de Neubauer y asegúrate de que la pureza sea mayor al 95%. Centrifuga la suspensión para obtener un pellet celular.
Luego vuelve a suspender el pellet en PBS frío. Centrifuga las células mononucleares de la sangre periférica a 400 g durante cinco minutos a cuatro grados Celsius. Tras retirar el sobrenadante, resuspende las células en 120 microlitros de tampón de lavado en frío.
Luego pipeteo 35 microlitros de microperlas magnéticas CD66b a la suspensión celular. Incuba la mezcla en la oscuridad a cuatro grados Celsius durante 30 minutos. Ahora pipetea un mililitro de buffer de lavado en frío al tubo.
Centrifuga el tubo a 400 g durante tres minutos. Raspa el tubo para separar la cápsula celular después de retirar el sobrenadante. Y resuspendiendo las células en un mililitro de tampón de lavado.
Coloca una columna de separación magnética sobre un imán. Añade 0,5 mililitros de buffer de lavado a la columna, permitiendo que pase completamente. Transfiere un mililitro de las celdas resuspendidas a la columna y deja que el tampón pase gota a gota.
Después del lavado, transfiere la columna a un tubo microcentrífuga. Luego se pipetea un mililitro de tampón de lavado en la columna. Ahora inserta el émbolo en la parte superior de la columna.
Aplica presión suavemente para eluir las células. Luego quita el émbolo y coloca la columna sobre un tubo nuevo para microcentrífuga. Añade otro mililitro de buffer de lavado a la columna.
Luego vuelve a insertar el émbolo y aplica presión suavemente para eluir las células restantes. Centrifuga ambos tubos de microcentrífuga a 800 g durante tres minutos. Resuspende los plínulos celulares de ambos tubos en un mililitro de PBS frío.
Mantén la suspensión de la celda sobre hielo. Resuspende las células purificadas en un tampón de marcado hecho de suero bovino fetal al 1% en PBS. Transfiere 250 microlitros de la suspensión a un tubo microcentrífuga de 1,5 mililitros.
Añade los anticuerpos correspondientes contra las moléculas de membrana neutrófila al tubo. Luego incuba las células durante 30 minutos a cuatro grados Celsius, protegidas de la luz. Ahora pieta un mililitro de PBS al tubo.
Haz girar el tubo en una microcentrífuga a 800 g durante tres minutos. Aspira el sobrenadante. Golpea el tubo para romper el perdigón.
Y resuspende las células en 0,5 mililitros de paraformaldehído al 1%. Luego mantén las células a cuatro grados Celsius, protegidas de la luz hasta el análisis mediante citometría de flujo. Analizar las muestras mediante citometría de flujo, capturando 10.000 eventos por muestra.
Los neutrófilos de baja densidad en individuos sanos representaban aproximadamente el 5% de las células mononucleares de la sangre periférica, mientras que el protocolo de aislamiento magnético descrito produjo neutrófilos de baja densidad con aproximadamente un 98% de recuperación. Los neutrófilos expresan los marcadores de membrana CD10, CD11b, CD15, CD62L y CD66b. Los neutrófilos de baja densidad purificados magnéticamente expresaban los mismos marcadores de membrana que los neutrófilos.
Los neutrófilos purificados de baja densidad exhibían un núcleo multilobulado y eran similares en tamaño a los neutrófilos. Tanto los neutrófilos como los neutrófilos de baja densidad generaban especies reactivas de oxígeno en respuesta a la estimulación del PMA, siendo los neutrófilos de baja densidad los que producían niveles más altos que los neutrófilos. Los neutrófilos de baja densidad liberaron trampas extracelulares neutrófilas en respuesta a la estimulación de PMA, como se evidencia en la colocalización del ADN con elastasa y con citrulina.
Tanto neutrófilos purificados como neutrófilos de baja densidad liberaron NETs con cinética y cantidades similares tras el tratamiento con PMA. Nuestro protocolo proporciona una forma rápida y reproducible de obtener neutrófilos de baja densidad altamente puros y funcionales. Abordamos la falta de un protocolo estandarizado y eficiente en tiempo para el aislamiento de neutrófilos de baja densidad de la sangre humana.
Este protocolo no requiere formación especial para instrumentos complejos, y además es más económico y rápido que FACS.
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Visión general
Este estudio se centra en los neutrófilos de baja densidad (LDN) encontrados en las células mononucleares de sangre periférica, que son raros en individuos sanos pero aumentan significativamente en varias enfermedades. El artículo presenta un método práctico para aislar LDN puros y viables mediante técnicas de centrifugación de gradiente de densidad y separación magnética.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología celular
- Inmunología
Fundamentos
- Los neutrófilos de baja densidad están asociados con enfermedades como el lupus eritematoso sistémico y el cáncer.
- Entender los LDN puede proporcionar información sobre sus roles en los mecanismos de la enfermedad.
- El aislamiento de LDN es crucial para estudiar sus funciones y potencial terapéutico.
- Los métodos actuales para el aislamiento de LDN pueden no producir células puras y viables.
Propósito del estudio
- Caracterizar las funciones de los neutrófilos de baja densidad.
- Definir el papel de los LDN en varias enfermedades.
- Presentar un método eficiente para aislar LDN de la sangre periférica.
Métodos utilizados
- Uso de heparina como anticoagulante en la recolección de sangre.
- Aplicación de dextran T500 para la separación de gradiente de densidad.
- Incubación con microperlas magnéticas para la clasificación celular.
- Separación de LDN usando columnas magnéticas.
Resultados principales
- El método aísla exitosamente neutrófilos de baja densidad puros y viables.
- Los LDN pueden ser caracterizados por sus roles funcionales en la enfermedad.
- Una mayor comprensión de los LDN puede conducir a mejores estrategias terapéuticas.
- La técnica de aislamiento puede aplicarse a diversos entornos de investigación.
Conclusiones
- El aislamiento de LDN es esencial para estudiar su impacto en la salud y la enfermedad.
- El método presentado mejora la pureza y viabilidad de las células aisladas.
- La investigación adicional sobre los LDN puede contribuir a avances en inmunología y enfoques terapéuticos.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Efficient isolation of low-density neutrophils (LDN) addresses a critical bottleneck in immunology-focused drug discovery, enabling robust functional studies of disease-associated neutrophil subpopulations. This rapid magnetic-microbead method delivers high-purity, viable LDN, supporting mechanistic de-risking and target validation in autoimmune, oncology, and infectious disease pipelines. Scalable, reproducible LDN purification enhances predictive confidence for translational biomarker and preclinical model development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of LDN-mediated disease mechanisms and immune pathway clarification.
- Supports biological de-risking by isolating functionally intact LDN for hypothesis testing.
- Facilitates target validation by providing pure cell populations for downstream assays.
Screening & Assay Development
- Prepares validated LDN samples for quantitative flow cytometry and functional assays.
- Improves assay reproducibility and standardization through high-purity cell isolation.
- Accelerates screening readiness by reducing isolation time and preserving cell viability.
Translational & Preclinical Research
- Enables disease-relevant functional studies of LDN in autoimmune, cancer, and infection models.
- Supports continuity from discovery to preclinical validation by providing scalable LDN yields.
- Facilitates omics and biomarker analyses aligned with translational research objectives.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling rapid, reproducible LDN isolation for mechanistic studies, assay development, and translational research.
- Discovery Biology: Provides a platform for hypothesis testing and immune pathway analysis using purified LDN.
- Screening: Delivers standardized, viable LDN for quantitative flow cytometry and functional readouts.
- Analytics: Supports robust measurement of LDN marker expression and functional outputs such as ROS and NET formation.
- Translational Research: Aligns with biomarker and disease model development by enabling scalable LDN purification.
- Enterprise Reuse: Offers a reproducible, time-efficient protocol adaptable across disease areas and research teams.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in immune cell studies.
- Operational Value: Standardizes LDN isolation, improving reproducibility and scalability for high-throughput workflows.
- Strategic Value: Enables faster go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk in immunology portfolios.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of immune targets and translational biomarker programs.
Implementation Considerations
- Requires basic cell biology expertise and standard laboratory instrumentation.
- Utilizes magnetic separation columns and flow cytometry for validation.
- Enables cross-team standardization due to protocol simplicity and reproducibility.
- Adaptable to various disease models and sample volumes for scalable studies.
- Limited by the need for specific antibodies and magnetic bead reagents.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:26
Isolation of Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMCs) and Neutrophils from Human Blood
2:55
Purification of Low-Density Neutrophils (LDNs) Using Magnetic Microbeads
4:59
Multicolor Flow Cytometry Staining and Analysis of Purified Neutrophils
6:13
Results
7:43
Conclusion
