Identificación y clasificación de variantes de cambio de sentido de la subunidad del receptor GABA_A específicas de la posición por su papel en las neuronas piramidales del hipocampo

Nuestro estudio se basa en la idea de que las mutaciones epileptogénicas y proximales predichas en las subunidades del receptor GABA-A pueden afectar de manera similar al modelo de neuronas piramidales CA1. Exploramos esto a través de un marco multiescala. Los experimentos de laboratorio son esenciales para descubrir la verdad, pero no pueden capturar completamente la diversidad y complejidad de la vida en todas las escalas, desde moléculas hasta organismos. Hay demasiadas posibilidades, ese es el problema.

Nuestro protocolo y hallazgos allanaron el camino para un entorno computacional que se puede utilizar para explorar el impacto de los polimorfismos, como los polimorfismos de la subunidad del receptor GABA-A en la función neuronal.

Nuestro estudio plantea nuevas preguntas sobre hasta qué punto las variantes patógenas predichas y las mutaciones epileptogénicas muestran propiedades similares, y cómo estas relaciones pueden capturarse y simularse de manera efectiva.

Nuestro enfoque actual está en la función del microcircuito de la corteza entorrinal-hipocampo. Buscaremos modelos animales in vivo y modelos de microcircuitos computacionales para explorar el control septal en este circuito, especialmente en trastornos neuropsiquiátricos.

[Narrador] Para comenzar, abra el archivo de Excel original que contiene los datos genéticos y elimine las columnas innecesarias del archivo, dejando solo cuatro columnas, GRCh38Cromosoma, GRCh38Ubicación, Nombre y Cambio de proteína, antes de guardar el archivo como data1.xlsx en el directorio de trabajo relevante para el software R. Para una mayor limpieza y formateo de datos, abra el software R y RStudio. A continuación, abra el script de R Data_GABAA R. Establezca el directorio de trabajo y cargue las bibliotecas necesarias haciendo clic en el botón Ejecutar. Cargue el archivo de datos e inicie la limpieza de datos de las columnas que requieren este proceso. Limpie y combine aún más los datos en una columna, separados por un solo espacio. Cree un nuevo marco de datos para la salida combinada y agregue el ID de variante de transcripción de conjunto deseado. Escriba el resultado en un nuevo archivo de Excel llamado data1output.xlsx. Para construir un modelo biofísico de una sinapsis GABAérgica en una neurona piramidal del hipocampo basada en conductancia múltiple, instale Brian 2 e importe los paquetes necesarios. Diseñe el modelo basado en la conductancia definiendo la cinética de activación del canal iónico, los parámetros pasivos y activos y las conductancias postsinápticas. Utilice las conductancias modificadas de tipo Hodgkin-Huxley para las neuronas piramidales del hipocampo. Ajuste la distribución de densidad de los canales de sodio dependientes de voltaje para soma, segmento inicial de axón, nodos de Ranvier y dendritas. Establezca las conductancias de los canales de sodio y potasio como cero en los segmentos mielinizados. Cinética de activación de canales iónicos incorporada para canales de sodio y potasio dependientes de voltaje. Introducir corrientes sinápticas como la suma de todas las sinapsis glutamatérgicas y GABAérgicas en un compartimento. Incluya tanto la corriente mediada por el receptor AMPA rápido como la corriente mediada por el receptor NMDA lento en la corriente glutamatérgica. Incluya solo corriente mediada por receptor GABA rápido en corriente GABAérgica. Suponga que se libera una cantidad constante de glutamato a la sinapsis por cada pico presináptico. Por lo tanto, la activación de los receptores depende del tiempo de pico, y las conductancias totales de los receptores, G-AMPA y G-NMDA, reflejan la cantidad de glutamato que libera cada evento. Establezca los parámetros morfológicos utilizando el diámetro medido experimentalmente para soma y neuritas, y la longitud de cada compartimento de neuritas y patrones de ramificación. Reduzca la morfología neuronal real en un modelo multicompartimental dividiendo la célula en múltiples compartimentos que conserven con precisión la estructura de ramificación principal y mantengan la simetría bilateral. Determinar los parámetros biofísicos para el modelo de sinapsis GABAérgica evaluando las mediciones de control de tipo salvaje obtenidas previamente e importándolas para usarlas en el modelo. Defina las constantes de tiempo de ascenso y desactivación para la corriente postsináptica mediada por el receptor GABA-A. Diseñar la topología del modelo neuronal y asignar parámetros morfológicos y biofísicos, lo que incluye especificar la disposición espacial y las interconexiones de los compartimentos en función de la información morfológica y de ramificación obtenida previamente. Asigne los parámetros morfológicos apropiados, como la longitud y el diámetro del segmento, y los parámetros biofísicos a cada compartimento del modelo. Cree la actividad presináptica usando SpikeGeneratorGroup. Conecte el generador de picos al compartimento de destino de la neurona modelo mediante la clase Synapses para modelar conexiones sinápticas. Establezca una corriente constante sostenida de 0,85 nanoamperios y coloque el electrodo en el soma para imitar la actividad subumbral impulsada por la carga de corriente iónica de referencia en un momento dado. Para crear monitores de grabación, registre trazas de tensión de compartimentos de destino mediante StateMonitor. Finalmente, construya la red y ejecútela. Los trenes de picos neuronales bajo una sola entrada glutamatérgica distal y la inhibición somática GABAérgica revelaron los resultados de activación de los receptores GABA-A mutantes y de tipo salvaje. La mutación beta-3N110D alteró la inhibición, lo que provocó que la activación de las neuronas se bloqueara en la entrada excitatoria de Glu-S1 después del cuarto pico presináptico, con un breve retraso postsináptico. La mutación gamma-2K328M también afectó la inhibición con la activación de neuronas que ocurre alrededor del quinto pico de Glu-S1, y con un retraso postsináptico más largo que beta-3N110D. Bajo la entrada sináptica dual, la mutación gamma-2P302L causó una activación casi sincronizada con la entrada apical medial de Glu-S2, lo que probablemente refleja una suma tardía de Glu-S1. La mutación beta-3T288N exhibió un patrón similar con picos alineados con las entradas de Glu-S2 y un segundo pico que apareció casi en sincronía. La mutación beta-3N110D en condiciones de entrada dual desencadenó picos para casi todas las entradas excitatorias excepto las dos primeras, con intervalos entre picos notablemente más cortos. El mutante gamma-2K328M mostró un patrón de disparo comparable, pero no respondió a la segunda y tercera entradas excitatorias. En condiciones de entrada de triple excitación, los mutantes beta-3N110D y gamma-2K328M respondieron a casi todos los picos presinápticos, disparando pares de picos en respuesta al impulso excitatorio acumulativo.