Imágenes tridimensionales de tejido tumoral mediante el enfoque de blanqueamiento iterativo que extiende la multiplexidad

Esta investigación se centra en la identificación de dianas para fármacos inmunomoduladores y tumores gastrointestinales sólidos complejos. El análisis del panorama celular del microambiente tumoral es absolutamente crucial para comprender la susceptibilidad a tratamientos como la inmunoterapia. La secuenciación unicelular y la citometría de flujo ayudan a caracterizar el microambiente tumoral, pero carecen de contexto espacial. Recientemente, han surgido plataformas de imágenes multiplex y transcriptómicas para estudiar el microambiente tumoral en su contexto in vivo.

Las tecnologías multiplex disponibles para analizar el microambiente tumoral, ya sean iterativas o todo en uno, están restringidas a dos dimensiones. Este protocolo extiende la caracterización a la dimensión de profundidad, proporcionando información más allá de las secciones individuales de FFPE o congeladas.

[Narrador] Para comenzar, transfiera las hojas de tejido a una taza de muestra que contenga medio de cosecha tibio y colóquela en una placa calefactora en la mesa de preparación. Monte el tejido en plataformas en una placa de 15 centímetros que contenga medio de cosecha. Coloque con cuidado el tejido portador del tumor con el lado mesotelial hacia arriba sobre el lado del orificio pequeño de la plataforma y asegúrelo con una sutura de seda 2-0. Coloque la plataforma de tejido preparada sumergida inversamente en una placa de 24 pocillos que contenga medio de cosecha. Para la fijación, agregue 10 mililitros de material fijador a un tubo cónico de 50 mililitros que contenga 30 mililitros de PBS frío para preparar 40 mililitros de tampón de fijación. Con fórceps, transfiera el tejido montado en plataformas al tampón de fijación. E incubar durante 24 horas a 4 grados centígrados. Decantar el fijador. Reemplácelo con 40 mililitros de PBS frío. E incubar durante 10 minutos a 4 grados centígrados. Para la tinción, agregue 1 mililitro de tampón de bloqueo en un pocillo e inserte la plataforma de tejido. Bloquee durante al menos dos horas a temperatura ambiente en un balancín ajustado a una velocidad baja de 30 RPM. Preparar 0,8 mililitros de solución de colorante de anticuerpos en un tubo de microcentrífuga y centrifugar a 10.000 g durante dos minutos a temperatura ambiente. Transfiera 0,75 mililitros del sobrenadante a un pocillo limpio de una placa de incubación de 9 pocillos. E inserte una plataforma lavada. Envuelve el plato en papel de aluminio. E incube durante al menos dos horas a temperatura ambiente en un balancín a una velocidad baja de 30 RPM. Lave la plataforma en un tubo cónico de 50 mililitros que contenga 40 mililitros de PBS durante 10 minutos a 4 grados centígrados. Agregue 0.1 mililitros de PBS al centro del fondo de vidrio de un plato de imágenes de 3.5 centímetros y déjelo a un lado. Atornille el anillo de ajuste de altura sin apretar en el sentido de las agujas del reloj en la tapa exterior. Y monte la plataforma en el soporte de plástico interior, asegurando la alineación de la ranura de la muesca. Asegure la plataforma con el control deslizante. Coloque el adaptador de imagen ensamblado en el plato inferior de vidrio y baje con cuidado el anillo de ajuste de altura hasta que el tejido toque el tampón. Una vez que se alcanza la distancia óptima del vidrio, agregue 0,2 mililitros de PBS sobre el tejido con la parte inferior hacia arriba para evitar la deshidratación del tejido durante la obtención de imágenes. Inicie el software de adquisición de imágenes. Seleccione el objetivo apropiado, como 20X o 40X, y agregue el medio de inmersión correspondiente. Elija los parámetros de adquisición de imágenes, como una velocidad de escaneo de 600 hercios, una resolución XY de 1024 por 1024 píxeles, promedios de tres líneas y un escaneo bidireccional. Seleccione las líneas láser apropiadas o ajuste el láser de luz blanca para que coincida con los espectros de excitación y emisión de los fluoróforos utilizados para la tinción. Coloque el plato de imágenes ensamblado en el soporte de muestras en la platina del microscopio. Centre la muestra con el control XY, acerque el objetivo al cubreobjetos e inicie la adquisición de imágenes. Después de cada ronda de imágenes, realice un paso de blanqueamiento. Prepare 5 mililitros de 1,5 miligramos por mililitro de solución de borohidruro de litio en agua destilada e incube durante 30 minutos a temperatura ambiente. Transfiera 1 mililitro de la solución de borohidruro de litio a un pocillo limpio de la placa de incubación de 9 pocillos e inserte la plataforma lavada durante 60 minutos a temperatura ambiente. Lave brevemente la plataforma en 20 mililitros de PBS dentro de un tubo cónico. Compruebe si hay la señal fluorescente restante utilizando la configuración láser más alta para la compensación Z. Aquí se muestra una muestra peritoneal portadora de tumor teñida con la primera ronda de blanqueamiento iterativo que extiende la multiplexidad, o IBEX 1, panel para visualización. Las lesiones tumorales se identificaron como estructuras en forma de roseta que eran doblemente positivas para CD44 y podoplanina con arreglos nucleares característicos del mesotelioma papilar. Aquí se muestran imágenes de inmunofluorescencia de alta resolución de regiones seleccionadas de la muestra peritoneal portadora del tumor. Estas imágenes revelan regiones tumorales e interfaces de estructura linfoide terciaria tumoral, destacando la infiltración constante de células inmunitarias con una alta densidad de células CD45 positivas. Esta figura presenta la tinción de inmunofluorescencia iterativa en los ciclos IBEX uno a seis, ilustrando la distribución espacial de los marcadores inmunológicos y estructurales dentro de la lesión tumoral y la interfaz de la estructura linfoide terciaria tumoral. Aquí se presentan las proyecciones máximas de diferentes secciones ópticas. Estas imágenes en 3D confirmaron que las lesiones tumorales y las estructuras linfoides terciarias residen a diferentes profundidades Z, lo que demuestra las limitaciones de las imágenes en 2D para capturar la arquitectura de tejidos complejos.