Name: Imágenes tridimensionales de tejido tumoral mediante el enfoque de blanqueamiento iterativo que extiende la multiplexidad (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-04-25T13:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 16 s
Description: Aprende a realizar inmunofluorescencia multiplex en 3D para caracterizar la arquitectura de metástasis peritoneales mediante blanqueamiento iterativo. Este protocolo revela la distribución espacial de marcadores inmunitarios y estructurales en el microambiente tumoral.

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</ol>

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor Plus 750 Phalloidin</td><td>Invitrogen</td><td>A30105</td><td>Colorante de actina F</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anticuerpo CD206 (MMR) antihumano</td><td>BioLegend</td><td>Anticuerpo 321114</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Anticuerpo CD31 antihumano</td><td>BioLegend</td><td>303110</td><td>anticuerpo</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anticuerpo CD4 antihumano</td><td>BioLegend</td><td>300519</td><td>anticuerpo</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anti-humano HLA-DR Anticuerpo</td><td>BioLegend</td><td>307656</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anti-ratón/humano Anticuerpo CD44</td><td>BioLegend</td><td>Anticuerpo 103016</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 anticuerpo anti-CD45 humano</td><td>BioLegend</td><td>304060</td><td>anticuerpo</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Anticuerpo anti-calretinina [EP1798]</td><td>Abcam</td><td>ab214244</td><td>anticuerpo</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 anti-anti-humano CD3</td><td>Anticuerpo BioLegend</td><td>300416</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 anticuerpo CD8 humano Anticuerpo</td><td>BioLegend</td><td>344726</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo Alexa Fluor 647 anticuerpo antipodoplanina</td><td>humana BioLegend</td><td>Anticuerpo 337007</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Anticuerpo anti-vimentina</td><td>BioLegend</td><td>Anticuerpo 677807</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Anticuerpo CD68 (KP1)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-20060AF647</td><td>anticuerpo</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 750 Citoqueratina, anticuerpo pan (AE-1/AE-3)</td><td>Novus</td><td>NBP2-33200AF750</td><td>anticuerpo</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 750 Anticuerpo de actina del músculo liso alfa humano</td><td>R& </td><td>Anticuerpo</td>D <td>IC1420S</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 CD20 Anticuerpo monoclonal (L26) eBioscience</td><td>Anticuerpo Thermo Fisher</td><td>53-0202-82</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotico-Antimicótico</td><td>Gibco</td><td>15240096</td><td>medio de cosecha de suplementos</td></tr><tr><td>BioMed Clear Resin (Form 3)</td><td>Resina FormLabs</td><td>RS-F2-BMCL-01</td><td>utilizada para plataforma + placa de incubación</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A7906-500g</td><td>Componente de solución de bloqueo</td></tr><tr><td>Material acrílico fundido de 1/32" de espesor</td><td></td><td></td><td>utilizado para cortar el deslizador</td></tr><tr><td>CleanStation DT3&nbsp;</td><td>Posprocesamiento Stratasys</td><td>DT3</td><td>para ajustador de altura y tapa exterior</td></tr><tr><td>Contenedor, muestra&nbsp;</td><td>McKesson</td><td>870203</td><td>transferencia de tejido de la mesa de perforación a la mesa de preparación</td></tr><tr><td>CorelDraw&nbsp;</td><td>CorelDRAW</td><td></td><td>Software para preparar el archivo de diseño basado en vectores para el corte por láser</td></tr><tr>Plato <td>fijador</td><td>Cytofix</td><td>BD Bioscience</td><td>554655</td></tr><tr><td>plato de 15 cm</td><td>Falcon</td><td>353025</td><td>plato utilizado durante el montaje</td></tr><tr><td>Plato de 35 mm Nº 1,5 Cubreobjetos de 14 mm Diámetro del vidrio Sin recubrimiento</td><td>Plato de imagen</td><td>Matek</td><td>P35G-1.5-14-C</td></tr><tr><td>DMEM (sin glucosa)</td><td>Gibco</td><td>11966025</td><td>medio de cosecha</td></tr><tr><td>Fc Block</td><td>BD Bioscience</td><td>564220</td><td>componente de solución de bloqueo</td></tr><tr><td>Form 3B +</td> <td>Formlabs</td><td>Form 3B +</td> <td>impresora utilizada para plataforma + placa de incubación</td></tr><tr><td>Form Cure</td><td>Formlabs</td><td>FH-CU-01</td><td>posprocesamiento para plataforma + placa de incubación</td></tr><tr><td>Form Wash</td><td>Formlabs</td><td>FH-WA-01</td><td>posprocesamiento para plataforma + placa</td></tr> <tr>de incubación<td>GrabCAD Print</td><td>GrabCAD</td><td>GrabCAD</td><td>Software de impresión para preparar modelos para impresoras Stratasys</td></tr><tr><td>Hoechst 33342 10 mg/mL</td><td>Tinte nuclear</td><td>de biotio</td><td>40046</td></tr><tr><td>J826 Prime Impresora 3D</td><td>Stratasys</td><td>J826</td><td>utilizada para el ajustador de altura y la tapa exterior</td></tr><tr><td>LAS X</td><td>Leica</td><td>LAS X</td><td>Software confocal</td></tr><tr><td>Sistema de corte por láser&nbsp;</td><td>Universal Laser Systems</td><td>ULS PLS6.150D</td><td>CO2 Corte por láser utilizado para el deslizador</td></tr><tr><td>Litio-borohidruro</td><td>STREM Chemicals</td><td>93-0397</td><td>producto químico blanqueador</td></tr><tr><td>PBS, pH 7.4</td><td>Base de 10010023 Gibco</td><td></td><td>Tampón para lavar, bloquear, teñir</td></tr><tr><td>PreForm</td><td>FormLabs</td><td>PreForm</td><td>Software para preparar modelos para impresoras Formlab</td></tr><tr><td>Suturas de seda 2-0&nbsp;</td><td>Ethicon</td><td>A305. O35</td><td>fijar tejido a la plataforma</td></tr><tr><td>Microscopio confocal Stellaris 8 WLL</td><td>Leica</td><td>STELLARIS 8</td><td>Confocal Imaging</td></tr><tr><td>Jeringa filtro</td><td></td><td></td><td>filtro ab solución Triton</td></tr><tr><td>X-100</td><td>American Bio</td><td>AB02025-00100</td><td>reactivo permeabelizante, componente de solución de bloqueo</td></tr><tr><td>Vero ContactClear</td><td>Stratasys</td><td>CTT610,</td><td>resina de 4 KG utilizada para el ajustador de altura y la tapa exterior</td></tr><tr><td>Bandeja de calentamiento</td><td>Spring USA</td><td>ST-1220</td><td>mantiene calientes los medios y los tejidos</td></tr><tr><td>Agua, destilada</td><td>Diluyente Gibco</td><td>15230-170</td><td>para LiBH4</td></tr></tbody></table>

imágenes tridimensionales de tejido tumoral mediante el enfoque de blanqueamiento iterativo que extiende la multiplexidad

Three-Dimensional Imaging of Tumor-Bearing Tissue Using the Iterative Bleaching Extends Multiplexity Approach

El peritoneo es una estructura membranosa de menos de 1 mm de espesor que recubre la superficie de la pared abdominal y es contigua a las superficies de los órganos abdominales. Está compuesto por mesotelio superficial y tejido conectivo subyacente que se intercala con células adiposas, linfocitos, macrófagos y fibroblastos, así como vasos sanguíneos y linfáticos. Las neoplasias malignas peritoneales suelen provenir de metástasis tumorales abdominales (p. ej., cáncer de ovario o cáncer gástrico)18 o, con menor frecuencia, pueden ser tumores primarios del peritoneo (p. ej., mesotelioma)19. Estas lesiones tumorales, a menudo pequeñas (&lt;1 cm), son muy complejas, pero se pueden caracterizar en 3D mediante la técnica descrita. Se utiliza una proyección máxima de cinco secciones confocales para ver toda la muestra montada en una plataforma (Figura 4, recuadro en la esquina superior izquierda). Se utilizaron tres anticuerpos primarios conjugados (AF488-CD44, AF594-CD45 y AF647-Podoplanin) junto con el colorante nuclear Hoechst para la primera ronda de IBEX (IBEX1, Figura 4). Las lesiones tumorales se hacen evidentes por las estructuras en forma de roseta que son doblemente positivas para CD44 y Podoplanin y muestran una disposición de núcleos característica del mesotelioma papilar.
Las células tumorales se identificaron utilizando la morfología celular y dos anticuerpos, ya que tanto la anti-Podoplanina como la anti-CD44 reconocen a las células no tumorales, como lo demuestra la detección de vasos linfáticos a través de la anti-Podoplanina y la unión del anticuerpo CD44 a subconjuntos de células inmunitarias. A continuación, se capturan las regiones de interés (ROI) más pequeñas mediante un formato de escaneo de mosaicos de mayor resolución en tamaños de paso Z optimizados para representar proyecciones 3D (Figura 5A). Las plataformas se sometieron a los procedimientos de tinción iterativos y se obtuvieron imágenes de los mismos ROI en los ciclos 1-6 de IBEX. En la Figura 5B-M se reúnen imágenes representativas de las interfaces tumoral (recuadro amarillo) y de la estructura linfoide terciaria tumoral (TLS) (recuadro azul). 
La presencia de TLS y la densidad de células CD3 positivas indican una infiltración significativa de células inmunitarias20 y una posible respuesta a los fármacos inmunomoduladores21. Cabe destacar que la TLS y la mayor parte de las lesiones tumorales están presentes en diferentes profundidades Z del tejido, como se demostró al comparar las proyecciones de pila de diferentes secciones ópticas en la Figura 6, lo que destaca los beneficios de las imágenes 3D y la posible pérdida de biología cuando las imágenes 2D se aplican a estructuras 3D. El carácter 3D de estas lesiones se hace más evidente en los archivos de la película (Película 1-12), que muestran representaciones en volumen de las lesiones individuales en la Figura 5.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67869/67869fig01.jpg"> 
Figura 1: Flujo de trabajo desde la impresión 3D hasta la obtención de imágenes en 3D de tumores peritoneales. El protocolo consiste en una secuencia de cinco pasos para preparar imágenes multiplexadas en 3D a partir de tejido peritoneal portador de tumores. (1) Impresión de plataformas receptoras de tejidos, piezas de adaptadores de imágenes y placa de incubación. (2) Procedimientos de obtención y montaje de tejidos. (3) Fijación con paraformaldehído. (4) Ciclos de tinción e imagen de IBEX. (5) Reconstrucción 3D mediante software de imagen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67869/67869fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67869/67869fig02.jpg"> 
Figura 2: Componentes de hardware con interfaz de tejido para imágenes 3D. (A) Diagrama esquemático del ensamblaje de la plataforma dentro del adaptador de imágenes. (B) Una placa de incubación de 9 pocillos. (C) Fotografías de los componentes del adaptador de imagen con el montaje. (D) Peritoneo portador de mesotelioma observado durante la laparoscopia diagnóstica. (E) Montaje de tejido en la plataforma. (F,G) Peritoneo portador de tumores montado sobre plataformas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67869/67869fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67869/67869fig03.jpg"> 
Figura 3: Esquema de la línea de tiempo de los ciclos del IBEX. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67869/67869fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67869/67869fig04.jpg"> 
Figura 4: Vista general de la plataforma después de la incubación con el panel IBEX1. Máxima proyección de toda la plataforma tras la incubación con panel IBEX1 (Hoechst, AF488-CD44, AF594-CD45 y AF647-Podoplanin). El círculo discontinuo resalta el tumor. Recuadro: Fotografía del peritoneo portador de tumores montada en la plataforma de imagen. Barra de escala: 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67869/67869fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67869/67869fig05.jpg"> 
Figura 5: Imágenes de inmunofluorescencia de alta resolución de regiones seleccionadas de la plataforma. (A) Proyección máxima de la imagen combinada de 56 mosaicos Z-stack adquirida después de la incubación con el panel IBEX1 (Hoechst, AF488-CD44, AF594-CD45 y AF647-Podoplanin). Rectángulo amarillo: lesión tumoral mostrada en paneles (B-G). Rectángulo azul: interfaz entre el tumor y la estructura linfoide terciaria mostrada en (H-M). (B-G) Una lesión tumoral individual con panel IBEX 1-6 en representación volumétrica. (B) IBEX1, verde: CD44, rojo: CD45, cian: Podoplanin. (C) IBEX2, verde: CD20, rojo: F-actina, cian: CD3. (D) IBEX3, verde: CD8, rojo: CD4, cian: panCK. (E) IBEX4, verde: CD31, cian: CD68. (F) IBEX5, verde: CD206, cian: Calretinina. (G) IBEX6, verde: Vimentina, rojo: HLADR. (H-M) Una interfaz de estructura linfoide terciaria tumoral individual con el panel IBEX 1-6 en representación de volumen. (H) IBEX1, verde: CD44, rojo: CD45, cian: Podoplanin. (I) IBEX2, verde: CD20, rojo: F-actina, cian: CD3. (J) IBEX3, verde: CD4, rojo: panCK, cian: CD8. (K) IBEX4, verde: CD31, rojo: SMA, cian: CD68. (L) IBEX5, verde: CD206, cian: calretinina. (M) IBEX6, verde: HLADR, cian: Vimentina. Todos los paneles, azul: Hoechst. Barras de escala: (A, 1 mm); (B-M, 250 μm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67869/67869fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67869/67869fig06.jpg"> 
Figura 6: Imágenes 2D simuladas. La comparación de proyecciones limitadas (10 secciones ópticas) y de pila completa (102 secciones ópticas) confirma la pérdida de contexto tisular en la simulación 2D. (A) Proyección máxima de las secciones 30-40 (10 μm). (B) Proyección máxima de las secciones 85-95 (10 μm). (C) Proyección máxima de las secciones 1-102 (~100 μm). Todos los paneles, IBEX2 (Hoechst, AF488-CD20, AF647-CD3, AF790-faloidina). Barra de escala: 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67869/67869fig06large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Tabla 1: Anticuerpos utilizados para los paneles individuales de IBEX. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67869/Table%201_IBEX%20panels.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta tabla.</a>
Vídeo 1: Representación animada del volumen de la lesión individual con el panel IBEX 1 (azul: Hoechst, verde: CD44, rojo: CD45, cian: Podoplanin). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67869/Movie1_IBEX1.mp4" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para descargar esta película.</a>
Vídeo 2: Representación animada del volumen de la lesión individual con el panel IBEX 2 (azul: Hoechst, verde: CD20, rojo: F-actina, cian: CD3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67869/Movie2_IBEX2.mp4" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para descargar esta película.</a>
Vídeo 3: Representación animada del volumen de la lesión individual con el panel IBEX 3 (azul: Hoechst, verde: CD8, rojo: CD4, cian: panCK). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67869/Movie3_IBEX3.mp4" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para descargar esta película.</a>
Vídeo 4: Representación animada del volumen de la lesión individual con el panel IBEX 4 (azul: Hoechst, verde: CD31, cian: CD68). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67869/Movie4_IBEX4.mp4" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para descargar esta película.</a>
Vídeo 5: Representación animada del volumen de la lesión individual con el panel 5 del IBEX (azul: Hoechst, verde: CD206, cian: calretinina). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67869/Movie5_IBEX5.mp4" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para descargar esta película.</a>
Vídeo 6: Representación animada en volumen de la lesión individual con el panel IBEX 6 (azul: Hoechst, verde: Vimentin, rojo: HLADR). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67869/Movie6_IBEX6.mp4" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para descargar esta película.</a>
Vídeo 7: Renderizado animado en volumen de la interfaz estructura-lesión linfoide terciaria con el panel 1 de IBEX (azul: Hoechst, verde: CD44, rojo: CD45, cian: Podoplanin). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67869/Movie7_TLS_IBEX1.mp4" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para descargar esta película.</a>
Vídeo 8: Representación animada en volumen de la interfaz estructura-lesión linfoide terciaria con el panel 2 de IBEX (azul: Hoechst, verde: CD20, rojo: F-actina, cian: CD3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67869/Movie8_TLS_IBEX2.mp4" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para descargar esta película.</a>
Vídeo 9: Renderizado animado en volumen de la interfaz estructura-lesión linfoide terciaria con el panel 3 de IBEX (azul: Hoechst, verde: CD8, rojo: CD4, cian: panCK). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67869/Movie9_TLS_IBEX3.mp4" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para descargar esta película.</a>
Vídeo 10: Renderizado animado en volumen de la interfaz estructura-lesión linfoide terciaria con el panel 4 de IBEX (azul: Hoechst, verde: CD31, rojo: SMA, cian: CD68). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67869/Movie10_TLS_IBEX4.mp4" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para descargar esta película.</a>
Vídeo 11: Representación animada en volumen de la interfaz estructura-lesión linfoide terciaria con el panel 5 de IBEX (azul: Hoechst, verde: CD206, cian: calretinina). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67869/Movie11_TLS_IBEX5.mp4" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para descargar esta película.</a>
Vídeo 12: Renderizado animado en volumen de la interfaz estructura-lesión linfoide terciaria con el panel 6 de IBEX (azul: Hoechst, verde: Vimentin, rojo: HLADR). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67869/Movie12_TLS_IBEX6.mp4" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para descargar esta película.</a>
Archivo complementario 1: Archivo de impresión de la placa de incubación. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67869/incubation_plate.form" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Archivo complementario 2: Archivo de impresión para las 36 plataformas individuales. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67869/platform_x36.form" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Archivo complementario 3: Archivo de impresión para el anillo de ajuste de altura. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67869/SMART_imaging_heightAdjuster.STL" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Archivo complementario 4: Archivo de impresión para la tapa exterior. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67869/SMART_imaging_petriDishLid_35mm.STL" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Archivo complementario 5: Archivo cortado con láser para el control deslizante. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67869/imaging_platform_slider.DWG" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

Imágenes tridimensionales de tejido tumoral mediante el enfoque de blanqueamiento iterativo que extiende la multiplexidad

The spatial heterogeneity of the tumor microenvironment (TME) is a critical determinant of therapeutic response, particularly for immune-oncology agents, ...

three-dimensional-imaging-tumor-bearing-tissue-using-iterative

Research

Investigación

JoVE Journal

Cancer Research

Investigación del cáncer

Una visión global de las técnicas involucradas en la generación de un modelo de ratón de cáncer oral y el control cuantitativo de la invasión del tumor dentro de la lengua a través de multi-fotón microscopio de las células marcadas se presenta. Este sistema puede servir como una plataforma útil para la evaluación molecular y la eficacia de los medicamentos de compuestos anti-invasiva.

Multi-fotón imágenes de invasión de células tumorales en un modelo de ratón ortotópico de carcinoma oral de células escamosas

Masas de tejido complejo, de órganos a los tumores, se componen de diversos elementos celulares. Hemos dilucidado la contribución de los fenotipos celulares dentro de un tejido utilizando ratones transgénicos fluorescentes de múltiples etiquetados en combinación con la tinción de inmunofluorescencia seguido de multiparamétrico desmezcla espectrales de descifrar origen celular, así como características de células basado en la expresión de proteínas.

Análisis Cuantitativo multiespectrales después de un trasplante de tejido fluorescente para la visualización de los Orígenes celulares, tipos y Interacciones

Combinatorias 5 proteínas fluorescentes de marcado de las células madre y progenitoras hematopoyéticas permite in vivo seguimiento clonal a través confocal y microscopía de dos fotones, que proporciona conocimientos sobre la médula ósea hematopoyética arquitectura durante la regeneración. Este método permite la correlación de destino no invasiva de las células derivadas de HSPCs espectralmente-codificados en tejidos intactos durante largos períodos de tiempo después del trasplante.

En Tracking Clonal vivo de madre hematopoyéticas y células progenitoras Marcado por cinco proteínas fluorescentes utilizando confocal y Microscopía Multifotónica

Este protocolo describe el uso de la microscopía multifotónica para realizar extendida time-lapse de las interacciones multicelulares en tiempo real, en vivo a una resolución de una sola célula.

Prolongado lapso de tiempo intravital de imágenes de tiempo real multicelular Dinámica en el microambiente tumoral

Tomografía de coherencia óptica (OCT), una tecnología de imagen tridimensional, fue utilizada para monitorear y caracterizar la cinética de crecimiento de esferoides multicelulares tumor. Cuantificación volumétrica precisa de esferoides tumorales usando un voxel contando el enfoque y la detección de tejido libre de etiqueta muerto en esferoides basado en contraste intrínseco atenuación óptica, fueron demostrados.

Longitudinal control morfológico y fisiológico de esferoides tumorales tridimensional mediante tomografía de coherencia óptica

Aquí describimos un método para la toma de imágenes multifotonas de lapso de tiempo de alta resolución de células tumorales cerebrales antes y después de una intervención quirúrgica invasiva (por ejemplo, biopsia) dentro del mismo animal vivo. Este método permite estudiar el impacto de estos procedimientos quirúrgicos invasivos en el comportamiento migratorio, invasivo y proliferativo de las células tumorales a un nivel de células únicas.

Imagen intravital longitudinal del comportamiento de las células tumorales cerebrales en respuesta a una biopsia quirúrgica invasiva

En la era de la inmunoterapia contra el cáncer, el interés en dilucidar la dinámica del microambiente tumoral ha aumentado sorprendentemente. Este protocolo detalla una técnica de imagen de espectrometría de masas con respecto a sus pasos de tinción e imagen, que permiten un análisis espacial altamente multiplexado.

Ampliación de la comprensión del microambiente tumoral mediante imágenes de espectrometría de masas de muestras de tejido fijadas en formalina e incrustadas en parafina

Aquí presentamos una técnica de ultrasonido 5D que combina la reconstrucción 3D multiplanar y la fusión Doppler color, que permite la visualización sincrónica de la información estructural y funcional de la tiroides. Al minimizar los puntos ciegos, este método permite una localización rápida y precisa de las lesiones para mejorar la precisión del diagnóstico, lo que beneficia especialmente a los profesionales novatos.

Reconstrucción triplanar sincrónica integrada con mapeo Doppler color para una localización precisa y rápida de lesiones tiroideas

Se obtuvieron imágenes cuantitativas de mapas cuantitativos de oxígeno en 3D de tumores murinos de forma no invasiva mediante resonancia paramagnética de electrones de pulso. Para la anatomía y la estructura vascular se utilizaron el ultrasonido en modo B y el Doppler de potencia. Las imágenes de ambas modalidades se superpusieron para el análisis tumoral multiparamétrico.

Evaluación de la hipoxia tumoral: imágenes de oxígeno en 3D in vivo mediante resonancia paramagnética electrónica 

Aquí, describimos la aplicación del método de blanqueo iterativo que extiende la multiplicidad (IBEX) utilizando tinciones de tejidos automatizadas disponibles comercialmente y consideraciones de optimización para el uso de reactivos basados en amplificación de señales de tiramida.

El blanqueo iterativo amplía la multiplicidad con el uso de la automatización de tinción para instalaciones centrales

La implementación de una técnica de fotoirradiación versátil y de bajo coste con el método manual IBEX permite obtener una imagen óptima del tejido humano con una importante autofluorescencia nativa. Este protocolo detalla cómo obtener imágenes multiplexadas de portaobjetos completos a partir de muestras clínicas archivadas utilizando un microscopio invertido, reactivos ampliamente disponibles y software de código abierto para la alineación y el procesamiento de imágenes.

El flujo de trabajo optimizado para el blanqueo iterativo amplía la obtención de imágenes de multiplexidad de muestras clínicas altamente autofluorescentes

Aprende a realizar inmunofluorescencia multiplex en 3D para caracterizar la arquitectura de metástasis peritoneales mediante blanqueamiento iterativo. Este protocolo revela la distribución espacial de marcadores inmunitarios y estructurales en el microambiente tumoral.

Imágenes tridimensionales de tejido tumoral mediante el enfoque de blanqueamiento iterativo que extiende la multiplexidad

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