Plataforma de imagen óptica multimodal para el estudio del metabolismo celular

Nuestra investigación consiste en aprovechar nuestro microscopio multimodal para medir las diferencias moleculares y metabólicas en varias patologías y visualizar su heterogeneidad espacial. El enfoque multimodal de las imágenes ópticas nos permite identificar los cambios fisiopatológicos desde una variedad de perspectivas. El enfoque multimodal de la microscopía óptica está ampliando continuamente sus aplicaciones, especialmente en el entorno clínico, donde el desarrollo de microendoscopios ha abierto una vía para la obtención de imágenes clínicas.

Los desafíos experimentales actuales radican en la complejidad de incorporar todo el hardware entre sí, lo cual es parte de la razón por la que utilizamos un sistema de microscopio hecho a medida. Mediante el uso de nuestra plataforma de imágenes ópticas multimodales, hemos logrado avances significativos en el estudio de enfermedades bioortogonales sin marcaje, incluida la clasificación de diferentes subtipos de cáncer de mama y el análisis del metabolismo de los lípidos en el cerebro de Drosophila y ratón. Con nuestras imágenes ópticas multimodales sin etiquetas, podemos visualizar el metabolismo, la morfología y la composición molecular simultáneamente, lo cual es una herramienta poderosa para investigar enfermedades y el proceso de envejecimiento.

Para comenzar, caliente el láser y espere aproximadamente de 15 a 20 minutos. Encienda la caja de control, seguido del controlador del panel táctil, el adaptador de CA para el control remoto láser principal y el adaptador de CA para el control remoto subláser, luego encienda el detector de fotodiodos de silicio y el amplificador de bloqueo. Configure el sistema láser con un haz de bombeo sintonizable de 780 nanómetros a 990 nanómetros, con un ancho de pulso de cinco a seis picosegundos y una tasa de repetición de 80 megahercios.

El rayo láser stokes debe tener una longitud de onda fija de 1031 nanómetros, con un pulso de seis picosegundos y una tasa de repetición de 80 megahercios. Asegúrese de que tanto la bomba como los haces de avivamiento estén a baja potencia, al menos 20 milivatios para que sean visibles en la placa de alineación. Aplique aceite al condensador de aceite de alta apertura numérica.

Monte el portaobjetos del microscopio en el condensador de aceite y coloque una gota de agua grande en el portaobjetos del microscopio para el objetivo de agua 25X. Ajuste la etapa Z para ajustar el enfoque hasta que la imagen de campo claro brillante de la muestra biológica sea visible bajo el objetivo de agua 25X. Comience el proceso de imagen en la secuencia correcta para evitar el fotoblanqueo.

Para cambiar rápidamente entre MPF y SHG, cambie de la viga de la bomba a la viga de bombeo fija. Seleccione la resolución de la imagen de 512 por 512 píxeles. Establezca el tiempo de permanencia en ocho microsegundos por píxel para MPF y SHG, con un fotograma medio superior a tres.

Utilice 40 microsegundos por píxel con un fotograma medio de dos para la modalidad SRS. Para adquirir autofluorescencia con MPF, apague el rayo láser de avivamiento. Ajuste el láser de la bomba a 800 nanómetros para excitar el NADH y la flavina.

Adquiere la señal de la fibra de colágeno usando SHG. Apague el rayo láser de la bomba y solo use el rayo láser de avivamiento a una potencia de 500 milivatios. Obtener la distribución espacial de proteínas y lípidos mediante SRS.

Mantenga ambos rayos láser encendidos y ajuste la frecuencia del rayo láser para que coincida con el modo vibratorio específico para cada molécula. Para adquirir los conjuntos de datos de imágenes hiperespectrales SRS, seleccione el modo suite y establezca el rango de longitud de onda de 781,3 nanómetros a 806,5 nanómetros. Elija un número de pila de al menos 60 y capture la pila de imágenes hiperespectrales.

Guarde todas las imágenes de las mismas regiones de interés en la misma carpeta y asegúrese de que el formato de la imagen sea un archivo OIR de Olympus. Las imágenes de autofluorescencia y SRS capturaron con éxito información metabólica y estructural del tejido pulmonar humano. El análisis radiométrico de la relación redox óptica y la relación de insaturación de lípidos proporcionó distribuciones espaciales de la actividad metabólica y la composición molecular en el tejido pulmonar humano.

La comparación cuantitativa del estrés oxidativo y la insaturación de lípidos entre tejido sano y tumoral revela diferencias en los estados metabólicos.