Protocolos experimentales de cribado, inmunocitoquímica y técnicas de imagen basadas en microscopía para Penium margaritaceum

Nuestra investigación se centra en el papel de la pared celular en el mantenimiento de la forma celular y la respuesta al estrés externo. Utilizamos una gama de técnicas de microscopía óptica y microscopía de barrido láser confocal para obtener imágenes de la estructura de la pared celular en células vivas y microscopía electrónica para obtener imágenes de alta resolución de las paredes celulares.

Falta la falta actual de líneas celulares transformadas para algas estreptofitas que expresen proteínas subcelulares específicas para resaltar la dinámica de la pared celular. Esto requiere el uso de anticuerpos y otras sondas fluorescentes para su estudio. La pared celular de Penium responde a diversas formas de estrés abiótico y biótico, y esto conduce a la plasticidad fenotípica. Hemos descubierto que las pectinas de la pared celular son una parte importante de este proceso. El fenotipo unicelular y la capacidad de realizar el marcaje de células vivas con Penium ofrece a los biólogos de plantas la oportunidad de profundizar en la estructura y el desarrollo de la pared celular.

[Instructor] Para comenzar, retire cinco mililitros de cultivos celulares líquidos de Penium margaritaceum en crecimiento activo. Transfiera a un tubo de centrífuga de plástico de 15 mililitros, luego centrifugue. Después de verter el sobrenadante, vuelva a suspender el gránulo en cinco mililitros de WHM fresco. Asegure bien la tapa del tubo y agite vigorosamente el tubo durante 10 segundos para volver a suspender el gránulo y eliminar cualquier sustancia polimérica extracelular de la superficie de la pared celular. Después del lavado final, vuelva a suspender el gránulo en un mililitro de WHM fresco, luego transfiera 200 alícuotas de microlitros de la suspensión celular a tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Centrifugar los tubos de tapón en la microcentrífuga a 1000 G durante un minuto, luego aspirar el sobrenadante y volver a suspender el pellet en 400 microlitros de WHM fresco. A continuación, agregue 20 microlitros de anticuerpo monoclonal diluido a la suspensión celular y al pozo de vórtice. Luego, envuelva el tubo en papel de aluminio e incube en un rotador de laboratorio durante 90 minutos. Centrifugar la suspensión, aspirar el sobrenadante y volver a suspender el pellet en 500 microlitros de WHM fresco antes de agitar en vórtice durante 10 segundos. Después de la centrifugación final, vuelva a suspender el pellet en 400 microlitros de WHM y agregue ocho microlitros de cabra anti-rata TRITC o FITC. Finalmente, vuelva a suspender el pellet en 100 microlitros de medio de cultivo. Tape el tubo y envuélvalo en papel de aluminio hasta que esté listo para la imagen. Diluya las células marcadas con el anticuerpo JIM5 diez veces en WHM. Agregue una gota de 50 microlitros de la suspensión celular diluida en un cubreobjetos. Incube las células durante dos minutos en la oscuridad para permitir la adherencia celular, luego pipetee con cuidado un mililitro de WHM gota a gota para enjuagar las células no adheridas. Agregue 30 microlitros de WHM encima de las celdas adjuntas. Superponga la gota con 30 microlitros de agarosa tibia al 4% en WHM y deje que se solidifique. Para muestras en una placa de Petri, agregue suficiente WHM para cubrir completamente las células incluidas en agarosa. Para las celdas en un cubreobjetos, invierta el cubreobjetos y colóquelo suavemente sobre un portaobjetos de depresión lleno de WHM. Monte las células preparadas en un microscopio fluorescente. Instale una lámpara externa o use la iluminación incorporada del microscopio para apoyar el crecimiento y el movimiento celular. Capture imágenes cada 10 a 30 minutos utilizando el conjunto de filtros TRITC para realizar un seguimiento de la expansión de la pared celular. Prepare un tubo que contenga cinco mililitros de cultivos celulares lavados de 10 a 14 días. A continuación, agregue aproximadamente 100 microlitros de perlas fluorescentes de 0,75 micrómetros en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Pipetea un mililitro de WHM en el tubo y agita vigorosamente para volver a suspender las perlas. Centrifugar el tubo a 10.000 G durante tres minutos. Vuelva a suspender el pellet final en 500 microlitros de WHM. A continuación, pipetee un mililitro de medio WHM en cada pocillo de una placa de 12 pocillos. Agregue inhibidores o reguladores de crecimiento para lograr la concentración deseada y gire suavemente la placa. Agregue 10 microlitros de la solución de perlas y vuelva a agitar suavemente para mezclar, luego agregue 10 microlitros de células lavadas a cada pocillo antes de mezclar. Incube la placa durante 24 horas a la luz. Sin alterar la placa, colóquela en un microscopio de fluorescencia invertida equipado con un filtro FITC. Pipetee un mililitro de una suspensión celular en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Centrifugar el tubo a 4.000 G durante un minuto. Después de desechar el sobrenadante, sumerja el tubo que contiene el gránulo en nitrógeno líquido o congele a menos 80 grados centígrados. Vuelva a suspender el pellet descongelado en 20 microlitros de WHM. Coloque una gota de la suspensión de células densas en un cubreobjetos de 45 por 50 milímetros. Coloque un segundo cubreobjetos encima de la gota para crear un sándwich. Presione continuamente el sándwich durante 30 segundos para romper las celdas. Separe con cuidado los cubreobjetos. Agregue WHM sobre los cubreobjetos para lavar las celdas rotas en un tubo de centrífuga de 15 mililitros y centrifugar. Examine la bolita blanca o ligeramente verde después de desechar el sobrenadante. Vuelva a suspender el gránulo que contiene las paredes celulares en agua desionizada. Después de la ruptura celular y la centrifugación, vuelva a suspender el gránulo en 100 microlitros de agua desionizada antes de transferirlo a un tubo de centrífuga de 1,5 mililitros. A continuación, coloque cinta de carbón en la superficie de un trozo de Cambridge. Pipetee cinco gotas de microlitros de la suspensión de la pared celular resuspendida en la cinta de carbono. Use el objetivo de paladio para cubrir el talón durante 50 segundos después de dejarlo secar durante la noche. Observe las celdas a cinco kilovoltios, con un tamaño de punto apropiado ubicado a 10 centímetros del detector de electrones secundario. El etiquetado de la pared celular de P. margaritaceum con anticuerpos monoclonales anti-pectina reveló una red de fibras complejadas de calcio que forman un patrón de red irregular. La pectina se depositó en el centro celular o istmo, empujando la pectina más vieja hacia los polos. El etiquetado de JIM7 mostró que la pectina metilesterificada alta se secretó inicialmente en una banda estrecha en el istmo. Otros polímeros en la pared celular, como la proteína arabinogalactano, se detectaron con el anticuerpo monoclonal JIM13. Se secretaron grandes cantidades de sustancias poliméricas extracelulares fuera de la pared celular, lo que permitió el deslizamiento y la agregación celular. Las técnicas de etiquetado permitieron estudios cuantitativos de la pared celular y la expansión, integrando enfoques de imágenes de desarrollo. Los estudios estructurales correlativos revelaron que la red típica de pectina estaba compuesta por una malla de fibras que terminaban externamente en distintas proyecciones. El tratamiento con altas concentraciones de calcio transformó la red de pectina en depósitos irregulares, como se observó en las células marcadas con JIM5. Cuando se examinaron las paredes celulares tratadas con calcio bajo microscopía electrónica de barrido, se observó en detalle la estructura desorganizada de la pectina.