Modelo tisular tridimensional de alto rendimiento para la cuantificación de umbrales de electroporación

Nuestra investigación se centra en el uso de electroporación, específicamente pulsos bipolares de microsegundos, para tratar el cáncer. Actualmente estamos estudiando la ablación de tejidos blandos, pero también estamos pasando a la transfección in vivo utilizando estos pulsos. Nuestro protocolo le permite tener una visualización más eficiente de los umbrales de electroporación irreversibles y reversibles.

También puede ser un poco mejor que un sistema basado en cubos porque nos permite ver en 3D en lugar de en un entorno 2D. Y un entorno 3D sería mucho más similar a lo que veríamos en el tejido. En el futuro, intentaremos traducir lo que vemos en este modelo in vivo, y lo que este modelo realmente está haciendo es informar las elecciones de parámetros que vamos a hacer cuando intentemos administrar cosas como vacunas de ADN, quimioterapias, así como sistemas CRISPR-Cas9.

Para comenzar, coloque la suspensión celular y los reactivos necesarios en un gabinete de bioseguridad. Mezcle bien la suspensión celular preparada con la solución de colágeno bovino tipo 1 en una proporción de 1:1. Coloque la mezcla en hielo o en un baño de perlas frías para evitar la polimerización prematura.

Luego, pipetee 500 microlitros de la solución combinada para cubrir el fondo de cada pocillo de una placa de 12 pocillos. Gire suavemente la placa para asegurarse de que el gel entre en contacto con las paredes de cada pocillo. Incube los geles en una incubadora humidificada a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono durante 6 horas o hasta que los geles se vuelvan firmes.

A continuación, incline la placa del pocillo y agregue suavemente 500 microlitros de medio de cultivo a cada pocillo, dejando que se deslice por la pared de la placa. Retire la conexión de señuelo de plástico de dos agujas de jeringa de punta roma de acero inoxidable 304 de 1,64 milímetros. Deje una aguja a un lado para que sirva como electrodo de clavija.

Para la otra aguja, aplana los últimos 5 milímetros de un extremo. Luego, corte una sección de un tubo de acero inoxidable 316 con un diámetro de 19 milímetros lo suficientemente largo como para colocarlo al ras contra el fondo de una placa de pocillos para crear el electrodo anular. Diseñe un portaelectrodos utilizando software CAD para ajustar los componentes del electrodo.

Coloque los electrodos de anillo y pasador en el soporte del electrodo para ensamblar el electrodo y presione la aguja con el extremo aplanado en el soporte para asegurar el electrodo del anillo. En un gabinete de bioseguridad, incline la placa preparada y aspire 400 microlitros de medio de cultivo de cada pocillo. Agregue 20 microlitros de 5 microgramos por microlitro de solución plásmida de proteína fluorescente verde a los pocillos aspirados.

Gire suavemente la placa para asegurarse de que la solución se extienda uniformemente por la superficie del gel. Incube los geles en una incubadora humidificada a 37 grados Celsius con un 5% de dióxido de carbono durante 10 minutos. A continuación, inserte la sonda de temperatura de fibra óptica en el electrodo de clavija y comience a registrar la temperatura.

Conecte el cable positivo del electroporador al electrodo de clavija y el cable negativo a la aguja, asegurando el electrodo de anillo. Ahora encienda la placa caliente y caliente los geles para mantener una temperatura de 37 grados centígrados. A continuación, inserte el anillo y el electrodo de clavija montados con la sonda de temperatura en el pocillo y asegúrese de que el gel ha alcanzado una temperatura de 37 grados centígrados.

Active el electroporador para administrar el tratamiento. Luego agregue 100 microlitros de medio de cultivo a los geles que parezcan secos y continúe electrooperando los geles no tratados. Una vez completados todos los tratamientos, incube los geles en una incubadora humidificada a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono durante 10 minutos.

Después de la incubación, agregue suavemente 500 microlitros de medio de cultivo a cada pocillo a lo largo de la pared de la placa. Incube los geles nuevamente en la incubadora humidificada durante 24 horas. Incline la placa y aspire el medio de cultivo de cada pocillo.

Luego, agregue suavemente 500 microlitros de PBS a cada pocillo a lo largo de las paredes de la placa. Incube los geles en una incubadora humidificada a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono durante 5 minutos. Luego, aspire el PBS de cada pocillo.

Agregue suavemente 500 microlitros de PBS a cada pocillo dejando que se deslice por la pared de la placa. Gire suavemente la placa, luego inclínela y aspire el PBS de cada pocillo. Ahora, agregue 100 microlitros de PBS fresco a cada pocillo para mantener los geles hidratados para obtener imágenes.

Luego, obtenga imágenes de la placa utilizando técnicas estándar de microscopía fluorescente. Después de la obtención de imágenes, agregue 500 microlitros de medio de cultivo a cada pocillo de la placa e incube durante 24 horas. Repita el flujo de trabajo completo de imágenes y recuperación para cada punto de tiempo designado.

Después de crear un modelo computacional, use el software del microscopio para medir el diámetro de los bordes externo e interno de la región en forma de toroide a lo largo de los ejes vertical y horizontal. Promedie los diámetros exterior e interior respectivamente y divida por 2 para calcular los radios correspondientes. Finalmente, utilizando la tabla de búsqueda creada anteriormente, derive la intensidad del campo eléctrico en los radios medidos.

El radio exterior de la región transfectada se utilizó para cuantificar la electroporación reversible o el umbral RE correlacionándolo con las intensidades del campo eléctrico de un modelo computacional. Mientras que el radio interior se utilizó para determinar la electroporación irreversible o umbral de IRE. Los tres protocolos de pulso bipolar de microsegundos dieron como resultado regiones de transfección en forma de toroide con límites de RE e IRE claramente visibles.

Entre las formas de onda probadas, la forma de onda balanceada de ráfaga 2-1-1 generó el umbral IRE más alto, mientras que la forma de onda desequilibrada 2-1-1 mostró el más bajo. Un protocolo de electroporación monopolar estándar que utilizó 420 voltios dio como resultado una región de transfección circular con un umbral de RE de 642 voltios por centímetro, pero no produjo la muerte celular, lo que impidió la determinación del umbral de IRE. La deformación del tejido con el tiempo debido a la degradación del gel hizo que las regiones transfectadas perdieran su forma circular, lo que dificultó la cuantificación precisa de RE e IRE.

La desalineación de los electrodos de anillo y pasador con el fondo del pocillo también produjo patrones de transfección asimétricos no circulares, lo que complica la medición del umbral.