Clonación de lanzadera basada en CRISPR: un método de clonación de alto rendimiento
13 de junio de 2025
Describimos un protocolo para un método de clonación de alto rendimiento, la clonación de lanzadera basada en CRISPR (clonación CRISPRshuttle), que permite la transferencia de fragmentos de ADN de interés entre vectores sin necesidad de amplificación por PCR de los fragmentos de ADN.
Describimos nuestro protocolo para un método de clonación de alto rendimiento, CRISPRshuttle. Lo que implica la transferencia de fragmentos de ADN diana entre vectores sin necesidad de amplificación por PCR de los fragmentos de ADN. Técnicas existentes como la infusión de puerta de enlace y la clonación de univectores, la amplificación por PCR. Este enfoque requiere procedimientos específicos de fragmentos, incluido el diseño primario y la validación de secreciones. Estas etiquetas requieren mucha mano de obra y mucho tiempo. La lanzadera CRISPR elimina la PCR mientras transfiere fragmentos de ADN objetivo entre vectores a reacciones secuenciales de tubo de ensayo. Este método supera la necesidad de manipulación específica de fragmentos y, por lo tanto, acelera la construcción de muestras.
[Narrador] Para comenzar, prepare una mezcla maestra para un número determinado de reacciones de digestión combinando los reactivos que se muestran en la pantalla. Coloque los tubos de 0,2 mililitros debidamente etiquetados en un bloque de enfriamiento de aluminio sobre hielo. Prepare la mezcla maestra para un número N de reacciones mezclando cantidades adecuadas de CAS9, sgRNA 10, tampón CAS9 y agua tratada con DECC. Mezcle bien la mezcla maestra y gírela. Alícuota de 3,75 microlitros de la mezcla maestra en cada tubo de reacción. Agregue 0,75 microlitros de plásmido PLX 304 ORF micromolar 0,03 a cada tubo mezclado bien e incube los tubos a 37 grados centígrados durante una hora. Prepare una mezcla maestra combinando 0,14 microlitros de pBIDC-UASC-pLXvect linealizado micromolar y 1,8 microlitros de mezcla maestra de ensamblaje Gibson. Mezcle bien la mezcla maestra y gírela. Ahora alícuota 1,94 microlitros de la mezcla maestra en cada tubo. Agregue 1,66 microlitros de plásmido escindido CAS9 en cada tubo. Mezclar bien e incubar a 50 grados centígrados durante una hora. Descongele las células bacterianas competentes en hielo. Alícuotas de 10 microlitros de las células descongeladas en cada tubo de 1,5 mililitros preenfriado. Mezcle suavemente 10 microlitros de las células competentes con un microlitro de producto de ensamblaje Gibson. Coloque los tubos en hielo durante 30 minutos. Aplique un choque térmico a los tubos a 42 grados centígrados durante un minuto y luego enfríe con hielo durante dos minutos. Agregue 100 microlitros de medio SOC precalentado en cada tubo y agite a 250 RPM durante una hora a 37 grados centígrados. Finalmente, coloque las células en placas de agar LB que contengan 15 microgramos por mililitro de cloranfenicol e incube durante la noche a 37 grados centígrados. Esta figura muestra los resultados representativos del análisis de restricción de plásmidos UAS-cDNA/ORF generados utilizando el sistema CRISPRshuttle. En este análisis, la digestión de restricción de 15 construcciones de UAS-ADNc / ORF con PVU2 reveló que todas las muestras exhibieron los patrones de fragmentos esperados en aproximadamente 1072 pares de bases y 1.820 pares de bases.
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Visión general
Este artículo presenta un protocolo para un método de clonación de alto rendimiento conocido como clonación de lanzadera basada en CRISPR (clonación CRISPRshuttle). Esta técnica innovadora facilita la transferencia de fragmentos de ADN entre vectores sin la necesidad de amplificación por PCR.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Ingeniería genética
- Biología molecular
- Tecnología CRISPR
Antecedentes
- Los métodos de clonación tradicionales a menudo requieren amplificación por PCR.
- La tecnología CRISPR ha revolucionado la manipulación genética.
- Los métodos de alto rendimiento son esenciales para estudios a gran escala.
- La transferencia eficiente de vectores es crucial para varias aplicaciones.
Propósito del estudio
- Introducir un nuevo método de clonación.
- Simplificar el proceso de transferencia de fragmentos de ADN.
- Eliminar la necesidad de PCR en los procedimientos de clonación.
Métodos utilizados
- Desarrollo del protocolo de clonación CRISPRshuttle.
- Evaluación de la eficiencia en la transferencia de ADN.
- Comparación con métodos de clonación tradicionales.
- Aplicación del método en varios sistemas de vectores.
Resultados principales
- Transferencia exitosa de fragmentos de ADN entre vectores.
- Tiempo y recursos significativamente reducidos en comparación con los métodos PCR.
- Alta eficiencia demostrada en múltiples pruebas.
- Potencial para amplias aplicaciones en investigación genética.
Conclusiones
- La clonación CRISPRshuttle es una alternativa viable a los métodos tradicionales.
- Este método mejora la eficiencia en ingeniería genética.
- Estudios futuros pueden aprovechar esta técnica para manipulaciones genéticas complejas.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
High-throughput generation of genome-wide plasmid libraries is a critical enabler for systematic gene function studies and target validation in biopharma R&D. CRISPR-based shuttle cloning (CRISPRshuttle) eliminates PCR amplification, streamlining the transfer of DNA fragments between vectors and accelerating library construction. This capability enhances predictive confidence and operational efficiency at key discovery inflection points.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables rapid assembly of genome-scale plasmid libraries for functional genomics screens.
- Supports systematic interrogation of gene function across diverse biological pathways.
- Facilitates biological de-risking and robust target validation by enabling high-throughput construct generation.
- Improves predictive confidence for downstream target selection and triage.
Screening & Assay Development
- Prepares validated plasmid constructs for scalable screening workflows without PCR-induced sequence artifacts.
- Standardizes cloning outputs, supporting reproducibility and quantitative assay development.
- Accelerates readiness for high-throughput compound evaluation and phenotypic screening platforms.
- Enables efficient reuse of donor plasmid resources across multiple assay formats.
Translational & Preclinical Research
- Streamlines the generation of disease-relevant genetic constructs for preclinical model development.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling rapid construct iteration.
- Reduces technical bottlenecks in translational biomarker and mechanistic studies.
- Enhances risk-adjusted advancement decisions by providing robust genetic tools.
Pipeline & Workflow Integration
CRISPRshuttle cloning integrates at the interface of early discovery and lead identification, enabling seamless transition from hypothesis-driven gene selection to high-throughput construct generation and screening.
- Discovery Biology: Accelerates hypothesis testing and pathway mapping by enabling rapid, scalable cloning of gene targets.
- Screening: Delivers standardized, PCR-free constructs for reproducible assay development and screening campaigns.
- Analytics: Provides quantitative outputs on cloning efficiency and construct integrity, supporting data-driven decision making.
- Translational Research: Facilitates the generation of constructs for disease-relevant models and biomarker studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, high-throughput cloning platform for ongoing portfolio needs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in gene function studies.
- Operational Value: Delivers high efficiency (>94%) and scalability, enabling rapid library generation by small teams.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by accelerating construct availability.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of validated targets and assays.
Implementation Considerations
- Requires expertise in CRISPR/Cas9-mediated cleavage and Gibson assembly techniques.
- Needs access to compatible donor plasmids and CRISPRshuttle-ready vectors.
- Demands standardized protocols for cross-team reproducibility and data integrity.
- Adaptation may be needed for diverse vector backbones or organism-specific systems.
- Efficiency and throughput are dependent on reagent quality and workflow optimization.
