Name: Clonación de lanzadera basada en CRISPR: un método de clonación de alto rendimiento (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-13T13:20:00.000+00:00
Duration: 4 min 25 s
Description: Aprende el método de clonación CRISPRshuttle de alto rendimiento para transferir fragmentos de ADN entre vectores sin necesidad de PCR. Esta técnica optimiza la ingeniería genética y ahorra tiempo en el laboratorio.

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<ol><li>Hartley, J. L., Temple, G. F., Brasch, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+cloning+using+in+vitro+site-specific+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">DNA cloning using in vitro site-specific recombination.</a> Genome Res. 10 (11), 1788-1795 (2000).</li>
<li>Brasch, M. A., Hartley, J. L., Vidal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orfeome+cloning+and+systems+biology%3A+Standardized+mass+production+of+the+parts+from+the+parts-list%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Orfeome cloning and systems biology: Standardized mass production of the parts from the parts-list.</a> Genome Res. 14 (10B), 2001-2009 (2004).</li>
<li>Zhu, B., Cai, G., Hall, E. O., Freeman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-fusion+assembly%3A+Seamless+engineering+of+multidomain+fusion+proteins%2C+modular+vectors%2C+and+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">In-fusion assembly: Seamless engineering of multidomain fusion proteins, modular vectors, and mutations.</a> Biotechniques. 43 (3), 354-359 (2007).</li>
<li>Liu, Q., Li, M. Z., Leibham, D., Cortez, D., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+univector+plasmid-fusion+system%2C+a+method+for+rapid+construction+of+recombinant+DNA+without+restriction+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">The univector plasmid-fusion system, a method for rapid construction of recombinant DNA without restriction enzymes.</a> Curr Biol. 8 (24), 1300-1309 (1998).</li>
<li>Marsischky, G., Labaer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Many+paths+to+many+clones%3A+A+comparative+look+at+high-throughput+cloning+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Many paths to many clones: A comparative look at high-throughput cloning methods.</a> Genome Res. 14 (10b), 2020-2028 (2004).</li>
<li>Wei, P., Xue, W., Zhao, Y., Ning, G., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-based+modular+assembly+of+a+UAS-cDNA%2FORF+plasmid+library+for+more+than+5500+Drosophila+genes+conserved+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">CRISPR-based modular assembly of a UAS-cDNA/ORF plasmid library for more than 5500 Drosophila genes conserved in humans.</a> Genome Res. 30 (1), 95-106 (2020).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-based+shuttle+cloning+of+1%2C397+human+genes+into+UAS+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biochim+Biophys+Sin+%28Shanghai%29%22%5BJournal%5D)">CRISPR-based shuttle cloning of 1,397 human genes into UAS vectors.</a> Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). , (2025).</li>
<li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+public+genome-scale+lentiviral+expression+library+of+human+ORFs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A public genome-scale lentiviral expression library of human ORFs.</a> Nat Methods. 8 (8), 659-661 (2011).</li>
<li>Wang, J. W., Beck, E. S., Mccabe, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modular+toolset+for+recombination+transgenesis+and+neurogenetic+analysis+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A modular toolset for recombination transgenesis and neurogenetic analysis of Drosophila.</a> PLoS One. 7 (7), e42102(2012).</li>
<li>Christie, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+DNA+cleavage+using+CRISPR-SpRYgests%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Precise DNA cleavage using CRISPR-SpRYgests.</a> Nat Biotechnol. 41 (3), 409-416 (2023).</li>
<li>Li, S. Y., Zhao, G. P., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-brick%3A+A+new+standard+for+assembly+of+biological+parts+using+Cpf1%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">C-brick: A new standard for assembly of biological parts using Cpf1.</a> ACS Synth Biol. 5 (12), 1383-1388 (2016).</li>
<li>Lei, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CCTL+%28Cpf1-assisted+cutting+and+taq+DNA+ligase-assisted+ligation%29+method+for+efficient+editing+of+large+DNA+constructs+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The CCTL (Cpf1-assisted cutting and taq DNA ligase-assisted ligation) method for efficient editing of large DNA constructs in vitro.</a> Nucleic Acids Res. 45 (9), e74(2017).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Agar en polvo</td><td>Base química</td><td>KBS-001H</td><td></td></tr><tr><td>Agarosa</td><td>Sangon</td><td>A600014-0100</td><td></td></tr><tr><td>Sistema automatizado de análisis de imágenes digitales en gel</td><td>Tanon</td><td>Tanon-2500B</td><td></td></tr><tr><td>Cloranfenicol</td><td>Sangon</td><td>A100230-0010</td><td></td></tr><tr><td>Kit de extracción de gel E.Z.N.A.</td><td>Omega</td><td>D2500-02</td><td></td></tr><tr><td>E.Z.N.A. Mini Kit de ADN plasmídico I</td><td>Omega</td><td>D6942-02</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI-HF</td><td>NEB</td><td>R3101S</td><td></td></tr><tr><td>Mezcla maestra de ensamblaje Gibson</td><td>NEB</td><td>E2611S</td><td></td></tr><tr><td>Kit de síntesis de ARN rápido de alto rendimiento HiScribe T7</td><td>NEB</td><td>E2050</td><td></td></tr><tr><td>Mezcla maestra de ensamblaje de ADN de alta fidelidad NEBuilder</td><td>NEB</td><td>E2621X</td><td></td></tr><tr><td>Termociclador de PCR</td><td>Gen largo</td><td>T20</td><td></td></tr><tr><td>ADN polimerasa Platinum SuperFi II</td><td>Thermo Scientific</td><td>12361010</td><td></td></tr><tr><td>PvuII-HF</td><td>NEB</td><td>R3151L</td><td></td></tr><tr><td>Q5 Hot Start Mezcla maestra de alta fidelidad 2x</td><td>NEB</td><td>M0494</td><td></td></tr><tr><td>S. pyogenes Cas9</td><td>GenScript</td><td>Z03386</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de agitación</td><td>Zhichu</td><td>ZQLY-180V</td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotómetro</td><td>Shimadzu</td><td>BioSpec-nano</td><td></td></tr><tr><td>ADN ligasa T4</td><td>Promega</td><td>M1801</td><td></td></tr><tr><td>Trans 10 Célula químicamente competente</td><td>TransGen</td><td>CD101-02</td><td></td></tr><tr><td>Triptona</td><td>Oxoide</td><td>LP0042</td><td></td></tr><tr><td>XbaI</td><td>NEB</td><td>R0145S</td><td></td></tr><tr><td>Extracto de levadura</td><td>Oxoide</td><td>LP0021</td><td></td></tr></tbody></table>

clonación de lanzadera basada en crispr: un método de clonación de alto rendimiento

CRISPR-based Shuttle Cloning: A High-throughput Cloning Method

Utilizamos CRISPRshuttle para construir una colección de plásmidos UAS-cDNA/ORF que cubre 1.397 genes humanos que se conservan en Drosophila7. El análisis de restricción reveló que CRISPRshuttle alcanza una eficiencia del 94,5% para el uso de vectores de destino compatibles con CRISPRshuttle que contienen dos secuencias repetitivas y del 96,1% para el uso de vectores de destino sin secuencias repetitivas7. Nuestros datos demostraron que, en general, dos investigado...

Clonación de lanzadera basada en CRISPR: un método de clonación de alto rendimiento

The development of genome-wide plasmid libraries using existing genomic repositories serves as a pivotal prerequisite for systematic functional ...

Describimos nuestro protocolo para un método de clonación de alto rendimiento, CRISPRshuttle. Lo que implica la transferencia de fragmentos de ADN diana entre vectores sin necesidad de amplificación por PCR de los fragmentos de ADN. Técnicas existentes como la infusión de puerta de enlace y la clonación de univectores, la amplificación por PCR. Este enfoque requiere procedimientos específicos de fragmentos, incluido el diseño primario y la validación de secreciones. Estas etiquetas requieren mucha mano de obra y mucho tiempo. La lanzadera CRISPR elimina la PCR mientras transfiere fragmentos de ADN objetivo entre vectores a reacciones secuenciales de tubo de ensayo. Este método supera la necesidad de manipulación específica de fragmentos y, por lo tanto, acelera la construcción de muestras.[Narrador] Para comenzar, prepare una mezcla maestra para un número determinado de reacciones de digestión combinando los reactivos que se muestran en la pantalla. Coloque los tubos de 0,2 mililitros debidamente etiquetados en un bloque de enfriamiento de aluminio sobre hielo. Prepare la mezcla maestra para un número N de reacciones mezclando cantidades adecuadas de CAS9, sgRNA 10, tampón CAS9 y agua tratada con DECC. Mezcle bien la mezcla maestra y gírela. Alícuota de 3,75 microlitros de la mezcla maestra en cada tubo de reacción. Agregue 0,75 microlitros de plásmido PLX 304 ORF micromolar 0,03 a cada tubo mezclado bien e incube los tubos a 37 grados centígrados durante una hora. Prepare una mezcla maestra combinando 0,14 microlitros de pBIDC-UASC-pLXvect linealizado micromolar y 1,8 microlitros de mezcla maestra de ensamblaje Gibson. Mezcle bien la mezcla maestra y gírela. Ahora alícuota 1,94 microlitros de la mezcla maestra en cada tubo. Agregue 1,66 microlitros de plásmido escindido CAS9 en cada tubo. Mezclar bien e incubar a 50 grados centígrados durante una hora. Descongele las células bacterianas competentes en hielo. Alícuotas de 10 microlitros de las células descongeladas en cada tubo de 1,5 mililitros preenfriado. Mezcle suavemente 10 microlitros de las células competentes con un microlitro de producto de ensamblaje Gibson. Coloque los tubos en hielo durante 30 minutos. Aplique un choque térmico a los tubos a 42 grados centígrados durante un minuto y luego enfríe con hielo durante dos minutos. Agregue 100 microlitros de medio SOC precalentado en cada tubo y agite a 250 RPM durante una hora a 37 grados centígrados. Finalmente, coloque las células en placas de agar LB que contengan 15 microgramos por mililitro de cloranfenicol e incube durante la noche a 37 grados centígrados. Esta figura muestra los resultados representativos del análisis de restricción de plásmidos UAS-cDNA/ORF generados utilizando el sistema CRISPRshuttle. En este análisis, la digestión de restricción de 15 construcciones de UAS-ADNc / ORF con PVU2 reveló que todas las muestras exhibieron los patrones de fragmentos esperados en aproximadamente 1072 pares de bases y 1.820 pares de bases.

crispr-based-shuttle-cloning-a-high-throughput-cloning-method

Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Las metodologías de selección de genes se pueden utilizar para generar ratones transgénicos con alelos knockout, knock-in y marcados.  Aquí, describimos un método mejorado de recombinación en E. coli, que denominamos 'subclonación más inserción', que se puede utilizar para generar rápidamente vectores de orientación génica personalizados.

Subclonación Plus Inserción (SPI) - Un nuevo método recombinería para la rápida construcción de la orientación de genes Vectores

Usando el montaje de ADN, múltiples vectores de CRISPR pueden ser construidos en paralelo en una única reacción de clonación, por lo que la construcción de un gran número de vectores de CRISPR una tarea simple. Tomate raíces peludas son un excelente sistema modelo para validar vectores de CRISPR y generar materiales mutantes.

De alto rendimiento CRISPR vector de la construcción y caracterización de las modificaciones del ADN mediante la generación de raíces peludas tomate

La técnica de determinación del genotipo se describe aquí, que las parejas de reacción en cadena de la polimerasa fluorescente (PCR) para electroforesis capilar en gel, permite para el genotipado de alto rendimiento de clones knockout nucleasa mediada. Se evita limitaciones que enfrentan las otras técnicas de genotipificación y es más rentable que los métodos de secuenciación.

Usando una técnica fluorescente PCR-capilar Electroforesis en gel con el genotipo CRISPR / Cas9 mediada Knockout mutantes en un formato de alto rendimiento

Este protocolo describe los pasos para la clonación de múltiples ARN guía único en un guía de ARN concatemer vector, que es de uso particular en la creación de múltiples gen knockouts utilizando CRISPR / Cas9 tecnología. La generación de knockouts dobles en organoides intestinales se muestra como una posible aplicación de este método.

Un protocolo para múltiples genes Knockout en ratón Intestinal Organoids utilizando un CRISPR-concatemer

Aquí, una simple, eficaz y rentable método de clonación sgRNA se contornea.

RNA de la guía CRISPR clonación de mamíferos sistemas

Este manuscrito describe un método de CRISPR Cas9 basado en cluster regularmente otro corto palindrómico repite (CRISPR) simple y expedita investigación del papel de varios genes candidatos en la proliferación de células de leucemia mieloide aguda (AML) en paralelo. Esta técnica es escalable y puede ser aplicada en otras líneas celulares de cáncer así.

Investigación de las dependencias genéticas usando análisis CRISPR Cas9 basado en competencia

Este protocolo describe la transfección de plásmido de alto rendimiento de células de mamíferos en una placa de 384 pocillos utilizando tecnología de eyección de gotas acústicas. La dispensación y multiplexación de ADN, que consume mucho tiempo y propensa a errores, pero también la dosificación del reactivo de transfección, son impulsadas por software y realizadas por un dispositivo de nanodispensador. Las células son sembradas en estos pozos precargados.

Multiplexación y transfección de plasmión de ADN de alto rendimiento mediante tecnología de nanodispensación acústica

Este protocolo proporciona un método para facilitar la generación de cambios de nucleótidos heterocigotos u homocigotos definidos utilizando CRISPR-CAS9 en células madre pluripotentes humanas.

Generación de modificaciones genómicas definidas utilizando CRISPR-CAS9 en células madre pluripotentes humanas

Los sistemas CRISPR-Cas y las proteínas anti-CRISPR se integraron en el esquema de puertas booleanas en Saccharomyces cerevisiae. Los nuevos circuitos lógicos pequeños mostraron un buen rendimiento y profundizaron la comprensión de los factores de transcripción basados en dCas9 / dCas12a y las propiedades de las proteínas anti-CRISPR.

Circuitos digitales genéticos basados en sistemas CRISPR-Cas y proteínas anti-CRISPR

Presentamos un protocolo para el ensamblaje modular basado en CRISPR (CRISPRmass), un método para la construcción de alto rendimiento de la biblioteca de plásmidos UAS-cDNA/ORF en Drosophila utilizando recursos de cDNA/ORF disponibles públicamente. CRISPRmass se puede aplicar a la edición de varias bibliotecas de plásmidos.

Ensamblaje modular basado en CRISPR para la construcción de alto rendimiento de una biblioteca de plásmidos UAS-cDNA/ORF

La línea celular THP-1 se utiliza ampliamente como modelo para investigar las funciones de los monocitos/macrófagos humanos en diversas áreas de investigación relacionadas con la biología. Este artículo describe un protocolo para la ingeniería eficiente basada en CRISPR-Cas9 y el aislamiento de clones de una sola célula, lo que permite la producción de datos fenotípicos robustos y reproducibles.

Knockout génico mediado por CRISPR-Cas9 basado en electroporación en células THP-1 y aislamiento de clones de una sola célula

Aprende el método de clonación CRISPRshuttle de alto rendimiento para transferir fragmentos de ADN entre vectores sin necesidad de PCR. Esta técnica optimiza la ingeniería genética y ahorra tiempo en el laboratorio.

Clonación de lanzadera basada en CRISPR: un método de clonación de alto rendimiento

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