Name: Un protocolo para múltiples genes Knockout en ratón Intestinal Organoids utilizando un CRISPR-concatemer (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 53 s
Description: Aprende a clonar múltiples gRNAs en un vector CRISPR-concatemer para generar knockouts simultáneos en organoides intestinales de ratón. Este método mejora la eficiencia de estudios de pérdida de función en biología molecular.

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Damos las gracias a Christopher Hindley por la lectura crítica del manuscrito. AM es apoyado por Wntsapp (Marie Curie ITN), AA-R. Es apoyado por el Consejo de Investigación Médica (MRC), y BK.K. Y RM son apoyados por una beca Sir Henry Dale del Wellcome Trust y la Royal Society [101241 / Z / 13 / Z] y reciben apoyo a través de una donación central del Wellcome Trust y MRC al Wellcome Trust - MRC Cambridge Stem Cell Institute .

<html> 1. Diseño de gRNA para el CRISPR-concatemer Vector Nota: El objetivo de esta sección es explicar cómo optar por la mejor estrategia de orientación y cómo diseñar gRNAs que contengan salientes específicos para el vector CRISPR-concatemer. <ol><li> Diseñar gRNAs contra los genes de interés utilizando un CRISPR gRNA herramienta de diseño de elección. Vea la Tabla de Materiales para un ejemplo. NOTA: Al dirigir un par de genes paralogous, aunque es posible diseñar un gRNA por gen, es aconsejable diseñar dos gRNAs por gen para aumentar las posibilidades de lograr un doble knockout ( Figura 1 ). </li><li> Asegúrese de que los gRNA no contengan el sitio de reconocimiento de Bbs I utilizando una herramienta de asignación de restricciones (consulte la Tabla de materiales para ver un ejemplo). </li><li> Añadir específicos CRISPR-concatemer vector saltos a cada oligo, como se muestra en la Tabla 1 . </li></ol>&quot;Fo: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;fo: keep-with-next.within-page =&quot; siempre &quot;&gt; <tbody><tr><td></td><td> Cassette 1 </td><td> Cassette 2 </td><td> Cassette 3 </td><td> Cassette 4 </td></tr><tr><td> Secuencia (5&#39;-3 &#39;) </td><td> CACCGG [gRNA1] GT </td><td> ACCGG [gRNA2] G </td><td> CCGG [gRNA3] </td><td> ACACCGG [gRNA4] GTT </td></tr><tr><td> Secuencia (5&#39;-3 &#39;) </td><td> TAAAAC [RC-gRNA1] CC </td><td> AAAAC [RC-gRNA2] C </td><td> AAAC [RC-gRNA3] </td><td> CTAAAAC [RC-gRNA4] CCG </td></tr></tbody></table> Tabla 1: Voladizos para cada casete del vector CRISPR-concatemer. 2. Clonación de gRNAs en el CRISPR-concatemer Vector <ol><li> Fosforilación y recocido de oligos NOTA: Este paso ilustra cómo tO recolectar los hilos superiores e inferiores para cada oligo de gRNA y cómo fosforilar sus extremos en una sola reacción. <ol><li> Preparar la mezcla de reacción para fosforilar los oligos y recocer las hebras superior e inferior sobre hielo, siguiendo las instrucciones a continuación. NOTA: Todos los oligos se pueden agrupar en una reacción; Por ejemplo, en el caso de un vector de 4 gRNA-concatemer, unen juntos 8 oligos. </li><li> Para 3 concatemers, utilizar 3,0 μL de cadena superior de gRNA (1,0 μL de cada ARNg, 10 μM, 1 μL / ARNg), 3,0 μL de cadena de ARNg de fondo (1,0 μL de cada ARNg, 10 μM, 1 μL / ARNg), 2,0 μL de T4 DNA ligase buffer (10x), 1,0 μ l T4 PNK, y añadir H 2 O hasta el volumen total de 20,0 μ l. </li><li> Mezclar bien pipeteando y hacer funcionar este en un termociclador usando los siguientes ajustes: 37 ° C durante 30 min, 95 ° C durante 5 min, rampa hasta 25 ° C a 0,3 ° C / min, mantenga a 4 ° C. </li></ol></li><li> Reacción de barrido de Bbs I NOTA: En esta sección, los oligos de gRNA pre-recocido se incorporan en la posición apropiada del vector concatemer en una etapa alternando ciclos de digestión y ligación. <ol><li> Diluir la mezcla de reacción 1: 100 en agua libre de DNasa / RNasa para generar 3 y 4 vectores de concatenador de gRNA. NOTA: Cuando se clona 2 gRNA-concatemers este paso no es necesario. </li><li> Ensamble la reacción de barrido Bbs I en hielo, siguiendo las instrucciones a continuación. Incluir un control negativo que sólo contiene el vector. </li><li> Utilice 100 ng de vector CRISPR-concatemer, 10,0 l mezcla de oligo, 1,0 l de BSA-tampón que contiene la enzima de restricción (10x), 1,0 l de DTT (10 mM), 1,0 l ATP (10 mM), 1,0 l Bbs I, 1,0 l T7 ligasa , Y H $ ₂ $ O hasta un volumen total de 20,0 μl. </li><li> Mezclar bien pipeteando y ejecutar esto en un termociclador utilizando los siguientes ajustes: Ejecutar 50 ciclos para la clonación de 3 y 4 gRNA-concatemers y <sTrong&gt; 25 ciclos para 2 concatenadores de gRNA, tanto a 37 ° C durante 5 min, 21 ° C durante 5 min, mantenga a 37 ° C durante 15 min, luego 4 ° C para siempre. </li></ol></li><li> Tratamiento con exonucleasa NOTA: Este paso es muy recomendable ya que aumenta la eficiencia de la clonación al eliminar cualquier rastro de ADN linealizado. <ol><li> Tratar la reacción de barrido de Bbs I con una exonucleasa de ADN (véase la Tabla de Materiales ) como sigue. </li><li> Tomar 11,0 μL de mezcla de ligación del paso anterior (2.2.3), agregar 1,5 μl de tampón de exonucleasa (10x), 1,5 μl de ATP (10 mM), 1,0 μl de exonucleasa de ADN y aumentar el volumen total a 15,0 μl con agua. Incubar a 37 ° C durante 30 min seguido de 70 ° C durante 30 min. NOTA: Este paso elimina cualquier ADN lineal residual en la mezcla y aumenta así la eficacia de la clonación. </li><li> Utilizar 2 μl de la mezcla de reacción para la transformación enBacterias E. coli tienda por el choque térmico 12 . NOTA: Alternativamente, la reacción se puede almacenar durante hasta una semana a -20 ° C. </li></ol></li><li> Digestión de restricción NOTA: El objetivo de este paso es evaluar por digestión de restricción el éxito del procedimiento de clonación. <ol><li> Para confirmar la presencia de insertos de gRNA en el vector CRATP-concatemer, recoger 4 a 8 colonias bacterianas con un bucle de inoculación, cultivar cada clon en 4 ml de medio LB durante la noche a 37ºC en un agitador orbital. Extraer el ADN utilizando un kit de miniprep de plásmido de acuerdo con las instrucciones del fabricante (ver Tabla de Materiales ). </li><li> Digerir ~ 200 ng de ADN con 10 U EcoR I + 5 U Bgl II en una reacción de 10 μL incubándolo a 37 ° C durante 3 h en un incubador de bacterias. Incluir una mezcla de reacción separada con el vector original correspondiente como un control positivo para la comparación de tamaños. NOTA: EsteS confirmará si están presentes todos los concatémeros, ya que estas dos enzimas de restricción excluirán concatemeros enteros. Estos son los tamaños esperados para cada concatemer: 2 gRNA-concatemer (800 pb), 3 gRNA-concatemer (1,2 kbp) y 4 gRNA-concatemer (1,6 kbp). </li><li> Realizar reacciones de digestión en un gel de agarosa al 1% a 90 V durante aproximadamente 20 min. </li><li> Visualice el gel usando un transiluminador UV. Identificar los clones con tamaño de inserto correcto asegurando que su patrón de banda coincida con el del vector original y que cada fragmento tenga el tamaño esperado usando una escala de ADN. </li><li> Digerir los clones seleccionados con 5 U Bbs I a 37 ° C durante 3 h en un incubador de bacterias. Incluir una mezcla de reacción separada con el vector original correspondiente como control. NOTA: Este paso de digestión adicional es para confirmar que los gRNAs se han clonado en la posición correcta y consecuentemente se han perdido todos los sitios de reconocimiento de Bbs I. </li><li> Ejecutar reacciones de digestión enUn gel de agarosa al 1% a 90 V durante aproximadamente 20 min. Considerar como correcto sólo los vectores que no son cortados por Bbs I, ya que sólo contienen gRNAs. </li></ol></li><li> Secuenciación vectorial NOTA: El objetivo de este paso es confirmar la presencia de secuencias de gRNA en aquellos vectores identificados como correctos por análisis de digestión de restricción. <ol><li> Confirme los vectores concatémeros positivos por secuenciación Sanger 13 utilizando los siguientes cebadores: Reenviar: TCAAGCCCTTTGTACACCCTAAG (para comprobar el primer casete de gRNA) Linker1_Forward: GACTACAAGGACGACGATGACAA (para comprobar el segundo casete de gRNA) Linker2_Reverse: GGCGTAGTCGGGCACGTCGTAGGGGT (para comprobar la segunda casilla de gRNA) Linker2_Forward: ACCCCTACGACGTGCCCGACTACGCC (para comprobar la tercera casete de gRNA) Linker3_Reverse: TCCTCCTCTGAGATCAGCTTCTGCAT (para comprobar el tercer casete de gRNA) Reverso: AGGTGGCGCGAAGGGGCCACCAAAG (para comprobar el último gRNAcasete) </li><li> Compruebe la presencia de todos los gRNA mediante la búsqueda de sus secuencias en la secuencia de lecturas. </li></ol></li></ol> 3. Transfección de Organoides Intestinales por Electroporación NOTA: Tenga en cuenta que este procedimiento se basa en el protocolo publicado por Fujii et al . En 2015, con adaptación para los cultivos de organoides de intestino delgado de ratón 14 . <ol><li> Pre-electroporación NOTA: Esta sección describe cómo preparar los organoides intestinales del ratón antes de la electroporación eliminando todos los antibióticos y medios acondicionados de su medio de cultivo. Esto evitará posibles efectos tóxicos durante la electroporación. <ol><li> El día 0 del procedimiento de transfección, dividió los organoides en una proporción de 1: 2. NOTA: Los cultivos organoides intestinales se pueden obtener realizando el aislamiento de la cripta de acuerdo con los protocolos previamente establecidos 15 . Por favor refiérase a <stRong&gt; Tabla 2 para todas las composiciones de medios. <ol><li> Al dividir los organoides para la electroporación, sembrar un mínimo de 6 pocillos de una placa de 48 pocillos por transfección. </li><li> Sembrar los organoides en 20 μL de gotas de la matriz del sótano y cultivarlas en medio WENR + Nic (Wnt + EGF + Noggin + R-espondina + Nicotinamida) a 37 ° C, 5% CO 2 en una incubadora humidificada (como se ha descrito anteriormente 15 ) . </li></ol></li><li> En el día 2, se cambia el medio sustituyendo WENR + Nic por 250 μl de EN (EGF + Noggin) + CHIR99021 (inhibidor de Glucógeno sintasa quinasa-3) + Y-27632 (inhibidor de ROCK), sin antibióticos (ver Tabla 2 ). NOTA: En todos los pasos, la cantidad de medio añadido a cada pocillo de una placa de 48 pocillos es de 250 μl. </li><li> El día 3, se cambia el medio organoide a EN + CHIR99021 + Y-27632 + 1,25% v / v Dimethyl sulfoxide (DMSO), sin antibióticos. </li></ol></li><li> Preparación de las células NOTA:Aquí se describe cómo fragmentar organoides en pequeños grupos de células por disociación mecánica y química. Estos pasos son críticos para el éxito del procedimiento. <ol><li> El día 4, romper las cúpulas de la matriz del sótano utilizando una punta de pipeta de 1 ml y transferir organoides a un tubo de 1,5 ml. Piscina contenido de cuatro pozos de una placa de 48 pozos en un tubo. </li><li> Romper mecánicamente los organoides en pequeños fragmentos pipeteando hacia arriba y hacia abajo con una pipeta P200 aproximadamente 200 veces. Centrifugar a temperatura ambiente, 5 min a 600 x g. </li><li> Se retira el medio y se resuspende el sedimento en 1 ml de una proteasa recombinante de grado de cultivo celular (véase tabla de materiales). Incubar a 37 ° C durante un máximo de 5 min y luego comprobar una gota de 50 μ l de la muestra bajo un microscopio de luz invertida con un objetivo 4x. NOTA: Los grupos de 10 - 15 células son deseables, ya que esto aumenta la supervivencia celular después de la electroporación. </li><li> Transferir la suspensión celular a un tubo de 15 ml de baja unión y detener laDisociación añadiendo 9 ml de medio basal sin antibióticos (ver Tabla 2 ). Centrifugar a temperatura ambiente, 5 min a 600 xg, luego desechar el sobrenadante y resuspender el gránulo en 1 mL de medio de suero reducido (ver Tabla de Materiales ). </li><li> Contar el número de células con una cámara de Bürker y utilizar un mínimo de 1 x 10 5 células por reacción de electroporación. Añadir 9 ml de medio de suero reducido al tubo de 15 ml y centrifugar a temperatura ambiente, 3 min a 400 x g. </li></ol></li><li> Electroporación NOTA: Las siguientes secciones proporcionan instrucciones sobre cómo realizar la electroporación y hacer que los organoides se recuperen después. <ol><li> Retirar todo el sobrenadante y resuspender el gránulo en una solución de electroporación (ver Tabla de Materiales ). Se añade una cantidad total de 10 μg de ADN a la suspensión celular y se añade la solución de electroporación hasta un volumen final de 100 μl y se mantiene la célula DNUna mezcla sobre hielo. Utilizar vectores CRATR-concatamer en combinación con un plásmido de expresión Cas9 ( por ejemplo, Addgene # 41815) en una relación 1: 1. NOTA: El volumen total del ADN añadido debe ser menor o igual al 10% del volumen total de la reacción. </li><li> Incluya una mezcla de transfección separada que contenga un plásmido GFP para evaluar la eficacia de la transfección ( por ejemplo, pCMV-GFP, Addgene # 11153, o cualquier plásmido genérico que expresa GFP). </li><li> Añadir la mezcla de células-ADN a la cubeta de electroporación y colocarlo en la cámara del electroporador. Mida la impedancia presionando el botón apropiado en el electroporador y asegúrese de que es 0.030-0.055 Ω. Realizar la electroporación de acuerdo con los ajustes mostrados en la Tabla 3 . NOTA: Si el valor de la impedancia cae fuera del rango permitido, ajuste el volumen de la solución en la cubeta. </li><li> Añadir 400 μl de tampón de electroporación + Y-27632 a la cubeta y luego transferir todo a un tubo de 1,5 ml. IncubaTe a temperatura ambiente durante 30 minutos para permitir que las células se recuperen y posteriormente centrifugas a temperatura ambiente durante 3 min a 400 x g. </li><li> Se retira el sobrenadante y se resuspende el sedimento en 20 μl / pocillo de la matriz del sótano. Sembrar aproximadamente 1 x 10 4 a 1 x 10 5 células por pocillo en una placa de 48 pocillos y añadir EN + CHIR99021 + Y-27632 + 1,25% v / v de medio DMSO. Incubar a 37 ° C. </li><li> El día 5, cambie el medio a EN + CHIR99021 + Y-27632, y compruebe la eficacia de transfección observando la expresión de GFP ( Figura 2 ). Mantener los organoides a 37 ° C y actualizar EN + CHIR99021 + Y-27632 medio después de 2 días. </li><li> El día 9, se cambia el medio a WENR + Nic + Y-27632 e incuba a 37 ° C. NOTA: Y-27632 se puede eliminar después de 7-10 días (en el día 16-19). </li></ol></li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td> Pulso poroso </stroNg&gt; </td><td> Pulso de transferencia </td></tr><tr><td> voltaje </td><td> 175V </td><td> 20V </td></tr><tr><td> Longitud de pulso </td><td> 5 mseg </td><td> 50msec </td></tr><tr><td> Intervalo de pulso </td><td> 50msec </td><td> 50msec </td></tr><tr><td> Número de pulsos </td><td> 2 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> Tasa de descomposición </td><td> 10% </td><td> 40% </td></tr><tr><td> Polaridad </td><td> + </td><td> +/- </td></tr></tbody></table> Tabla 3: Configuración de electroporación. 4. Retiro del Factor de Crecimiento Nota: Aquí se ejemplifica cómo llevar a cabo un experimento de retirada del factor de crecimiento cuando se eliminan los reguladores negativos de la vía Wnt en los organoides intestinales. <ol><li> 10-14 días despuésR de electroporación, dividir los organoides en una proporción de 1: 3 en una placa de 48 pocillos siguiendo los pasos mencionados anteriormente (3.2.1 - 3.2.2). </li><li> Resuspender el sedimento organoid en 20 μL de la matriz de la membrana basal y dejar que se solidifique a 37 ° C durante 10 min. A continuación, se superponen 250 μ l de medio privado de factor de crecimiento ( por ejemplo, EN) para probar si knockout de los genes objetivo se ha logrado [ 5] . </li><li> Dividir los organoides bajo condiciones de factor de crecimiento privado de un mínimo de 2 - 3 pasajes para ver una diferencia en la supervivencia entre tipo salvaje de tipo salvaje (WT) organoids control y organoids mutantes [ 5 , 15] . NOTA: Los organoides de tipo salvaje no deben ser capaces de sobrevivir en medio privado de factor de crecimiento durante dos pasadas, mientras que las líneas mutantes deben ser capaces de crecer. </li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar. Los autores no han declarado ningún conflicto de intereses.

En este protocolo, detallamos todos los pasos necesarios para generar CRISPR-concatemers y aplicar CRISPR-concatemers en ratón organoids intestinal con el fin de eliminar simultáneamente múltiples genes. Como se señaló anteriormente, esta estrategia tiene varias ventajas, como su velocidad, alta eficiencia y rentabilidad. Con el fin de llevar a cabo con éxito todo el procedimiento, hay algunos aspectos críticos a considerar. En primer lugar, es esencial que todos los oligos de gRNA estén debidamente recocidos y fosforilados, ya que representan el material de partida para la reacción de clonación de Bbs I que en sí mismo es muy eficiente. En segundo lugar, cuando se electroporan organoides, cuanto más células se usan por condición, mayor es la eficacia de transfección máxima posible. Además, también es importante que después de la disociación celular, los grupos de células pequeñas predominen sobre las células individuales. Sin embargo, es posible encontrar problemas técnicosCuando se intenta la clonación o la transfección por primera vez; En el caso de problemas durante la clonación de gRNA, se recomienda revisar la secuencia oligo de gRNA y, si es correcto, seleccionar colonias bacterianas adicionales para el cribado de digestión de restricción. Si la eficacia de la transfección y la viabilidad celular son bajas después de la electroporación, entonces es aconsejable repetir el protocolo usando más células por condición y reduciendo el tiempo de disociación celular a 3 min. Aunque la generación de concatenadores CRISPR es relativamente barata y fácil, la realización de pantallas genéticas a gran escala en organoides no lo es, ya que la escala está limitada por los costos asociados con el cultivo de organoides y por su naturaleza de mano de obra intensiva. Cabe mencionar en este caso que el método CRISPR-concatemer es también compatible con líneas celulares, tales como HEK293 y células madre embrionarias de ratón. Independientemente del sistema celular, otro posible inconveniente de este sTrategy se puede encontrar cuando se apunta a la eliminación simultánea de tres o cuatro genes diferentes. Por ejemplo, cada gRNA tendrá una eficacia de focalización diferente y los cambios de golpear todos los genes al mismo tiempo pueden ser relativamente bajos; Por esta razón, es aconsejable emplear el sistema concatemer para dirigir más de un gRNA contra el mismo gen. Alternativas estrategias basadas en Golden Gate barajar se han propuesto a lo largo de los años para generar multiplex gRNA vectores [ 7 , 8] . Sin embargo, en nuestro método es posible ensamblar directamente múltiples ARNg en un solo vector retrovírico en una sola ronda de clonación, lo que hace que sea adecuado para generar bibliotecas de ARNg para diana de paralogues. Nuestro CRISPR-concatemer se construye en la columna vertebral del vector retroviral MSCV. Por lo tanto, el retrovirus que contiene concatémero de gRNA puede usarse para generar líneas celulares estables que sobreexpirenRes gRNAs. Cuando se combina con un sistema inducible con Cas9, se pueden realizar knockouts de parálisis inducibles utilizando nuestro sistema. En resumen, aquí se describe cómo clonar hasta cuatro diferentes gRNAs en el mismo vector en un solo paso y cómo aplicar esta estrategia a un cultivo organoid con una alta eficiencia de transfección. Además, proporcionamos sugerencias útiles para maximizar las posibilidades de éxito durante todo el procedimiento.

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Erratum: A Protocol for Multiple Gene Knockout in Mouse Small Intestinal Organoids Using a CRISPR-concatemer

El enfoque genético inverso es un método ampliamente utilizado para investigar la función de un gen. En particular, los estudios de pérdida de función, en los que la alteración de un gen causa alteraciones fenotípicas, desempeñan un papel clave en la construcción de nuestra comprensión de los procesos biológicos. El método CRISPR / Cas9 representa el avance más reciente en la tecnología de ingeniería del genoma y ha revolucionado la práctica actual de la genética en células y organismos. Cas9 es una endonucleasa guiada por ARN que se une a una secuencia de ADN específica complementaria al ARNg y genera una rotura de doble hebra (DSB). Este DSB recluta maquinaria de reparación de ADN que, en ausencia de una plantilla de ADN para la recombinación homóloga, volverá a ligar la cadena de ADN cortada a través de uniones finales no homólogas propensas a error, lo que puede dar lugar a inserciones o deleciones de nucleótidos, Causando mutaciones de frameshift 1 . La gran facilidad y versatilidad del CRISPR / Cas9 apprOach ha hecho que sea una herramienta muy atractiva para las pantallas de knockout de escala genómica dirigida a desentrañar las funciones de genes desconocidos 2 , 3 . Sin embargo, los enfoques de knockout de gen único son de uso limitado si existen múltiples paralogues con funciones redundantes. Por lo tanto, la ablación de un solo gen podría no ser suficiente para determinar la función de ese gen dado compensación posible por paralogues resultando en poca o ninguna alteración fenotípica [ 4] . Por lo tanto, es importante eliminar los paralogues en paralelo mediante la entrega de múltiples gRNA vectores dirigidos a los diferentes genes paralogous con el fin de superar la influencia de la compensación genética. Para extender el uso de CRISPR / Cas9 a knockout de genes paralogous, hemos desarrollado recientemente un método de clonación rápido, de un solo paso para clonar hasta cuatro gRNA pre-hibridación en un solo vector retroviral [ 5] . La columna vertebral, denominada CRISPR-concatemer, se basa enEn un plásmido retroviral MSCV que contiene casetes de expresión de gRNA repetitivos. Cada casete contiene dos sitios de reconocimiento invertidos de la enzima de restricción Bbs I del Tipo IIS, los cuales pueden ser reemplazados irreversiblemente por un oligo de gRNA recocido con salientes coincidentes usando una reacción de barajadura Golden Gate en un solo tubo 6 . Este método de clonación consiste en ciclos repetitivos de digestión y ligadura que permiten el ensamblaje simultáneo de múltiples fragmentos de ADN explotando las diferentes secuencias de saliente generadas por Bbs I. La singularidad de esta enzima es, por ejemplo, la capacidad de realizar cortes asimétricos fuera de su reconocimiento secuencia; Por lo tanto, cada casete puede tener una secuencia diferente con voladizos personalizados que flanquean sitio central Bbs I y de esta manera, cada gRNA se pueden clonar en una posición específica y la orientación del vector concatemer. Como prueba de principio, hemos demostrado el uso de esta estrategia enRatón organoides intestinales por la interrupción simultánea de dos pares de paralogous reguladores negativos de la Wnt vía por una ronda de electroporación [ 5] . Durante los últimos años, muchos otros grupos han desarrollado estrategias similares basadas en múltiples vectores de expresión de gRNA construidos usando la barajadura de Golden Gate 7 para lograr knockout de múltiples genes en varios sistemas modelo, tales como líneas de células humanas 8 , 9 , pez cebra 10 y Escherichia coli 11 . En sus protocolos, los gRNAs se clonan primero en vectores intermedios individuales y luego se ensamblan juntos en un producto final. Por el contrario, la ventaja principal de nuestra estrategia de CRISPR-concatemer es la conveniencia de un solo Bbs I que barajan, paso de la clonación. Al igual que otros concatémicos de gRNA, nuestro método hace posible o bien la eliminación simultánea de hasta cuatroDiferentes genes o un aumento de CRISPR knockout eficiencia después de la orientación de uno o dos genes con múltiples gRNAs ( Figura 1 ]. En este protocolo, describimos en detalle cada paso en la generación de CRISPR-concatemer vectores, desde el diseño de gRNA a la Golden Gate reacción y la confirmación de éxito de la clonación. También proporcionamos un protocolo altamente eficiente para la transfección de CRISPR-concatemers en ratón de organoides de intestino delgado por electroporación y posterior factor de crecimiento de los experimentos de retirada.

<table><tbody><tr><td>Herramienta de diseño CRISPR optimizada</td><td>Herramienta de diseño de ARNg CRISPR</td> <td>del grupo</td><td></td> Feng Zhang; http://crispr.mit.edu/</tr> <tr>Herramienta de <td>mapeo de restricciones</td> <td>Webcutter 2.0</td><td></td><td></td>; http://rna.lundberg.gu.se/cutter2/</tr> <tr><td>T4 PNK (polinucleótido quinasa)</td>Tampón de ADN ligasa <td>T4 de New England Biolabs</td><td>M0201L</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td>ADN<td>T7</td> de <td>New England Biolabs</td></tr><tr><td> Ligasa</td><td>New England Biolabs</td><td>M0318L</td><td></td></tr><tr><td>DTT (ditiotreitol)</td><td>Promega</td><td>P1171</td><td></td></tr><tr><td>ATP (trifosfato de adenosina)</td><td>New England Biolabs</td><td>P0756S</td><td></td></tr><tr><td>FastDigest BbsI (BpiI)</td><td>Tampón Thermo Fisher</td><td>FD1014</td><td></td></tr><tr><td>Tango (tampón de enzimas de restricción que contiene BSA)</td><td>Thermo Fisher</td><td>BY5</td><td></td></tr><tr><td>BglII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0144</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0101</td><td></td></tr><tr><td>Exonucleasa segura para plásmidos</td><td>Cambio</td><td>E3101K</td><td></td></tr><tr><td>Termociclador</td><td>Biosistemas aplicados</td><td>4359659</td><td></td></tr><tr><td>bacterias E. coli competentes 10G</td><td>Cambridge Bioscience</td><td>60108-1</td><td></td></tr><tr><td>Mini kit de plásmido</td><td>Qiagen</td><td>12125</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrífuga de sobremesa</td><td>Eppendorf</td><td>UY-02580-01</td><td></td></tr><tr><td>Asas de inoculación</td><td>Microspec</td><td>PLS5</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de bacterias</td><td>Sanyo</td><td>MIR-262</td><td></td></tr><tr><td>Caldo Luria-Bertani (LB)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3522</td><td></td></tr><tr><td>Agarosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4718</td><td></td></tr><tr><td>Aparato de electroforesis en gel de agarosa</td><td>Bioneer</td><td>A-7020</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12 (medio de cultivo celular)</td><td>Invitrogen</td><td>12634-034</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax (L-Glutamina) 100x</td><td>Invitrogen</td><td>35050-068</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 1 M (agente amortiguador)</td><td>Invitrogen</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina 100x</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Suplemento B27 (Célula neuronal suplemento sin suero) 50x</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Suplemento N2 (Suplemento sin suero de células neuronales) 100x</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>n-acetilcisteína 500 mM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165-5G</td><td></td></tr><tr><td>Ratón EGF 500 &micro; g/mL</td><td>Invitrogen Biosource</td><td>PMG8043</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Noggin 100 &micro; g/mL</td><td>Peprotech</td><td>250-38</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamida 1 M</td><td>Sigma</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>R-Spondin medio acondicionado</td><td>n.a.n.a.Producido</td><td></td> <td>internamente a partir de células HEK293, para más detalles ver Sato and Clevers 2013</td></tr><tr><td>Wnt medio acondicionado</td><td>n.a.n.a.Producido</td><td></td> <td>internamente a partir de células HEK293, para más detalles ver Sato and Clevers 2013</td></tr><tr><td>Y-27632 10 &micro; M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0503-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Matriz de matriz</td> BD <td>Biosciences</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>de 48 pocillos</td><td>Greiner Bio One</td><td>677980</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3734-1MG</td><td></td></tr><tr><td>IWP-2</td><td>Sistemas de guía celular</td><td>SM39-10</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE (proteasa recombinante)</td><td>Invitrogen</td><td>12605-010</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM (medio sérico reducido)</td> <td>Life technologies</td><td>51985-034</td><td></td></tr><tr><td>Cubetas de electroporación con un espacio de 2 mm</td><td>NepaGene</td><td>EC-002S</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de 15 ml de baja unión</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430791</td><td></td></tr><tr><td>B&uuml; rker' cámara s</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>BR719520-1EA</td><td></td></tr><tr><td>NEPA21 Super Electroporator</td><td>NepaGene</td><td>contactar proveedor</td><td></td></tr><tr><td>Tubos LoBind de proteínas de baja unión</td><td>Thermo Fisher</td><td>10708704</td><td></td></tr><tr><td>BTXpress tampón de electroporación</td><td>Harvard Apparatus</td><td>45-0805</td><td></td></tr><tr><td>DMSO (dimetilsulfóxido)</td><td>AppliChem</td><td>A3672</td><td></td></tr></tbody></table>

un protocolo para múltiples genes knockout en ratón intestinal organoids utilizando un crispr-concatemer

A Protocol for Multiple Gene Knockout in Mouse Small Intestinal Organoids Using a CRISPR-concatemer

La tecnología CRISPR / Cas9 ha mejorado en gran medida la viabilidad y velocidad de los estudios de pérdida de función que son esenciales para comprender la función del gen. En los eucariotas superiores, los genes paralogous pueden enmascarar un fenotipo potencial mediante la compensación de la pérdida de un gen, limitando así la información que se puede obtener de los estudios genéticos que dependen de knockouts único gen. Hemos desarrollado un nuevo y rápido método de clonación para guiar ARN (gRNA) concatemers con el fin de crear múltiples gen knockouts después de una sola ronda de transfección en ratón de intestino delgado organoides. Nuestra estrategia permite la concatemerización de hasta cuatro gRNAs individuales en un único vector mediante la realización de una única puerta Golden Gate de reacción con oligos recocido gRNA y un vector retroviral pre-diseñado. Esto permite la eliminación simultánea de hasta cuatro genes diferentes, o una mayor eficiencia knockout después de la orientación de un gen por múltiples gRNAs. En este protocolo, mostramos en detalleCómo clonar de forma eficaz múltiples gRNAs en el vector CRATR-CRATRAT retroviral y cómo lograr electroporación altamente eficiente en organoides intestinales. A modo de ejemplo, se muestra que la eliminación simultánea de dos pares de genes que codifican los reguladores negativos de la vía de señalización Wnt (Axin1 / 2 y Rnf43 / Znrf3) hace que los organoides intestinales resistentes a la retirada de factores clave de crecimiento.

Con el fin de confirmar la presencia del número correcto de insertos de gRNA en el vector concatemer, la digestión de restricción se realiza con enzimas ( EcoR I + Bgl II) flanqueando todos los cassettes que expresan gRNA (cada tamaño de casete es ~ 400 pb, Figura 1 ). Por ejemplo, al generar un vector de 4 gARN-concatemer, el tamaño esperado de la banda inferior en el gel de agarosa es de aproximadamente 1,6 Kbp; Cualquier banda inferior indica que no todas las 4 casillas de gRNA se insertan en el vector ( Figura 2A ). Además, siempre se recomienda comprobar que todos los sitios de reconocimiento Bbs I se pierden y la enzima no corta el vector ( Figura 2B ). Una vez que los constructos han sido confirmados, pueden ser entregados a organoides intestinales de ratón por electroporación para lograr optimaL niveles de eficiencia de transfección (hasta el 70%), como se muestra por el control GFP ( Figura 3 ]. Por último, para ensayar la eficacia de esta estrategia, se cultivaron organoides intestinales transfectados con Cas9 y vectores concatemer contra Axin1 / 2 y Rnf43 / Znrf3 en EN (retirada de R-espondina) y EN + IWP2 (R-spondina y retiro de Wnt, IWP2 : Inhibidor de puercoespín, 2,5 μM) para un mínimo de 3 pasajes ( Figura 4 ). Mientras que los organoides WT no transfectados murieron bajo ambas condiciones, los organoides knockout Axin1 / 2 sobrevivieron en ambos debido a la activación aguas abajo de la vía Wnt; Además, los organoides mutantes Rnf43 / Znrf3 sobreviven en ausencia de R-espondina pero no pueden sobrevivir en presencia de IWP2, lo que provoca la depleción del Wnt que activa la vía. En conjunto, estas observaciones demuestran que el knockout de estos pares de paralogues es posible generando tEsperaba un fenotipo organoide. Los detalles de estos resultados se han publicado en Developmental Biology 5 . <img alt="Figura 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55916/55916fig1.jpg" /> Figura 1: Representación esquemática del CRISPR-concatemer con 4 Cassettes. Esquema del vector de 4 gARN-concatemer con cada casete de 400 pb que contiene un promotor U6, dos sitios Bbs I repetidos invertidos (también indicado como BB) y andamiaje de gRNA en este orden. Durante la reacción de barajado, los sitios Bbs I son reemplazados por fragmentos de gRNA con salientes coincidentes y consecuentemente perdidos. Los sitios de unión de los cebadores de secuenciación para comprobar la inserción correcta de los oligos de gRNA se muestran mediante las flechas azules. Fwd = cebador directo, Rev = cebador inverso, Enlace 1/2/3 = regiones de unión 1/2/3. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55916/55916fig1large.jpg" target="_blank">Por favor C</a>Lame aquí para ver una versión más grande de esta figura. <img alt="Figura 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55916/55916fig2.jpg" /> Figura 2: Patrones de digestión representativos de vectores concaténicos. ( A ) Doble digestión de 3 y 4 vectores de concatenador de gRNA con EcoR I y Bgl II. El patrón de digestión correcto está marcado por una garrapata verde, mientras que los vectores con sólo 1 o 2 inserciones de gRNA están marcados con una cruz roja. El carril 1 muestra la digestión de un vector parental de 4 gRNA-concatemer usado como control positivo (marcado con &quot;+&quot;); De manera similar, el carril 5 muestra la digestión de un vector parental de 3 gRNA-concatemer, marcado con &quot;+&quot;. ( B ) Digestión con Bbs I, mostrando el tamaño correcto de los vectores concatemer no digeridos (indicados por las garrapatas verdes). La digestión de un vector concatemer que contiene gRNA que ha perdido sitios Bbs I se utiliza como un control positivo yD está marcado con &quot;+&quot;. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55916/55916fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="figura 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55916/55916fig3.jpg" /> Figura 3: Imagen representativa de los organoides intestinales electroporados con éxito. La transfección de un plásmido GFP es instrumental para evaluar la eficacia de la transfección. Aproximadamente 24 h después de la electroporación, los organoides que contienen un pequeño número de células son ya visibles y, si el procedimiento de electroporación fue exitoso, hasta el 70% de ellos muestra fluorescencia verde. BF = campo brillante, GFP = proteína fluorescente verde. Barra de escala = 2.000 μm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55916/55916fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> Figura 4: Imágenes representativas de Organoides Intestinales Mutantes. Knockout de los reguladores negativos de la vía Wnt Axin1 y Rnf43, junto con sus paralogues, hace que los organoides intestinales resistentes a la privación del factor de crecimiento. En particular, los organoides knockout Axin1 / 2 (Axin1 / 2 KO) pueden crecer en ausencia de R-spondina (EN: EGF + Noggin) y Wnt (EN + IWP2: EN + Inhibidor de Porcupine), mientras que Rnf43 / Znrf3 mutante organoides (R &amp; Z KO) sólo puede sobrevivir en ausencia de R-espondina (EN). Por el contrario, los organoides de WT sólo pueden sobrevivir en la condición de cultivo de control, WENR + Nic (Wnt + EGF + Noggin + R-espondina + nicotinamida). Barras de escala = 1.000 μm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55916/55916fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-Page = &quot;1&quot; fo: keep-with-next.within-page = &quot;siempre&quot;&gt; <tbody><tr><td> Medio basal </td><td></td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Almacenar a 4 ° C durante 4 semanas </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Medio de cultivo celular </td><td> 500 ml </td><td> Ver tabla de materiales </td></tr><tr><td> L-Glutamina 100x </td><td> 5 ml </td><td></td></tr><tr><td> Agente tampón 1 M </td><td> 5 ml </td><td> Ver tabla de materiales </td></tr><tr><td> Penicilina Streptomycin 100x </td><td> 5 ml </td><td></td></tr><tr><td> WENR + Nic (Wnt + EGF + Noggin + R - espondina + Nicotinamida) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Almacenar a 4 ° C durante 2 semanas </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Medio basal </td><td> Hasta 50 ml </td><td></td></tr><tr><td> Suplemento de células neuronales sin suero (50x) </td><td> 1 ml </td><td> Ver tabla de maTeriales </td></tr><tr><td> Suplemento de células neuronales sin suero (100x) </td><td> 500 μl </td><td> Ver tabla de materiales </td></tr><tr><td> N - acetilcisteína (500 mM) </td><td> 125 μL </td><td></td></tr><tr><td> EGF de ratón (100 mu g / ml) </td><td> 25 μL </td><td></td></tr><tr><td> Ratón Noggin (100 mu g / ml) </td><td> 50 μl </td><td></td></tr><tr><td> Medio condicionado R-Spondin </td><td> 5 ml </td><td></td></tr><tr><td> Wnt3a medio acondicionado </td><td> 25 ml </td><td></td></tr><tr><td> Nicotinamida (1 M) </td><td> 250 μl </td><td></td></tr><tr><td> EN + CHIR + Y - 27632 (EGF + Noggin + CHIR + Y - 27632) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Almacenar a 4 ° C durante 2 semanas </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Basal medio sin penicilina Estreptomicina </td><td> Hasta 20 ml </td><td></td></tr><tr><td>Suplemento de células neuronales sin suero (50x) </td><td> 400 μl </td><td> Ver tabla de materiales </td></tr><tr><td> Suplemento de células neuronales sin suero (100x) </td><td> 200 μl </td><td> Ver tabla de materiales </td></tr><tr><td> N - acetilcisteína (500 mM) </td><td> 50 μl </td><td></td></tr><tr><td> EGF de ratón (100 mu g / ml) </td><td> 10 μl </td><td></td></tr><tr><td> Ratón Noggin (100 mu g / ml) </td><td> 20 μL </td><td></td></tr><tr><td> Y - 27632 (10 mu M) </td><td> 20 μL </td><td></td></tr><tr><td> CHIR99021 (8 mu M) </td><td> 10 μl </td><td></td></tr><tr><td> EN (EGF + Noggin) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Almacenar a 4 ° C durante 4 semanas </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Medio basal </td><td> Hasta 50 ml </td><td></td></tr><tr><td> Suplemento de células neuronales sin suero (50x) </td><td&gt; 1 ml </td><td> Ver Tabla de materiales </td></tr><tr><td> Suplemento de células neuronales sin suero (100x) </td><td> 500 μl </td><td> Ver Tabla de materiales </td></tr><tr><td> N - acetilcisteína (500 mM) </td><td> 125 μL </td><td></td></tr><tr><td> EGF de ratón (100 mu g / ml) </td><td> 25 μL </td><td></td></tr><tr><td> Ratón Noggin (100 mu g / ml) </td><td> 50 μl </td><td></td></tr></tbody></table> Tabla 2: Composición de los medios organóides.

Este protocolo describe los pasos para la clonación de múltiples ARN guía único en un guía de ARN concatemer vector, que es de uso particular en la creación de múltiples gen knockouts utilizando CRISPR / Cas9 tecnología. La generación de knockouts dobles en organoides intestinales se muestra como una posible aplicación de este método.

Un protocolo para múltiples genes Knockout en ratón Intestinal Organoids utilizando un CRISPR-concatemer

CRISPR/Cas9 technology has greatly improved the feasibility and speed of loss-of-function studies that are essential in understanding gene function. In ...

El objetivo general de este protocolo es clonar múltiples ARN guía en un vector CRISPR-concatémero y lograr una electrotransferencia altamente eficiente en organoides intestinales de ratón, con el fin de obtener la interrupción simultánea de múltiples genes. Este método puede mejorar considerablemente la eficiencia de los estudios de pérdida de función al hacer posible superar el efecto potencial de la compensación paralela. La principal ventaja de nuestra estrategia CRISPR-concatémero radica en la comodidad de un único paso de clonación y en la posibilidad de realizar la interrupción simultánea de hasta cuatro genes diferentes.La demostración del procedimiento será realizada por Alessandra Merenda, estudiante de doctorado de mi laboratorio. La clonación de ARN guía o gRNA en el vector CRISPR-concatémero comienza con una única reacción para hibridar las cadenas superior e inferior de cada oligonucleótido gRNA y fosforilar sus extremos. Prepare la mezcla de reacción sobre hielo; para tres concatémeros, utilice tres microlitros de las cadenas superiores de gRNA, tres microlitros de las cadenas inferiores de gRNA, dos microlitros de tampón de ligasa T4 de ADN, un microlitro de cinasa de polinucleótidos T4 y agua hasta un volumen total de 20 microlitros.Mezcle bien mediante pipeteo y ejecute el termociclador con las siguientes condiciones: 37 grados centígrados durante 30 minutos, 95 grados centígrados durante cinco minutos, rampa descendente hasta 25 grados centígrados a 0,3 grados centígrados por minuto y mantenimiento a cuatro grados centígrados. El siguiente paso es la reacción de reordenamiento con Bbs1, en la cual los oligonucleótidos de ARN-g preanillados se incorporan en la posición adecuada del vector concatemérico. Diluya la mezcla de reacción de uno a 100 en agua libre de ADN y ARN para generar los vectores concateméricos de tres y cuatro ARN-g.Prepare las reacciones de reordenamiento Bbs1 sobre hielo. Utilice 100 nanogramos de vector CRISPR-concatémero, 10 microlitros de mezcla de oligos, un microlitro de tampón para enzima de restricción, un microlitro de DTT, un microlitro de ATP, un microlitro de enzima Bbs1, un microlitro de ligasa T7 y agua hasta un volumen total de 20 microlitros. Mezcle bien mediante pipeteo e incluya un control negativo que contenga el vector.Realice las reacciones en un termociclador, utilizando los siguientes parámetros: para la clonación de concatémeros de tres y cuatro ARN-g, ejecute 50 ciclos a 37 grados Celsius durante cinco minutos y a 21 grados Celsius durante cinco minutos, mantenga a 37 grados Celsius durante 15 minutos y luego mantenga a cuatro grados Celsius indefinidamente. Para concatémeros de dos ARN-g, utilice los mismos parámetros con 25 ciclos del paso uno. Cuando la reacción de intercambio con Bbs1 esté completa, tome 11 microlitros de cada mezcla de ligación y agregue 1,5 microlitros de tampón de exonucleasa, 1,5 microlitros de ATP, un microlitro de exonucleasa de ADN y agua hasta un volumen total de 15 microlitros.Incubar a 37 grados Celsius durante 30 minutos, seguido de 70 grados Celsius durante 30 minutos. Posteriormente, la mezcla de reacción se utiliza para transformar bacterias E. coli competentes químicamente, siguiendo un protocolo estándar. Para confirmar la presencia de insertos de ARN-g en el vector CRISPR-concatemérico, seleccione colonias bacterianas con un asa de inoculación e inocule cada una en cuatro mililitros de medio LB.Cultive los clones durante la noche a 37 grados Celsius en un agitador orbital. Al día siguiente, se extrae el ADN utilizando un kit de minipreparación de plásmidos, según las instrucciones del fabricante. Mezcle aproximadamente 200 nanogramos de cada muestra de ADN con 10 unidades de EcoR1 y cinco unidades de BglII en una reacción de 10 microlitros.Incluya una mezcla de reacción separada con el vector original correspondiente como control positivo para la comparación de tamaño. Incube las reacciones a 37 grados Celsius durante tres horas. Someta las reacciones de digestión a electroforesis en un gel de agarosa al 1% a 90 voltios durante aproximadamente 20 minutos.Visualice el gel utilizando un transiluminador UV para identificar los clones con el tamaño correcto del inserto. Para confirmar que los ARNsg se han clonado en la posición correcta y, por consiguiente, que todos los sitios de reconocimiento de Bbs1 se han perdido, digiera los clones seleccionados con cinco unidades de Bbs1. Incluya una mezcla de reacción separada, con el vector original correspondiente como control.Incubar a 37 grados Celsius durante tres horas, correr las reacciones de digestión en un gel de agarosa al 1% a 90 voltios durante aproximadamente 20 minutos. Visualizar el gel utilizando un transiluminador UV para identificar los vectores que no son cortados por Bbs1. Al dividir los organoides para la electroforesis, sembrar un mínimo de seis pocillos de una placa de 48 pocillos por transfección.Siembre los organoides en gotas de matriz basal de 20 microlitros y cultívelos en 250 microlitros de medio WENR más nicotinamida por pocillo a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono en un incubador humedecido. En el día dos, sustituya el medio WENR más nicotinamida por 250 microlitros de medio con EGF más nogina, inhibidor de GSK3 e inhibidor de rock, sin antibióticos. En el día tres, cambie el medio de los organoides a EGF más nogina, inhibidor de GSK3, inhibidor de rock y 1,25% de dimetilsulfóxido, sin antibióticos.En el día cuatro, interrumpa las cúpulas de matriz basal utilizando una punta de pipeta de un mililitro y transfiera los organoides a un tubo de 1,5 mililitros. Aspire el contenido de cuatro pozos de una placa de 48 pozos en un solo tubo. Rompa mecánicamente los organoides en fragmentos pequeños pipeteando hacia arriba y hacia abajo con la pipeta P200 aproximadamente 200 veces.Centrifugar a 600 × g durante cinco minutos a temperatura ambiente. Después de la centrifugación, retire el medio de todos los tubos y re-suspenda los sedimentos en un mililitro de una proteasa recombinante de grado para cultivo celular. Incube a 37 grados Celsius durante un máximo de cinco minutos.Es importante monitorear cuidadosamente el tratamiento con proteasa, ya que el éxito de la electroforesis depende de obtener una suspensión celular que contenga grupos de células en lugar de células individuales. Examine una gota de 50 microlitros de la muestra bajo un microscopio óptico invertido con un objetivo de cuatro aumentos. Son deseables grupos de 10 a 15 células, ya que esto aumenta la supervivencia celular tras la electroforesis.Transfiera la suspensión celular a un tubo de 15 mililitros de baja unión y detenga la disociación agregando nueve mililitros de medio basal sin antibióticos. Centrifugue a 600 ×g durante cinco minutos a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante y resuspenda el sedimento en un mililitro de medio con suero reducido.Cuente el número de células con una cámara de Burkes; se necesita un mínimo de una vez 10 a la quinta células por reacción de electroforesis. Comience este procedimiento añadiendo nueve mililitros de medio con suero reducido al tubo de 15 mililitros que contiene la suspensión celular y centrifugue a 400 veces G durante tres minutos a temperatura ambiente. Retire todo el sobrenadante y resuspenda el botón celular en una solución de electroforesis.Añada una cantidad total de 10 microgramos de ADN a dos tubos nuevos. Luego, añada solución de electrotransferencia hasta un volumen final de 100 microlitros y mantenga la mezcla de células y ADN en hielo. Transfiera la mezcla de células y ADN al cubeta de electrotransferencia y coloque la cubeta en la cámara del electrotransféctor.Mida la impedancia pulsando el botón adecuado en el electropermeabilizador y asegúrese de que esté entre 0,030 y 0,055 ohmios. Realice la electropermeabilización según la configuración indicada en el protocolo del texto. Añada 400 microlitros de tampón de electropermeabilización más inhibidor rock al cubeta y luego transfiera todo su contenido a un tubo de 1,5 mililitros.Incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos para permitir que las células se recuperen. Después de 30 minutos, centrifugar a 400 × g durante tres minutos a temperatura ambiente. Eliminar el sobrenadante y re-suspender la paleta en 20 microlitros por pocillo de matriz basal.Siembre aproximadamente de uno por diez a la cuarta a uno por diez a la quinta células por pocillo en una placa de 48 pocillos y agregue medio con EGF más nogina, inhibidor de GSK3, inhibidor de rock y 1,25 % de dimetilsulfóxido. Incube a 37 grados Celsius. Al día siguiente, cambie el medio a EGF más nogina, inhibidor de GSK3 e inhibidor de rock y verifique la eficiencia de transfección observando la expresión de GFP.Mantenga los organoides a 37 grados celsius. Dos días después, reemplace el medio con medio fresco. Cuatro días después de la electrotransferencia, cambie el medio a medio WENR más nicotinamida e inhibidor de rock y continúe incubando las células a 37 grados celsius.La presencia del número correcto de insertos de ARN-g en el vector concatemérico se confirma mediante digestión doble con EcoR1 y BglII. El tamaño esperado de la banda inferior es aproximadamente de 1,6 kilobases para un vector concatemérico de cuatro ARN-g y de 1,2 kilobases para un vector concatemérico de tres ARN-g. Además, la digestión con Bbs1 confirma que los ARN-g han sido clonados en la posición correcta y, por consiguiente, todos los sitios de reconocimiento de Bbs1 se pierden.Los constructos confirmados se entregan a organoides intestinales de ratón mediante electroforesis para lograr una eficiencia de transvección de hasta el 70 %, como se muestra mediante la expresión de GFP. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo generar vectores de concatémeros de ARN-g y cómo entregarlos eficientemente a cultivos de organoides tridimensionales utilizando electroforesis, con el fin de lograr la interrupción de múltiples genes al mismo tiempo.

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Investigación

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Bioingeniería

Fuente: Van Lidth de Jeude, J. F., et al. Protocolo para la transducción lentiviral y análisis posterior de organoides intestinales. J. Vis. Exp. (2015)Este video describe la transducción lentiviral de organoides intestinales de ratón a partir de una estructura similar a un cripto que contiene suspensión. Utilizando una matriz de membrana basal como andamiaje y medios suplementados con factores de crecimiento, se introducen vectores lentivirales para permitir la integración estable del...

Transferencia de genes a organoides intestinales de ratón mediante vectores lentivirales

Este video describe una técnica de eliminación de genes que utiliza un concatemero CRISPR para eliminar simultáneamente múltiples genes en células organoides intestinales de ratón cultivadas. Este método se utiliza para eliminar un gen enfermo y para dilucidar la función de un gen y sus parálogos.

Knockout de múltiples genes mediado por concatemeros CRISPR: una técnica para eliminar simultáneamente múltiples genes mediante una vía de unión de extremos no homóloga en células intestinales de ratón

En este protocolo de vídeo damos una explicación paso a paso de la transducción lentiviral en organoides del epitelio intestinal primario y del procesamiento y análisis posterior de estos cultivos mediante RT-PCR cuantitativo, microarrays de ARN e inmunohistoquímica.

Un protocolo para la de Lentiviral Transducción y Análisis de Aguas abajo de Intestinal organoides

Describimos instrucciones paso a paso para: 1) diseñar de manera eficiente organoides intestinales utilizando nanopartículas magnéticas para la transducción lenti- o retroviral, y, 2) generar secciones congeladas a partir de organoides diseñados. Este enfoque proporciona una poderosa herramienta para alterar eficientemente la expresión génica en organoides para la investigación de los efectos posteriores.

Ingeniería Genética de Organoides Intestinales de Ratón Primario utilizando Vectores Virales de Transducción de Nanopartículas Magnéticas para Seccionamiento Congelado

Este protocolo describe un método de electroporación eficiente para la transfección de cuatro entidades organoides gastrointestinales diferentes con plásmidos más grandes (hasta una extensión de 10 kB). Se puede realizar en el plazo de un día y no necesita una preparación extensa o amortiguadores de electroporación especiales y costosos.

Protocolo de Electroporación Universal y Eficiente para la Ingeniería Genética de Organoides Gastrointestinales

Aquí describimos una metodología de detección CRISPR/Cas9 rápida y directa in vivo utilizando inyecciones lentivirales embrionarias de tero guiadas por ultrasonido para evaluar simultáneamente las funciones de varios genes en la piel y la cavidad oral de ratones inmunocompetentntes.

In Vivo CRISPR/Cas9 Screening para evaluar simultáneamente la función génica en la piel del ratón y la cavidad oral

El presente protocolo describe la microinyección de cigoto de CRISPR-Cas9 y ADN de donantes para producir eficientemente ratones knock-in y floxed de casetes de genes.

Microinyección de cigoto para la creación de alelos de genes de casete knock-in y flox en ratones

Aquí, describimos una técnica simple destinada a la generación eficiente de ratones genéticamente modificados llamada CRISPR RNP Electroporación de Cigotos (CRISPR-EZ). Este método proporciona reactivos de edición por electroporación en embriones con una eficiencia cercana al 100%. Este protocolo es efectivo para mutaciones puntuales, pequeñas inserciones genómicas y deleciones en embriones de mamíferos.

Edición eficiente del genoma de ratones mediante electroporación CRISPR de cigotos

Aquí, describimos un protocolo integral para generar y utilizar organoides de glioblastoma (LEGO) diseñados en laboratorio para investigar las dependencias genotipo-fenotipo y seleccionar posibles medicamentos para el tratamiento del glioblastoma.

Cultivo de organoides de glioblastoma y detección de fármacos

Aquí, presentamos la manipulación genética aguda de organoides corticales humanos cortados en rodajas por electroporación. Estos modelos de organoides corticales son particularmente susceptibles a la inyección, ya que las estructuras similares a los ventrículos se pueden identificar fácilmente después del corte, lo que permite la investigación funcional del desarrollo cortical humano, los trastornos del neurodesarrollo y la evolución cortical.

Electroporación de organoides corticales humanos cortados en rodajas para estudios de la función génica

Aprende a clonar múltiples gRNAs en un vector CRISPR-concatemer para generar knockouts simultáneos en organoides intestinales de ratón. Este método mejora la eficiencia de estudios de pérdida de función en biología molecular.

Un protocolo para múltiples genes Knockout en ratón Intestinal Organoids utilizando un CRISPR-concatemer

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