Un protocolo para múltiples genes Knockout en ratón Intestinal Organoids utilizando un CRISPR-concatemer

El objetivo general de este protocolo es clonar múltiples ARN guía en un vector concatemero CRISPR y lograr una electroporación altamente eficiente en organoides intestinales de ratón, con el fin de obtener la eliminación simultánea de múltiples genes. Este método puede mejorar en gran medida la eficiencia de los estudios de pérdida de función al permitir superar el efecto potencial de la compensación en paralelo. La principal ventaja de nuestra estrategia de concatemero CRISPR es la comodidad de un solo paso de clonación y la posibilidad de realizar el knockout simultáneo de hasta cuatro genes diferentes.

La demostración del procedimiento estará a cargo de Alessandra Merenda, estudiante de doctorado de mi laboratorio. La clonación de ARN guía o ARNg en el vector concatemero CRISPR comienza con una sola reacción para recocer las hebras superior e inferior de cada oligonucleótido de ARNg y fosforilar sus extremos. Prepare la mezcla de reacción en hielo, para tres concatemeros, use tres microlitros de ARNg de hebra superior, tres microlitros de ARNg de hebra inferior, dos microlitros de tampón de ADN ligasa T4, un microlitro de polinucleótido quinasa T4 y agua hasta un volumen total de 20 microlitros.

Mezcle bien pipeteando y haciendo funcionar el termociclador con los siguientes ajustes, 37 grados centígrados durante 30 minutos, 95 grados centígrados durante cinco minutos, baje a 25 grados centígrados a 0,3 grados centígrados por minuto y manténgalo a cuatro grados centígrados. El siguiente paso es la reacción de barajado Bbs1, en la que los oligonucleótidos de ARNg pre-recocidos se incorporan a la posición apropiada del vector concatemer. Diluya la mezcla de reacción de uno a 100 en ADN, agua libre de ARN para generar vectores concatemeros de tres y cuatro ARNg.

Ensambla las reacciones de barajado de Bbs1 en hielo. Utilice 100 nanogramos de vector concatemero CRISPR, 10 microlitros de mezcla de oligonucleótidos, un microlitro de tampón de enzima de restricción, un microlitro de DTT, un microlitro de ATP, un microlitro de enzima Bbs1, un micrlitro de ligasa T7 y agua hasta un volumen total de 20 microlitros. Mezclar bien pipeteando, incluir un control negativo que contenga el vector.

Ejecute las reacciones en un termociclador, utilizando los siguientes ajustes, para clonar tres y cuatro concatemeros de ARNg, ejecute 50 ciclos a 37 grados centígrados durante cinco minutos y 21 grados centígrados durante cinco minutos, manténgalo a 37 grados centígrado durante 15 minutos y luego manténgalo a cuatro grados centígrados indefinidamente. Para dos concatemeros de ARNg, ejecute la misma configuración con 25 ciclos del paso uno. Cuando se complete la reacción de barajado Bbs1, tome 11 microlitros de cada mezcla de ligadura y agregue 1,5 microlitros de tampón de exonucleasa, 1,5 microlitros de ATP, un microlitro de ADN exonucleasa y agua hasta un volumen total de 15 microlitros.

Incube a 37 grados centígrados durante 30 minutos, seguido de 70 grados centígrados durante 30 minutos. Posteriormente, la mezcla de reacción se utiliza para transformar bacterias E. Coli químicamente competentes, siguiendo un protocolo estándar. Para confirmar la presencia de insertos de ARNg en el vector concatemero CRISPR, elija colonias de bacterias con un asa de inoculación e inocule cada una en cuatro mililitros de medio LB.

Cultiva los clones durante la noche a 37 grados centígrados en un agitador orbital. Al día siguiente, el ADN se extrae utilizando un kit de minipreparación de plásmidos, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Mezcle aproximadamente 200 nanogramos de cada muestra de ADN con 10 unidades de EcoR1 y cinco unidades de BglII en una reacción de 10 microlitros.

Incluya una mezcla de reacción separada con el vector original correspondiente como control positivo para la comparación de tamaños. Incubar las reacciones a 37 grados centígrados durante tres horas. Ejecute las reacciones de digestión en un gel de agarosa al 1% a 90 voltios durante aproximadamente 20 minutos.

Visualice el gel utilizando un transiluminador UV para identificar los clones con el tamaño de inserto correcto. Para confirmar que los ARNg se han clonado en la posición correcta y, en consecuencia, se han perdido todos los sitios de reconocimiento de Bbs1, digiera los clones seleccionados con cinco unidades de Bbs1 e incluya una mezcla de reacción separada, con el vector original correspondiente como control.

Incubar a 37 grados centígrados durante tres horas, ejecutar las reacciones de digestión en un gel de agarosa al 1% a 90 voltios durante aproximadamente 20 minutos. Visualice el gel utilizando un transiluminador UV para identificar los vectores que no están cortados por Bbs1. Al dividir organoides para electroporación, siembre un mínimo de seis pocillos de una placa de 48 pocillos por transvección.

Siembre los organoides en gotas de matriz basal de 20 microlitros y cultírelos en 250 microlitros de medio WENR más nicotinamida por pocillo a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono en una incubadora humidificada. En el segundo día, reemplace el medio WENR más nicotinamida con 250 microlitros de EGF más noggin, inhibidor de GSK3 y medio inhibidor de roca sin antibióticos. En el tercer día, cambie el medio organoide a EGF más noggin, inhibidor de GSK3, inhibidor de rocas y dimetilsulfóxido al 1,25% sin antibióticos.

En el cuarto día, interrumpa las cúpulas de la matriz del basamento, utilizando una punta de pipeta de un mililitro y transfiera los organoides a un tubo de 1,5 mililitros. Extraiga el contenido de cuatro pocillos de una placa de 48 pocillos en un tubo. Rompa mecánicamente los organoides en pequeños fragmentos pipeteando hacia arriba y hacia abajo con la pipeta P200 aproximadamente 200 veces.

Centrifugar a 600 veces G durante cinco minutos a temperatura ambiente. Después de la centrifugación, retire el medio de todos los tubos y vuelva a suspender las paletas en un mililitro de una proteasa recombinante de grado de cultivo celular. Incubar a 37 grados centígrados durante un máximo de cinco minutos.

Es importante monitorear cuidadosamente el tratamiento con proteasa porque el éxito de la electroporación depende de la obtención de una suspensión celular que contenga grupos de células en lugar de células individuales. Compruebe una gota de 50 microlitros de muestra bajo un microscopio de luz invertida con un objetivo de cuatro veces. Son deseables grupos de 10 a 15 células, ya que esto aumenta la supervivencia de las células después de la electroporación.

Transfiera la suspensión celular a un tubo de 15 mililitros de baja unión y acabe la disociación agregando nueve mililitros de medio basal sin antibióticos. Centrifugar a 600 veces G durante cinco minutos a temperatura ambiente. Desechar el sobrenadante y volver a suspender la paleta en un mililitro de medio sérico reducido.

Cuente el número de celdas con una cámara de Burkes, se necesita un mínimo de una por 10 hasta la quinta celda por reacción de electroporación. Comience este procedimiento añadiendo nueve mililitros de medio sérico reducido al tubo de 15 mililitros que contiene la suspensión celular y la centrífuga a 400 veces G durante tres minutos a temperatura ambiente. Retire todo el sobrenadante y vuelva a suspender la paleta en una solución de electroporación.

Agregue una cantidad total de 10 microgramos de ADN a dos tubos nuevos. Luego, agregue la solución de electroporación a un volumen final de 100 microlitros y mantenga la mezcla de ADN celular en hielo. Transfiera la mezcla de ADN de la celda a la cubeta de electroporación, coloque la cubeta en la cámara del electroporador.

Mida la impedancia presionando el botón apropiado en el electroporador y asegúrese de que sea de 0.030 a 0.055 ohmios. Realice la electroporación de acuerdo con la configuración indicada en el protocolo de texto. Agregue 400 microlitros de tampón de electroporación más inhibidor de rocas a la cubeta y luego transfiera todo su contenido a un tubo de 1,5 mililitros.

Incube a temperatura ambiente durante 30 minutos para permitir que las células se recuperen. Después de 30 minutos, gire a 400 veces G durante tres minutos a temperatura ambiente. Retirar el sobrenadante y volver a suspender la paleta en 20 microlitros por pocillo de matriz basal.

Siembre aproximadamente una vez 10 a la cuarta a una veces 10 a la quinta celdas por pocillo en una placa de 48 pocillos y agregue EGF más noggin, inhibidor de GSK3, inhibidor de roca y medio de dimetilsulfóxido al 1,25%. Incubar a 37 grados centígrados. Al día siguiente, cambie el medio a EGF más noggin, inhibidor de GSK3 e inhibidor de roca y verifique la eficiencia de la transvección observando la expresión de GFP.

Mantenga los organoides a 37 grados centígrados. Dos días después, reemplace el medio con medio nuevo. Cuatro días después de la electroporación, cambie el medio a WENR más nicotinamida y medio inhibidor de rocas y continúe incubando las células a 37 grados centígrados.

La presencia del número correcto de inserciones de ARNg en el vector concatemero se confirma mediante digestión de doble restricción con EcoR1 y BglII. El tamaño esperado de la banda inferior es de aproximadamente 1,6 kilobase para un vector de concatemero de cuatro gRNA y de 1,2 kilobase para un vector de concatemero de tres gRNA. Además, la digestión con Bbs1 confirma que los ARNg se han clonado en la posición correcta y, en consecuencia, se pierden todos los sitios de reconocimiento de Bbs1.

Las construcciones confirmadas se administran a los organoides intestinales de ratón por electroporación para lograr una eficiencia de transvección de hasta el 70%, como lo demuestra la expresión de GFP. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo generar vectores concatemeros de ARNg y cómo entregarlos de manera eficiente a cultivos de organoides 3D mediante el uso de electroporación, para lograr la eliminación de múltiples genes al mismo tiempo.