Inducción de hipertermia leve dirigida en modelos tumorales murinos mediante conversión fototérmica de luz infrarroja cercana mediante nanovarillas de oro intratumorales

La terapia hipertérmica dirigida es una modalidad emergente en el tratamiento del cáncer diseñada para elevar selectivamente la temperatura del tumor y minimizar el daño al tejido sano circundante. Este método describe una forma altamente eficiente, de bajo consumo de recursos y reproducible de inducir hipertermia mediada por nanovarillas de oro en tumores sólidos. El empleo de la inyección intratumoral directa de nanovarillas de oro seguida de la exposición a la luz infrarroja cercana permite un calentamiento preciso, controlado y altamente localizado de los tumores.

El éxito de este protocolo depende de la activación eficiente de los tejidos profundos de las nanovarillas de oro utilizando la longitud de onda adecuada de la luz infrarroja cercana, así como de la monitorización precisa en tiempo real de la temperatura interna del tumor durante todo el procedimiento. Comience las mediciones diarias de tumores a partir del séptimo día, después de la inyección de células cancerosas o cada vez que los tumores se vuelvan palpables. Antes de comenzar el procedimiento, mida el ancho, el largo y la altura del tumor para calcular el volumen total del tumor.

Trate de realizar el procedimiento una vez que los tumores hayan alcanzado un volumen aproximado de 50 milímetros cúbicos. Para nuestro modelo, este volumen tumoral se logró entre el día 10 y el 12 después de la inyección de células cancerosas. En un gabinete de seguridad biológica estéril, use una jeringa de un mil con una aguja de calibre 31 para extraer el volumen apropiado de nanovarillas de oro en función del volumen de cada tumor.

Antes de la inyección de nanovarillas de oro, anestesiar al ratón con un cono nasal que administre isoflurano al 2% a un caudal de 0,8 litros por minuto. Aplique lubricante ocular en ambos ojos para evitar que se sequen y minimizar cualquier daño potencial por láser. Si es necesario, afeite el exceso de pelo alrededor del tumor para asegurar la exposición de la superficie de la piel y use etanol para desinfectar la superficie del tumor, limpiando cualquier pelaje o desecho.

Antes de la exposición al láser, inyecte nanovarillas de oro por vía intratumoral a una concentración de un microgramo por milímetro cúbico de volumen tumoral. Si es necesario, divida la inyección entre dos sitios intratumorales para garantizar una distribución eficiente de nanovarillas doradas dentro del tumor. Asegúrese de limpiar cualquier exceso de nanovarillas doradas en la superficie de la piel después de la inyección.

Para ratones del grupo de control, administre una inyección intratumoral de PBS estéril del volumen equivalente utilizado para los grupos de tratamiento con nanovarillas doradas. Limpie la sonda de temperatura intratumoral con etanol antes de la inserción. Inserte suavemente la sonda de temperatura en el centro de la masa tumoral.

Aplique una capa uniforme de gel de aloe vera de aproximadamente cinco milímetros de espesor sobre la superficie del tumor para prevenir la ulceración de la piel y minimizar el riesgo de lesiones térmicas durante el tratamiento. Ajuste el láser para que se alinee directamente sobre la mitad del tumor. Utilice la tabla de búsqueda de irradiancia para determinar la mejor altura del láser en función del diámetro del rayo láser requerido para cubrir el área de la superficie del tumor.

Encienda el láser y la fuente de enfriamiento termoeléctrica. Luego conecte el sistema láser a la fuente de alimentación. Encienda la fuente de enfriamiento termoeléctrica.

La luz LED azul se encenderá y después de 30 segundos, la temperatura se estabilizará en 25 grados centígrados. Según la tabla de búsqueda de irradiancia, ajuste la salida de corriente del láser para lograr una irradiancia objetivo de aproximadamente un vatio por centímetro cuadrado. En nuestro experimento, una altura de láser de 1,5 centímetros, un diámetro de haz de 1,3 centímetros y una corriente láser de 1800 miliamperios dieron como resultado un valor de irradiancia de 0,82 vatios por centímetro cuadrado, que se optimizó para nuestro modelo tumoral.

A partir de este momento, asegúrese de que todas las personas en la sala de operaciones láser usen gafas de seguridad láser certificadas para la longitud de onda de la luz utilizada. Configure una cámara térmica adyacente a la plataforma láser dirigida al mouse para monitorear la temperatura de la superficie de la piel durante el procedimiento con láser. Comience a grabar en el software de registro de datos termoacoplado y asegúrese de que el gráfico interno de temperatura del tumor en función del tiempo se muestre en tiempo real.

Gire la llave de seguridad láser para habilitar la salida de la fuente. Comience la administración del láser presionando el pedal hacia abajo En el momento del inicio del láser, la temperatura interna del tumor comenzará a aumentar, tardando aproximadamente de 15 segundos a dos minutos en ingresar al rango hipertérmico objetivo de 42 a 48 grados. Si la temperatura interna del tumor se acerca a los 48 grados, retire el pie del pedal, permitiendo que la temperatura vuelva a bajar.

Esta caída de temperatura debería ser visible en tiempo real en el gráfico de visualización de temperatura versus tiempo. Una vez que la temperatura interna del tumor haya bajado a alrededor de 43 grados, vuelva a habilitar la administración de láser con el pedal. La temperatura debe comenzar a subir nuevamente sin caer fuera del rango hipertérmico.

Continúe este ciclo de encendido y apagado del láser para asegurarse de que el tumor permanezca en el rango hipertérmico. El gráfico de visualización de temperatura versus tiempo debería comenzar a reflejar este patrón de ciclo de encendido y apagado del láser. Durante el mantenimiento de la hipertermia tumoral, controle continuamente la temperatura de la superficie de la piel para asegurarse de que se mantenga por debajo de los 50 grados centígrados.

Después de cinco minutos de mantener la hipertermia, suelte el pedal para detener la administración del láser y permita que la temperatura interna del tumor vuelva a bajar a alrededor de 37 grados centígrados. Una vez que el tumor haya vuelto a una temperatura normal, retire la sonda de monitoreo de temperatura y limpie cualquier exceso de gel de aloe vera en la superficie del tumor. Retire el ratón del anestésico del cono nasal y controle la excitación del animal antes de regresar a la jaula Para la recuperación posterior al procedimiento, coloque la jaula parcialmente sobre una almohadilla térmica como se muestra aquí.

Asegúrese de que los ratones hayan vuelto a su comportamiento normal antes de devolverlos a sus instalaciones de alojamiento. Esta tabla proporciona valores de irradiancia en vatios por centímetro cuadrado para diferentes configuraciones de salida de corriente láser en miliamperios y distancias de trabajo en centímetros. Esta tabla se utiliza para determinar la altura adecuada del láser en función del diámetro del haz requerido para cubrir la superficie del tumor y lograr una irradiancia objetivo de aproximadamente un vatio por centímetro cuadrado.

Los valores resaltados en verde en esta tabla indican niveles óptimos de irradiancia cercanos a un vatio por centímetro cuadrado. Esta figura muestra perfiles representativos de temperatura interna del tumor a lo largo del tiempo en milisegundos registrados por la sonda de temperatura interna del tumor durante la exposición del tumor a la luz infrarroja cercana. La Figura A muestra el patrón de ciclo de láser de encendido y apagado en un ratón inyectado con nanovarillas de oro necesario para mantener la temperatura interna del tumor en el rango hipertérmico.

Destaca la importancia de un monitoreo cercano de la temperatura interna del tumor y el ciclo de administración del láser para mantener el rango hipertérmico durante todo el procedimiento. La Figura B muestra la diferencia promedio en la temperatura interna del tumor entre los ratones inyectados con nanarod de oro y los ratones inyectados con PBS durante los cinco minutos de exposición a la luz infrarroja cercana. Sin la inyección de nanovarillas de oro, los tumores expuestos a la luz infrarroja cercana no se calentarán en un rango hipertérmico leve.

Los tumores inyectados con PBS se estabilizan alrededor de 39 a 40 grados Celsius en contraste con los tumores inyectados con nanovarillas de oro que alcanzan temperaturas hipertérmicas de 42 a 48 grados. Nuestra terapia hipertérmica dirigida mediada por nanovarillas de oro induce la reducción del volumen tumoral en múltiples modelos de cáncer reflejados dentro de las 48 a 72 horas posteriores al tratamiento. La Figura A muestra las mediciones del volumen tumoral en 4T1, un modelo de cáncer de mama después de la terapia hipertérmica dirigida mediada por nanovarillas de oro.

La figura B muestra B16 F10, un modelo de melanoma, y la figura C muestra CT26, un modelo de cáncer colorrectal. Una reducción o desaceleración del crecimiento del volumen tumoral dentro de las 48 a 72 horas posteriores al tratamiento es indicativa de un resultado positivo. Al realizar este protocolo, el monitoreo preciso en tiempo real de la temperatura interna del tumor es crucial para garantizar que se logre un rango hipertérmico leve y que el tratamiento se administre de manera consistente.

Después de este procedimiento, se deben realizar mediciones diarias del volumen tumoral para registrar los cambios en el volumen tumoral. La regresión tumoral dentro de dos o tres días es un indicador positivo del éxito del tratamiento.