Ingeniería 3D Flipwell para el desarrollo de sistemas asíncronos para terapias toxicológicas e inmunomoduladoras en células bacterianas, intestinales e inmunitarias

Hemos desarrollado un sistema de co-cultivo 3D que imita el entorno mucoso intestinal para estudiar la diafonía serial y evaluar las respuestas a los fármacos que podrían utilizarse para el cribado de drogas y para comprender las interacciones celulares mucosas. Diferentes grupos han desarrollado varios sistemas de cultivo distintos para modelar el entorno mucoso intestinal utilizando técnicas de bioingeniería muy complejas. Pero en su lugar, desarrollamos un sistema de co-cultura que es mucho más fácil de hacer usando materiales menos costosos.

Nuestro sistema de cocultivo reveló que un fármaco proteinogénico desencadena respuestas coordinadas entre bacterias intestinales, células epiteliales e inmutarias, activando la inmunidad del huésped probablemente con nuestros metabolitos bacterianos y mediando la comunicación entre especies. Nuestro objetivo es estudiar tanto cepas bacterianas aeróbicas como anéróbicas y sus metabolitos para descubrir efectos moduladores del sistema inmunitario, allanando el camino para nuevas estrategias inmunoterapéuticas basadas en metabolitos bacterianos. Para empezar, abre una tapa para placa de Petri y déjala a un lado.

Coloca una hoja de bisturí en el borde del fondo de la placa de Petri. Coge unas pinzas estériles y sujeta suavemente el inserto hacia arriba para sacarlo del envase. Con la otra mano, toma la hoja del bisturí estéril y súbela al inserto.

Con un movimiento en forma de C, perfora la membrana en el borde y desliza suavemente la hoja del bisturí alrededor de la parte inferior del inserto, manteniéndose cerca de la pared de plástico. Corta la membrana PET y usa el segundo juego de pinzas para retirarla. Luego usa la hoja del bisturí para raspar cualquier fragmento blanco de membrana y limpiar el borde y el borde del inserto.

Después, extiende suavemente una perla de silicona de 2-3 milímetros alrededor de la parte inferior del inserto, teniendo cuidado de no tocar la membrana. Coge el segundo juego de pinzas estériles y levanta cuidadosamente el primer inserto, sin la membrana, de su mochila protectora. Junta los dos insertos de abajo a abajo para que los bordes inferiores se alineen.

Cuando la pila Flipwell esté pegada, colócala dentro del paquete estéril original o en una placa de Petri profunda para que se seque durante 72 horas. Usa la tapa de las placas de Petri especificadas para cubrir el conjunto de la pila. Para esterilizar los conjuntos de la pila, utiliza pinzas estériles para colgar la pila Flipwell en el borde del borde de la placa de Petri profunda especificada.

Luego, cierra el marco de cristal del armario de bioseguridad y enciende la luz ultravioleta. Para comprobar si hay fugas antes del recubrimiento de colágeno, primero añade 500 microlitros de PBS estéril o agua desionizada estéril. Al día siguiente, aspira el líquido que se usa para la prueba antes de secar las chimeneas durante 1-2 horas dentro del armario de bioseguridad.

Para recubrir la membrana con colágeno, abre la tapa de la placa de Petri y deja que el Flipwell cuelgue del borde de la placa de Petri. Añade cuidadosamente 200 microlitros de solución de colágeno a un lado de la pila de insertos. Aspira la solución de colágeno tras una hora, luego pipeta 200 microlitros de PBS estéril. Después de aspirar el PBS, cubre la placa de Petri con una tapa y deja que la membrana seque durante 60 minutos dentro del armario.

Cuando la membrana esté seca, usa pinzas o pinzas estériles y gira la Flipwell hacia el lado opuesto y déjala colgar del borde de la placa de Petri. Para hacer el inserto bacteriano, coloca dos juegos de pinzas estériles y los insertos de 24 pozos dentro del armario de bioseguridad. Con unas pinzas estériles, levanta el inserto de su paquete estéril.

Con el segundo juego de pinzas o pinzas, rompe las patas pequeñas de plástico en la parte inferior del inserto. Prueba el inserto de 24 pozos encajándolo dentro de una de las pilas estériles de insertos de co-cultura Flipwell o en los insertos originales de 12 pozos. Para comenzar a sembrar los Flipwells, sembra 500 microlitros de las líneas celulares epiteliales a cada lado del lado apical del Flipwell.

Cubre los conjuntos con una tapa de placa de Petri y luego incuba a 37 grados Celsius con un 5% de dióxido de carbono durante la noche hasta que las células se adhieran. Abre la tapa de la placa de Petri y aspira el medio DMEM desde el lado apical de la pila Flipwell. Con pinzas estériles, coge el Flipwell con cuidado por el gancho y gíralo 180 grados.

Con el segundo juego de pinzas estériles, agarra la pila Flipwell por el otro gancho que ahora mira hacia arriba. Luego baja el conjunto de nuevo a la placa de Petri y cuelga el gancho sobre el borde de la placa de Petri. Añadir 500 microlitros de suspensión de celda THP-1 al lado apical del conjunto de insertos de cocultivo.

Ajusta el medio HT-29 para las células epiteliales del colon añadiendo medio a la placa de Petri del pozo profundo. Para eliminar cualquier burbuja de aire, sujeta la pila Flipwell por el brazo con pinzas estériles. Baja con cuidado una aguja de gavage dentro y debajo del conjunto del inserto y coloca muy suavemente la punta blanda cerca de la burbuja de aire.

Con cuidado y muy despacio, tira del émbolo de la jeringuilla y observa cómo la burbuja de aire desaparece poco a poco. Después, retira cuidadosamente la aguja y la jeringuilla del Flipwell. Después de eliminar las burbujas de aire con una aguja de gavage, cultiva ambos tipos celulares en la incubadora de cultivo celular.

Con pinzas, coloca el inserto dentro de una placa de Petri estéril y cúbrela con la tapa. Transfiere la placa de Petri con los Flipwells al armario de bioseguridad y reparte, en el lado opuesto del plato, con insertos bacterianos. Pipetear 300 microlitros del medio DMEM desde el lado apical del Flipwell para permitir la inserción bacteriana, luego cubrirlo con la tapa de la placa de Petri.

Ahora, añade entre 50 y 100 microlitros de cultivo de Bacillus subtilis a los insertos bacterianos de 24 pozos e insértalo en la parte superior de Flipwell. Gira el brazo y cuélgalo del borde de la pila de insertos Flipwell co-culture. Sujeta la pila con el segundo juego de pinzas estériles.

Tras una incubación de tres horas, utiliza pinzas estériles para extraer el inserto bacteriano del Flipwell. Coloca el Flipwell dentro de un tubo cónico de 50 mililitros sin desmontar. Para desmontar el Flipwell para microscopía electrónica, sujétalo con ambas manos y retuerce cada parte pegada del conjunto.

Gira el inserto con la membrana y colócala con la membrana hacia arriba. Sujeta el inserto, corta cuidadosamente la membrana con una hoja de bisturí y luego colócala dentro de un tubo de 1,7 mililitros que contiene solución de aldehído paraformo. Para la microscopía confocal, añadir 300 microlitros de PBS estéril al lado apical.

Retira cuidadosamente la pila de la placa de Petri después de pipetear el PBS. Ahora, gira el Flipwell y añade 300 microlitros de PBS al lado RPMI ahora orientado hacia arriba del conjunto de inserciones de co-cultivo Flipwell, y luego aspira la solución salina tamponada con fosfato. Usando una pipeta de 200 microlitros, crea una gran gota de PBS.

Gira el conjunto del inserto para separarlo en los insertos. Luego coloca cuidadosamente la pila Flipwell con las pilas THP-1 sobre la gota de 200 microlitros de PBS. Añade 200 microlitros de tampón de permeabilización en la parte superior con células epiteliales del colon y deje reposar durante 10 minutos.

Para la tinción inmunofluorescente, pipetea 300 microlitros de anticuerpo primario en la parte superior del inserto. Añade 300 microlitros de anticuerpo primario al pozo de una placa de 12 pozos, luego coloca el inserto dentro del pozo, encima de la gota. Cubre bien el anticuerpo.

La tinción mostró aumentos dramáticos en la secreción de moco en el compartimento epitelial intestinal tras el tratamiento con sepiapterina, como lo indican los incrementos de la proteína marcadora epitelial CK20 y la proteína mucosa MUC2. En monocultivos de THP-1, el tratamiento con sepiapterana aumentó significativamente la expresión del marcador de macrófago M1 CD80, mientras que el marcador de Macrófago M2 CD163 disminuyó, indicando la polarización de M1. La microscopía electrónica de barrido reveló un aumento de la secreción de moco de células epiteliales en cocultivos tratados por separado.

El tratamiento con sepiapterana indujo la morfología de los macrófagos que se asemeja al fenotipo M1 tanto en monocultivos como en cocultivos. Las células bacterianas en monocultivos tratados con sepiapterana mostraron superficies arrugadas características de la formación de biofilm.