SCAnED - Una macro de segmentación de la piel de código abierto para la detección semiautomatizada de células y núcleos en compartimentos epidérmicos y dérmicos de la piel

En nuestro trabajo, investigamos los mecanismos reguladores que mantienen la homeostasis tisular a nivel molecular, celular, estructural y mecánico. Nuestro objetivo es comprender condiciones patológicas, como la inflamación de la piel o el cáncer. Con nuevas herramientas de imagen de alta resolución y multiómica, ahora podemos mapear los cambios celulares y de expresión génica en tejidos en 2D y 3D.

Esto está impulsando mucho nuestra comprensión de cómo se desarrollan y progresan las enfermedades. Uno de los grandes retos ahora mismo es la enorme cantidad de datos generados por la microscopía avanzada. Y aunque hay más herramientas disponibles para analizar imágenes, a menudo no son fáciles de usar para personas sin mucha experiencia, o resultan bastante caras.

Nuestro protocolo ofrece una herramienta gratuita y fácil de usar para analizar células de la piel humana tanto en la epidermis como en la dermis. Mejora la precisión respecto a las herramientas generales y no requiere programación ni experiencia previa en análisis de imágenes. Para empezar, abre las imágenes de inmunofluorescencia en Fiji o Imagen J, usando los formatos bio con la configuración predeterminada.

No dividas los canales durante este paso. Descarga la macro SCAnED y ejecuta seleccionando plugins. Luego macros y pulsar ejecutar.

Selecciona el archivo de script macro SCAnED cuando se lo pida. Sigue las instrucciones en pantalla que proporciona la macro. Selecciona el canal de E-cadherin cuando la macro te lo indique.

A continuación, navega a la imagen, elige ajustar y luego umbral para ajustar manualmente el umbral del canal E-cadherina. Haz clic en OK una vez que la región epidérmica esté completamente capturada. Luego selecciona el canal DAP-E cuando se le pida que continúes con la segmentación.

Define automáticamente los niveles de intensidad para la segmentación de núcleos al usar la función umbral. Para StarDist, abre el plugin en Image J. Carga el modelo de detección de núcleos en la interfaz gráfica de StarDist y haz clic en el canal de núcleos para seleccionarlo para análisis. Ahora, ajusta la configuración de tiles en StarDist para que coincida con el tamaño esperado del parche de 256 por 256 píxeles.

Cuando se le pida, selecciona sí para medir la intensidad del marcador dentro de los núcleos. Luego repite el proceso de segmentación y análisis para cada canal de fluorescencia. Después de procesar todos los canales, guarda los datos de salida como archivos de valores separados por comas, tal y como indica la macro.

Para la región citoplasmática, cuando se ha realizado la segmentación de núcleos usando la función umbral, se aplica dilatación binaria para expandir la región nuclear de interés. Cuando StarDist se ha utilizado para la segmentación de núcleos, se aplica la expansión de agrandamiento a la región nuclear de interés. Selecciona sí cuando se te pida para medir la intensidad del marcador en toda la región celular.

Luego guarda los archivos de datos resultantes en formato de valores separados por comas según las instrucciones macro. Establecer umbrales de intensidad específicos de marcadores utilizando muestras control de isotipo. Descarga el cuaderno Jupyter correspondiente y navega a Google Collab para seleccionar archivo, seguido de abrir cuaderno.

Elige el archivo y ejecuta las celdas de código secuencialmente. Cuando se te lo indique con la opción de elegir archivos, haz clic en el botón y sube el archivo de valores separados por comas. Para cada anticuerpo, calcular la intensidad media de fluorescencia usando los archivos de control de isotipo.

Para determinar los umbrales de corte, abre el cuaderno de diagramas de puntos, sube los datos de control de isotipo y ejecuta el código. Basándose en la distribución de puntos en los gráficos tanto para el control isotipo como para datos específicos de anticuerpos, se selecciona un umbral de intensidad para distinguir la señal de fondo de la expresión verdadera del marcador. Utiliza este umbral para clasificar cada celda como positiva o negativa para el marcador dado.

Finalmente, crea gráficos de puntos para visualizar patrones de coexpresiones de marcadores ejecutando el código del gráfico de puntos en el cuaderno de Google Colaps. En imágenes segmentadas manualmente, las células positivas para vimentina mostraron una señal citoplasmática fuerte con límites claros de ROI que cubren todo el cuerpo celular. La segmentación semiautomatizada SCAnED capturó células positivas para vimentina con límites similares utilizando un enfoque de umbral y dilatación.

La comparación cuantitativa de la intensidad de vimentina en 21 células no mostró diferencias significativas entre la segmentación manual y la segmentación SCAnED. El análisis histográfico reveló una mayor frecuencia de células positivas a vimentina en la dermis de psoriasis en comparación con la piel sana. El análisis de las células dérmicas mostró un aumento de células positivas a vimentina para CD-90 en psoriasis en comparación con piel sana.

En la epidermis, las muestras de psoriasis mostraron un aumento de células positivas a vimentina para CD-90, posiblemente queratinocitos, en comparación con piel sana. Los recuentos celulares positivos de vimentina en la epidermis psoriásica y sana fueron comparables entre SCAnED y QuPath. la segmentación visual mostró que SCAnED asignaba con mayor precisión las células de borde a la epidermis que QuPath, que asignaba erróneamente varias.