Medición de Span replicativa vida en la levadura en ciernes

La levadura en ciernes Croce Visi se ha utilizado ampliamente para estudiar la biología del envejecimiento. En este artículo, presentamos un protocolo general para medir la vida replicativa de las células madre de levadura. Hola, soy Kristen Steffen del laboratorio de Brian Kennedy en el Departamento de Bioquímica de la Universidad de Washington.

Hoy te mostraremos un procedimiento para medir la vida útil replicativa de las células madre de levadura. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar los genes que influyen en la vida útil de las células de levadura. Así que comencemos.

Para el experimento de vida útil replicativa y la preparación de células de levadura para el análisis de vida útil, las placas sólidas YEPD deben estar preparadas para hacer esto. Utilice una técnica estéril adecuada para preparar estas placas de agar YEPD. Prepare al menos dos placas por cada cuatro o cinco cepas que se analizarán en el experimento de vida útil.

Estas placas deben prepararse al menos dos días antes del experimento de vida útil y dejarse secar antes de comenzar el ensayo de vida útil. Si el experimento no se lleva a cabo dentro de los cuatro o cinco días posteriores al vertido de las placas, deben envolverse en una película o plástico y colocarse en una incubadora refrigerada para evitar la desecación. Retire las cepas de levadura de las cepas congeladas y raye para colonias individuales.

En las placas de agar YEPD. Se pueden rayar fácilmente hasta seis cepas en la misma placa YEPD dividiendo la placa en gajos en forma de pastel del mismo tamaño. Incubar las células a 30 grados centígrados durante dos días.

Después de la incubación, retire las células de la incubadora y coloque las células de una sola colonia en una placa YEPD fresca. En este momento, las deformaciones que se van a analizar deben recubrirse para garantizar que el experimento de vida útil replicativo se realice a ciegas. Donde los disectores no conocen la identidad de las cepas individuales. Cadenas.

A continuación, incube las células recubiertas parcheadas a 30 grados centígrados hasta la noche siguiente. Retire las células y parche ligeramente las células de cada cepa recubierta en placas YEPD frescas. Estas servirán como placas experimentales utilizadas para la vida útil replicativa.

Las celdas de análisis deben estar parcheadas a lo largo de una línea vertical en el lado izquierdo de la placa YEPD. No transfiera demasiadas células a una sola placa YEPD fresca. Dado que esto causará un crecimiento espeso de las células durante la incubación nocturna y afectará su vida útil replicativa, lo óptimo es aproximadamente de tres a cinco parches por placa.

Suponiendo que el análisis replicativo de la vida útil se realizará en 20 células de cada parche, ahora el experimento de vida útil está todo configurado y todo lo que tienen que hacer es incubar durante la noche en la mesa de trabajo. Y luego mañana podemos comenzar la micro disección para posicionar las células de levadura en la placa y obtener células hijas vírgenes. Para el análisis replicativo de la vida útil.

Utilice un microscopio equipado con un aparato de microdisección adecuado para levaduras. Transfiera aproximadamente 50 células de la primera cepa del parche a una posición en la placa distal a las células parcheadas. Si la platina del microscopio está graduada, estas gradaciones se pueden utilizar para garantizar que las células sean fáciles de encontrar durante las iteraciones posteriores.

A veces, las células pueden atascarse en la aguja, lo que puede ser un problema si salen en el momento equivocado. Para asegurarse de que la aguja esté limpia y libre de células, tóquela repetidamente con la superficie del agar. A continuación, crea un agujero en el agar forzando la aguja a través de la superficie del agar.

Este orificio servirá como marcador para orientarlo en la placa durante las iteraciones posteriores de disección y eliminación de células punteadoras. Ten cuidado de que no entren células de levadura en el agujero, o crecerán y formarán una colonia justo encima del agujero. Celdas de levadura individuales alineadas verticalmente en 20 posiciones espaciadas uniformemente con uno a tres diámetros de aguja entre cada posición de celda.

Por cada pocas celdas, coloque dos celdas una al lado de la otra en la misma posición en la línea en lugar de una. Esto permite la redundancia durante la selección de células hijas vírgenes. Si una de las celdas transferidas no se divide entre las posiciones 10 y 11 de la línea, cree una serie horizontal de siete a ocho agujeros en el agar.

Esto servirá como un marcador para orientarlo en la placa durante las disecciones posteriores y las extracciones de células hijas. Nuevamente, tenga cuidado de no meter células de levadura en los agujeros o crecerán y formarán una colonia. Repita este procedimiento para cada parche en la placa, continuando colocando las celdas verticalmente a lo largo del mismo eje.

Es importante recordar que al crear el agujero en el AER para que el número de agujeros creados corresponda al número de parche, de modo que haya un agujero para el primer parche y dos agujeros para el segundo. Una vez que las células se hayan dispuesto para cada parche, paraforme la placa e incube a 30 grados centígrados durante aproximadamente dos horas. Recuerde que, a partir de este momento, todas las placas deben ser prefilmadas, excepto cuando se someten a disección.

Para evitar la desecación, repita este procedimiento para cada placa. En el experimento. Para el análisis de la vida útil, es importante asegurarse de que cada célula comience como una célula hija virgen.

Para hacer esto, primero, retire las placas de la incubadora y verifique que la mayoría de las celdas de la matriz hayan sufrido una división celular. Así que lo que tenemos aquí son células que se han alineado previamente, y se puede ver que después de dos horas en la incubadora, han comenzado a dividirse. Y ahora tenemos una célula madre, la más grande unida a su cuerpo, la célula hija virgen, y esa célula hija virgen es una célula que se utilizará para comenzar la vida.

Si se necesita tiempo adicional para permitir que se completen las divisiones celulares, devuelva la placa a la incubadora. Empezando por la primera celda de la matriz. Use la aguja para separar las células hijas de la célula madre colocando suavemente la aguja encima de las células adheridas.

A veces es útil golpear el costado de la base del microscopio mientras la aguja descansa sobre las células. A continuación, coloque la célula hija separada en la línea vertical de células, sustituyendo la célula madre y cualquier célula hija adicional y moviéndolas temporalmente a un lado. Repita estos pasos para cada una de las celdas de la matriz.

Si una celda no se divide, tome una celda hija de una de las celdas redundantes colocadas junto a la celda de prueba. Cuando termine, debe tener 20 celdas hijas para cada parche alineadas verticalmente en la placa de vida útil. Recoge todas las células madre y las células hijas adicionales en una pila y transfiérelas de nuevo a un área cerca de los parches llamada cementerio.

Es importante mantener las células no deseadas lejos de las células que se someten a un análisis de vida útil para evitar la formación de microcolonias y el agotamiento de los nutrientes locales. Una vez separadas las células, se descompara la placa e incuba a 30 grados centígrados durante aproximadamente dos horas. Repita estos pasos para cada plato del experimento.

Para medir la capacidad de replicación de las células individuales, deberá preparar hojas de datos de vida útil. Una hoja de datos de vida útil puede ser una cuadrícula simple donde cada fila corresponde a una celda madre individual y cada columna corresponde a un punto de edad. Asegúrese de etiquetar cada hoja de datos de acuerdo con el número de cepas a analizar.

Para comenzar, primero, retire las placas de la incubadora y verifique que la mayoría de las celdas de la matriz hayan sufrido al menos una división celular. Si se necesita tiempo adicional para permitir que se complete la división celular, devuelva la placa a la incubadora. Comience con la primera celda de la matriz en la primera placa y observe visualmente la madre y la hija, la célula o las células para determinar el número de divisiones celulares que se han producido.

Por lo general, es fácil determinar cuántas células hijas ha producido una madre en función de los patrones característicos de la disposición de las células. Este es muy fácil de ver cuántas células produjo porque hay dos allí y son del mismo tamaño y ambos son más pequeños que la madre. Registre el número de células hijas producidas por la célula madre en el cuadro correspondiente de la hoja de puntuación de la vida útil.

A continuación, utilice la aguja para separar las células hijas de la célula madre como se ha descrito anteriormente, colocando suavemente la aguja encima de las células adheridas y golpeando el lado de la base del microscopio mientras la aguja descansa sobre las células. Mantenga la célula madre en su posición en la línea vertical y desplace temporalmente la célula o células hijas. Repita estos pasos para cada una de las celdas de la matriz.

Finalmente, recoge todas las células hijas descartadas y muévelas al cementerio ubicado cerca de los parches originales. Para filmar la placa e incubar a 30 grados centígrados durante dos o tres horas. Repita el descarte de las células hijas y la incubación.

Paso para cada placa del experimento. Repita todo este procedimiento hasta que todas las células madre hayan dejado de dividirse. Tenga en cuenta que a medida que las células madre envejecen, la progresión del ciclo celular se vuelve más lenta y será deseable incubar la placa durante períodos de tiempo más largos entre los puntos de edad después, las placas se pueden colocar a cuatro grados centígrados durante la noche.

Los datos brutos producidos por un experimento replicativo de esperanza de vida son una lista de números correspondientes a las células hijas producidas por cada célula madre en cada punto de edad. Como se ve aquí. Al sumar cada fila de la hoja de puntuación, se obtiene la vida útil replicativa de cada célula madre.

Los datos de otras células del mismo grupo experimental se pueden agrupar para generar una curva de supervivencia y realizar cálculos estadísticos. La curva debería ser más o menos consistente con la cinética de Gomperts, mostrando una forma sigmoidal con baja mortalidad temprana, seguida de una disminución relativamente rápida en la supervivencia y un aplanamiento de la curva a edades más avanzadas. Acabamos de mostrarte cómo realizar un experimento de vida útil replicativa de levadura.

Al realizar este procedimiento, es importante recordar que las células continuarán dividiéndose cuando no estén en el frío. Así que recuerde poner las placas a cuatro grados durante la noche para que no termine con demasiadas células hijas para contar por la mañana. Así que eso es todo.

Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.