Medición de Span replicativa vida en la levadura en ciernes

La levadura de brotación Croce Visi se ha utilizado ampliamente para estudiar la biología del envejecimiento. En este artículo, presentamos un protocolo general para medir la longevidad replicativa de las células madre de levadura. Hola, soy Kristen Steffen del laboratorio de Brian Kennedy en el Departamento de Bioquímica de la Universidad de Washington.

Hoy les mostraremos un procedimiento para medir la longevidad replicativa de las células madre de levadura. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar genes que influyen en la longevidad de las células de levadura. Así que comencemos.

Para el experimento de duración de la vida replicativa y la preparación de células de levadura para el análisis de longevidad, es necesario preparar placas sólidas de YEPD. Utilice una técnica estéril adecuada para preparar estas placas de agar YEPD. Prepare al menos dos placas por cada cuatro o cinco cepas que se analizarán en el experimento de longevidad.

Estas placas deben prepararse al menos dos días antes del experimento de duración de vida y deben dejarse secar antes de comenzar el ensayo de longevidad. Si el experimento no se llevará a cabo dentro de los cuatro o cinco días posteriores al vertido de las placas, estas deben envolverse con película de parafina o plástico y colocarse en una incubadora refrigerada para prevenir la desecación. Retire las cepas de levadura de los cultivos congelados y siembre por estría para obtener colonias aisladas.

En las placas de agar YEPD. Hasta seis cepas pueden estriarse fácilmente en la misma placa YEPD dividiendo la placa en sectores triangulares de tamaño igual. Incubar las células a 30 grados Celsius durante dos días.

Después de la incubación, retire las células del incubador y siembre células de una colonia individual en una placa YEPD fresca. En este momento, las cepas que se van a analizar deben ser revestidas para asegurar que el experimento de duración de la vida replicativa se realice de forma ciega, donde los microdisectores no conozcan la identidad de las cepas individuales.

A continuación, incubar las células recubiertas con parche a 30 grados Celsius hasta la noche siguiente. Retirar las células y hacer un parche ligero de células de cada cepa recubierta en placas YEPD frescas. Estas servirán como las placas experimentales utilizadas para la vida útil replicativa.

Las células de análisis deben sembrarse a lo largo de una línea vertical en el lado izquierdo de la placa YEPD. No transfiera demasiadas células a una sola placa YEPD fresca. Dado que esto provocaría un crecimiento denso de las células durante la incubación nocturna y afectaría su vida útil replicativa, entre tres y cinco siembras por placa es lo óptimo.

Suponiendo que se realizará el análisis del tiempo de vida replicativo en 20 células de cada sector, ahora el experimento de longevidad está completamente preparado y todo lo que queda es incubarlo durante la noche sobre la superficie del banco de trabajo. Luego, mañana podremos comenzar la microdisección para posicionar las células de levadura en la placa y obtener células hijas vírgenes, para el análisis del tiempo de vida replicativo.

Utilice un microscopio equipado con un aparato de microdisección adecuado para levaduras. Transfiera aproximadamente 50 células del primer cepa en placas a una posición en la placa distal a las células en placas. Si la platina de su microscopio está graduada, estas graduaciones pueden utilizarse para asegurar que las células sean fáciles de localizar durante iteraciones posteriores.

A veces, las células pueden quedar atrapadas en la aguja, lo cual puede ser un problema si salen en el momento equivocado. Para asegurarse de que la aguja esté limpia y libre de células, tóquela repetidamente contra la superficie del agar. Luego, cree un orificio en el agar forzando la aguja a través de su superficie.

Este orificio servirá como marcador para orientarse en la placa durante las iteraciones posteriores de la disección y la eliminación de las células puntuales. Tenga cuidado de no introducir células de levadura en el orificio, ya que podrían crecer y formar una colonia directamente encima del mismo. Alinee verticalmente células individuales de levadura en 20 posiciones equidistantes, dejando entre cada posición de célula uno a tres diámetros de aguja.

Para cada grupo de pocas células, coloque dos células una al lado de la otra en la misma posición de la línea, en lugar de una sola. Esto permite redundancia durante la selección de células hijas vírgenes. Si una de las células transferidas no se divide entre las posiciones 10 y 11 de la línea, cree una serie horizontal de siete a ocho orificios en el agar.

Esto servirá como marcador para orientarse en la placa durante las disecciones posteriores y la eliminación de células hijas. Nuevamente, tenga cuidado de no introducir células de levadura en los orificios, ya que podrían crecer y formar una colonia. Repita este procedimiento para cada sector de la placa, continuando con la disposición de las células verticalmente a lo largo del mismo eje.

Es importante recordar que al crear el orificio en la AER, el número de orificios realizados debe corresponder al número de parche, de modo que haya un orificio para el primer parche y dos orificios para el segundo. Una vez que las células hayan sido dispuestas para cada parche, selle la placa con película adhesiva y incube a 30 grados Celsius durante aproximadamente dos horas. Recuerde que, a partir de este momento, todas las placas deben estar cubiertas con película adhesiva excepto cuando se estén sometiendo a disección.

Con el fin de evitar la desecación, repita este procedimiento para cada placa en el experimento. Para el análisis de longevidad, es importante asegurarse de que cada célula comience como una célula hija virgen.

Para hacer esto primero, retire las placas del incubador y verifique que la mayoría de las células del arreglo hayan experimentado una división celular. Lo que tenemos aquí son células que fueron alineadas previamente, y puede observarse que tras dos horas en el incubador, han comenzado a dividirse. Ahora tenemos una célula madre, la más grande unida a su cuerpo, la célula hija virgen, y esa célula hija virgen es la célula que se utilizará para iniciar la vida útil.

Si se necesita tiempo adicional para permitir que se completen las divisiones celulares, regrese la placa al incubador. Comenzando con la primera célula de la matriz, use la aguja para separar las células hijas de la célula madre colocando suavemente la aguja encima de las células adheridas.

A veces resulta útil golpear suavemente el lateral de la base del microscopio mientras la aguja descansa sobre las células. A continuación, coloque la célula hija separada en la línea vertical de células, reemplazando la célula madre y cualquier otra célula hija adicional, y desplace temporalmente las demás a un lado. Repita estos pasos para cada una de las células del arreglo.

Si una célula no logra dividirse, tome una célula hija de una de las células redundantes colocadas junto a la célula de prueba. Al finalizar, debe tener 20 células hijas para cada sector, alineadas verticalmente en la placa de vida útil. Recolecte todas las células madre y las células hijas adicionales en un montón y transfiéralas de regreso a un área cercana a los sectores denominada cementerio.

Es importante mantener las células no deseadas lejos de las células que están siendo analizadas para la determinación de la longevidad, a fin de prevenir la formación de microcolonias y el agotamiento de nutrientes locales. Una vez que las células hayan sido separadas, retire el medio del plato e incube a 30 grados Celsius durante aproximadamente dos horas. Repita estos pasos para cada placa del experimento.

Para medir la capacidad replicativa de células individuales, deberá preparar hojas de datos de duración de vida. Una hoja de datos de duración de vida puede ser una cuadrícula sencilla donde cada fila corresponda a una célula madre individual y cada columna corresponda a un punto de edad. Asegúrese de etiquetar cada hoja de datos según el número de cepas que se analizarán.

Para comenzar, primero retire las placas del incubador y verifique que la mayoría de las células del arreglo hayan experimentado al menos una división celular. Si se necesita más tiempo para permitir que se complete la división celular, regrese la placa al incubador. Comience con la primera célula del arreglo en la primera placa y observe visualmente la célula madre y la hija, o células, para determinar el número de divisiones celulares que han ocurrido.

Por lo general, es fácil determinar cuántas células hijas ha producido una célula madre basándose en patrones característicos de disposición celular. Este caso es muy sencillo para ver cuántas células produjo, porque hay dos células, son del mismo tamaño y ambas son más pequeñas que la célula madre. Registre el número de células hijas producidas por la célula madre en el casillero correspondiente de la hoja de puntuación de duración de vida.

A continuación, utilice la aguja para separar las células hijas de la célula madre como se describió previamente, colocando suavemente la aguja encima de las células adheridas y golpeando ligeramente el lateral de la base del microscopio mientras la aguja descansa sobre las células. Mantenga la célula madre en su posición sobre la línea vertical y mueva temporalmente la célula o células hijas hacia un lado. Repita estos pasos para cada una de las células de la matriz.

Finalmente, recolecte todas las células hijas descartadas y trasládelas al cementerio ubicado cerca de los parches originales. Selle la placa con película de parafina e incube a 30 grados Celsius durante dos o tres horas. Repita el descarte de las células hijas y la incubación.

Paso para cada placa en el experimento. Repita todo este procedimiento hasta que todas las células madre hayan dejado de dividirse. Tenga en cuenta que a medida que las células madre envejecen, la progresión del ciclo celular se vuelve más lenta y será conveniente incubar la placa durante períodos más largos entre los puntos de edad; posteriormente, las placas pueden colocarse a cuatro grados Celsius durante la noche.

Los datos brutos producidos por un experimento de duración de la vida replicativa consisten en una lista de números que corresponden a las células hijas producidas por cada célula madre en cada punto de edad. Como se observa aquí. Al sumar cada fila de la hoja de puntuación, se obtiene la duración de la vida replicativa para cada célula madre.

Se pueden agrupar datos de otras células del mismo grupo experimental para generar una curva de supervivencia y realizar cálculos estadísticos. La curva debe ser aproximadamente coherente con la cinética de Gompertz-Makeham, mostrando una forma sigmoidea con baja mortalidad temprana, seguida de una disminución relativamente rápida en la supervivencia y un aplanamiento de la curva a edades avanzadas. Acabamos de mostrarle cómo realizar un experimento de longevidad replicativa en levaduras.

Al realizar este procedimiento, es importante recordar que las células continuarán dividiéndose siempre que no estén en frío. Por lo tanto, recuerde colocar las placas a cuatro grados durante la noche para no terminar con demasiadas células hijas que contar por la mañana. Eso es todo.

Gracias por ver este video y mucha suerte con sus experimentos.