Name: Medición de Span replicativa vida en la levadura en ciernes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-06-25T00:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 41 s
Description: Aprende a medir el span replicativo en células madre de levadura Saccharomyces cerevisiae. Este protocolo permite estudiar genes que influyen en la longevidad celular y los mecanismos del envejecimiento.

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Este trabajo fue apoyado por una beca de MK y BKK de la Ellison Medical Foundation. MK es una Ellison Medical Foundation de Nueva Académico en el envejecimiento. Nos gustaría dar las gracias a Soumya Kotireddy de asistencia durante el rodaje.

Parte 1: Preparar las cepas y las placas para el análisis de la vida replicativa lapso En esta sección se describe la preparación de las placas de YEPD sólida para su uso en el experimento de replicación vida y la preparación de las células de levadura para el análisis de vida útil. <ol><li> Utilizando una técnica estéril su caso, preparar las placas de agar YEPD (1% extracto de levadura, 2% Bacto-peptona, 2% de agar, 2% de glucosa) que será utilizado para el cultivo de células de levadura y para el análisis abarcan replicativa vida. Usted debe preparar por lo menos dos placas por cada 4-5 cepas para ser analizados en el experimento de vida. Las placas deben estar preparados por lo menos 2 días antes del experimento esperanza de vida y se deja secar antes de comenzar el ensayo de vida útil. Si el experimento no se iniciará dentro de 4-5 días de verter las placas, deben ser colocados en una incubadora refrigerada y envuelto en parafina o plástico para evitar la desecación. </li><li> Eliminar las cepas de levadura de las existencias congeladas y racha de colonias aisladas en placas de agar YEPD. Hasta 6 cepas pueden ser sembradas en la placa de YEPD mismo mediante la separación de la placa de igual tamaño en forma de pastel cuñas. </li><li> Se incuban las células a 30 ° C durante 2 días. </li><li> Eliminar las células de la incubadora y las células de parches de una sola colonia en una placa de YEPD fresco. Dos parches de dos colonias diferentes se deben generar para cada cepa. En este momento, las cepas a analizar deben ser codificados para asegurar la vida replicativa experimento lapso se lleva a cabo &quot;a ciegas&quot;, donde los disectores no conocer la identidad de las distintas cepas. </li><li> Se incuban las células parcheado, codificado a 30 ° C hasta la noche siguiente. </li><li> Eliminar las células y las células de la ligera revisión de cada cepa codificados a nuevas placas de YEPD, que servirá como las placas experimentales utilizados para el análisis de ciclo de vida replicativa. Las células deben ser reparado a lo largo de una línea vertical en el lado izquierdo de la placa de YEPD (Figura 1). Aproximadamente 3-5 parches por placa es óptimo, asumiendo la vida replicativa análisis abarcan el 20 de células de cada parche. No es necesario (ni deseable) para transferir un gran número de células a la placa de YEPD fresco, ya que esto hará que las células crezcan densamente durante la incubación durante la noche, lo cual puede limitar su tiempo de vida posterior replicación. </li><li> Las placas se incuban durante la noche recién parcheado en la mesa de trabajo. </li></ol> Parte 2: Posición de las células para el análisis de intervalo de replicación vida. En esta sección se describe cómo la posición de las células de levadura en el plato y la forma de obtener células virgen hija de análisis abarcan replicativa vida. A partir de ahora, todas las placas deben ser parafilmed, excepto cuando se someten a la disección, con el fin de prevenir la desecación. <ol><li> El uso de un microscopio equipado con un aparato de microdisección adecuado para la levadura, la transferencia de aproximadamente 50 células de la cepa parche primero en una posición en la placa distal a las células del parche. Si la platina del microscopio se clasifica, estos matices se puede utilizar para asegurarse de que las células serán fáciles de encontrar en las siguientes iteraciones. En la Axioscope Zeiss de 40 años, las células de la cepa parche primero se puede colocar en las coordenadas 90 x 10 y dispuestos verticalmente desde allí. </li><li> Limpie la aguja de las células en varias ocasiones de tocar la superficie del agar, a continuación, crear un agujero en el agar al forzar la aguja a través de la superficie del agar. Este agujero servirá como un marcador para orientarse en el plato durante las siguientes iteraciones de la disección y la eliminación de células hija. Tenga cuidado de no obtener las células de levadura en el agujero, o que crecen y se forma una colonia. </li><li> Directamente sobre el agujero, alinear verticalmente células individuales de levadura en 20 puntos espaciados uniformemente, con un diámetro de aguja 1-3 (~ 100 M) entre cada posición de la célula (Figura 1). Cada pocas células, coloque dos células adyacentes en la misma posición en la línea en lugar de uno. Esto permite la redundancia en la selección virgen célula hija, si una de las células transferidas no para dividir. </li><li> Entre el 10 y 11 º puestos en la línea, crear una serie horizontal de 7-8 agujeros en el agar. Esto servirá como un marcador para orientarse en el plato durante las siguientes iteraciones de la disección y la eliminación de células hija. Tenga cuidado de no obtener células de levadura en los agujeros, o crecen y se forma una colonia. </li><li> Repita los pasos 2.1 a 2.4 por cada parche en el plato, sin dejar de celdas del arreglo verticalmente a lo largo del mismo eje. Para el paso 2.2, el número de agujeros creados deben corresponder a la cantidad de parches (un agujero para el primer parche, dos agujeros para el segundo, etc.) </li><li> Una vez que las células han sido dispuestos para cada parche, la placa de parafina y se incuba a 30 ° C durante aproximadamente 2 horas. </li><li> Repita los pasos 2.1-2.6 por cada placa en el experimento. </li></ol> Parte 3: Obtener células virgen hija para el análisis de vida útil En esta sección se iniciará el análisis de ciclo de vida, asegurando que cada célula se inicia como una hija virgencelular. <ol><li> Retire las placas de la incubadora y verificar que la mayoría de las células dispuestas han sido sometidos a una división celular. Si se necesita más tiempo para permitir que la división celular que se complete, la placa de retorno a la incubadora. </li><li> A partir de las células dispuestas en primer lugar, el uso de la aguja para separar las células hija de la célula madre colocando suavemente la aguja en la parte superior de las células unidas. A veces es útil para aprovechar el lado de la base del microscopio, mientras que la aguja está en reposo en las células. </li><li> Coloque la célula hija separada de la línea vertical, en sustitución de la célula madre y las células hijas más y moverlos de lado temporalmente. </li><li> Repita el paso 3.2 y 3.3 para cada una de las células dispuestas. Si una célula no puede dividirse, tomar una célula hija de una de las células redundantes posicionado en el paso 2.3. Cuando haya terminado, usted debe tener 20 células hijas de cada parche alineados verticalmente sobre la placa de vida. </li><li> Recoge todas las células madre y células adicionales hija en una pila y la transferencia de nuevo a una zona cercana a los parches (&quot;el cementerio&quot;). Es importante evitar que las células no deseadas lejos de las células en proceso de análisis vida útil para prevenir la formación de microcolonias y el agotamiento de los nutrientes local. </li><li> Parafilm la placa y se incuba a 30 ° C durante aproximadamente 2 horas. </li><li> Repita los pasos 3.2-3.6 por cada placa en el experimento. </li></ol> Parte 4: Medición de la capacidad replicativa de las células individuales <ol><li> Prepare la vida de los datos abarcan las hojas. Una esperanza de vida hoja de datos puede ser una simple rejilla donde cada fila corresponde a una célula madre individual y cada columna corresponde a una edad más puntos (Figura 2). La etiqueta de cada hoja de datos en función del número de cepas para ser analizados. </li><li> Retire las placas de la incubadora y verificar que la mayoría de las células dispuestas han sufrido al menos una división celular. Si se necesita más tiempo para permitir que la división celular que se complete, la placa de retorno a la incubadora. </li><li> A partir de la primera celda dispuestas en la primera placa, observe la célula madre y la hija (s) y determinar el número de divisiones celulares que han ocurrido. Por lo general, fácil de determinar el número de células de la hija de una madre ha producido, sobre la base de los patrones característicos de los acuerdos de la célula. Anote el número de células hijas producidas por la célula madre en la casilla correspondiente en la hoja de vida cuenta tramo. </li><li> Utilice la aguja para separar las células hijas de la célula madre como se describe en el paso 3.2. </li><li> Conservar las células madre en su posición en la línea vertical y mover la célula hija (s) a un lado temporalmente. </li><li> Repita los pasos 4.3-4.5 para cada una de las células dispuestas. </li><li> Recoge todas las células hijas descartados y pasar a la &quot;cementerio&quot;, situado cerca de los parches originales. </li><li> Parafilm la placa y se incuba a 30 ° C durante 2-3 horas. </li><li> Repita los pasos 4.3-4.8 por cada placa en el experimento. </li><li> Repita los pasos 4.2 a 4.9 hasta que todas las células madre han dejado de dividirse. A medida que la edad de la madre las células, la progresión del ciclo celular se vuelve más lento y sería deseable que se incuba la placa durante períodos más largos de tiempo entre la edad de los puntos. Las placas se pueden colocar a 4 ° C durante la noche. </li></ol> Parte 5: Los resultados representativos. Los datos en bruto producido por un experimento de replicación vida es una lista de números correspondientes a las células hijas producidas por cada célula madre en cada etapa de punto (Figura 2). Por la suma de cada fila de la hoja de puntuación, la duración de la vida replicativa de cada célula madre se obtiene. Los datos de las células madre del grupo experimental misma pueden ponerse en común para generar una curva de supervivencia (Figura 3) y para realizar cálculos estadísticos, tales como vida media, tiempo de vida media y la desviación estándar. Una prueba no paramétrica, como el Wilcoxon test, se puede realizar para determinar si las diferencias significativas en la duración de la vida se han detectado entre los grupos experimentales. Cuando el experimento funciona correctamente, la curva de supervivencia debe ser más o menos consistente con Gompertz-Makeham cinética sigmoidal mostrando un shap con la mortalidad temprana baja siguió un descenso relativamente rápido de la supervivencia y un aplanamiento de la curva de la edad de la tarde. La mayoría de las cepas salvajes han replicativa valores de esperanza de vida en el rango de la generación 20-30, aunque fuera de la variación de esta gama ha sido reportado. <img src="/files/ftp_upload/1209/1209fig1.jpg" alt="la figura 1" /> <img src="/files/ftp_upload/1209/fig1.2.jpg" alt="Figura 1.5" /> Figura 1. Diagrama de una placa lapso replicativa típica vida. La noche antes de comenzar la microdisección de células de levadura, 3-5 cepas son ligeramente parcheado en la superficie de una placa de YEPD (cajas de color rojo) en una línea vertical a lo largo de un lado de la placa. Después de un crecimiento durante la noche, aproximadamente 30 celdas individuales de cada cepa se ordenan verticalmente en una línea que contiene 20 posiciones. Esperanza de vida analysis se llevará a cabo en las células v hija virgen obtenido de estas células iniciales. Las células adicionales que se obtienen a partir de microdisección durante el experimento (por ejemplo, las células hijas no deseados) son colocados en &quot;el cementerio&quot; (óvalo gris), que se encuentra lejos de las células experimentales con el fin de evitar el agotamiento local de nutrientes, como las colonias se forman. <img src="/files/ftp_upload/1209/1209fig3.jpg" alt="la figura 2" /> Figura 2. Una vida replicativa lapso hoja de registro. Los datos brutos de un experimento de vida replicativa se muestra. Cada fila corresponde a una célula de levadura madre soltera y cada columna corresponde a una edad más puntos. El número de inscritos en cada casilla es el número de células hijas producidas por que la célula madre a esa edad-punto. Cada cepa se etiqueta con un número codificado de tal manera que el individuo la disección de las células de levadura no tiene conocimiento de la identidad de las cepas que se analiza. Veinte células se analizan para cada cepa. <img src="/files/ftp_upload/1209/1209fig2.jpg" alt="la figura 3" /> Figura 3. Representante de la supervivencia y las curvas de crecimiento de un experimento de vida replicativa. (A) Las curvas de supervivencia se obtienen mediante el trazado de la fracción de células madre aún vive en función de la edad de replicación (número de divisiones celulares. (B) Las curvas de crecimiento se obtienen mediante el trazado de la número medio de células hijas producidas por una cepa determinada en función de la edad de punto. En este ejemplo, la cepa n º 2 es de mayor duración, pero es más lento crecimiento, como lo demuestra la reducción de la pendiente inicial de la parcela de crecimiento.

<ol><li>Kaeberlein, M., Burtner, C. R., Kennedy, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+developments+in+yeast+aging%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Recent developments in yeast aging.</a> PLoS Genet. 3, (2007).</li>
<li>Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKaeberlein%2C+M+%22Handbook+of+models+for+human+aging%22">Handbook of models for human aging</a>. Conn, P. M. , Elsevier Press. Boston. 109-120 (2006).</li>
<li>Smith, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+evidence+for+conserved+longevity+pathways+between+divergent+eukaryotic+species%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Quantitative evidence for conserved longevity pathways between divergent eukaryotic species.</a> Genome Res. 18, 564-570 (2008).</li>
<li>Steinkraus, K. A., Kaeberlein, M., Kennedy, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replicative+aging+in+yeast%3A+the+means+to+the+end%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Replicative aging in yeast: the means to the end.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 24, 29-54 (2008).</li>
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<li>Jiang, J. C., Jaruga, E., Repnevskaya, M. V., Jazwinski, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+intervention+resembling+caloric+restriction+prolongs+life+span+and+retards+aging+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Faseb+J%22%5BJournal%5D)">An intervention resembling caloric restriction prolongs life span and retards aging in yeast.</a> Faseb J. 14, 2135-2137 (2000).</li>
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<li>Lin, S. J., Defossez, P. A., Guarente, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+of+NAD+and+SIR2+for+life-span+extension+by+calorie+restriction+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Requirement of NAD and SIR2 for life-span extension by calorie restriction in Saccharomyces cerevisiae.</a> Science. 289, 2126-2128 (2000).</li>
<li>Kaeberlein, M., Kennedy, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+identification+in+yeast+of+conserved+ageing+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">Large-scale identification in yeast of conserved ageing genes.</a> Mech Ageing Dev. 126, 17-21 (2005).</li>
<li>Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+yeast+replicative+life+span+by+TOR+and+Sch9+in+response+to+nutrients%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Regulation of yeast replicative life span by TOR and Sch9 in response to nutrients.</a> Science. 310, 1193-1196 (2005).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>Reactivo</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0145-17-0 (214530)</td><td></td></tr><tr><td>Peptona Bacto</td><td>Reactivo</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0118-17-0 (211677)</td><td></td></tr><tr><td>Extracto de levadura</td><td>Reactivo</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0886-17-0 (288620)</td><td></td></tr><tr><td>Glucosa</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

medición de span replicativa vida en la levadura en ciernes

Measuring Replicative Life Span in the Budding Yeast

El envejecimiento es un proceso degenerativo caracterizado por un deterioro progresivo de los componentes celulares y orgánulos que resulta en la mortalidad. La levadura en ciernes<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Se ha utilizado ampliamente para estudiar la biología del envejecimiento, y hay varios factores determinantes de la longevidad de la levadura se ha demostrado que se conserva en eucariotas multicelulares, incluyendo gusanos, moscas y ratones<sup&gt; 1</sup&gt;. Debido a la falta de cuantificar fácilmente fenotipos asociados con la edad, el envejecimiento en la levadura se ha ensayado casi exclusivamente por la medición de la vida de las células en diferentes contextos, con dos diferentes paradigmas vida útil de uso común<sup&gt; 2</sup&gt;. Tiempo de vida cronológico se refiere a la cantidad de tiempo que una célula madre puede sobrevivir en una que no se dividen, la quietud, como estado, y se propone servir de modelo para el envejecimiento de las células post-mitóticas en las células eucariotas multicelulares. Lapso de la vida replicativa, por el contrario, se refiere al número de células hijas producidas por una célula madre antes de la senescencia, y se cree que ofrecen un modelo de envejecimiento de las células activas mitóticamente. Aquí se presenta un protocolo generalizado para medir la duración de la vida replicativa de las células de levadura en ciernes madre. El objetivo del ensayo de replicación vida es determinar cuántas veces los brotes de células madre. Las células madre y la hija se pueden distinguir fácilmente por un investigador experimentado con un microscopio óptico estándar (un aumento total de 160X), como el Zeiss Axioscope 40 u otro modelo similar. La separación física de las células hijas a partir de células madre se realiza mediante un micromanipulador manuales equipado con una aguja de fibra óptica. Típico de las cepas de levadura de laboratorio produce 20 a 30 células hijas por madre y un experimento de vida requiere de 2-3 semanas.

En este artículo presentamos un protocolo general para la medición de la duración de la vida replicativa de las células madre de la levadura.

Medición de Span replicativa vida en la levadura en ciernes

El envejecimiento es un proceso degenerativo caracterizado por un deterioro progresivo de los componentes y orgánulos celulares que resulta en la mortalidad. La levadura gemante...

La levadura de brotación Croce Visi se ha utilizado ampliamente para estudiar la biología del envejecimiento. En este artículo, presentamos un protocolo general para medir la longevidad replicativa de las células madre de levadura. Hola, soy Kristen Steffen del laboratorio de Brian Kennedy en el Departamento de Bioquímica de la Universidad de Washington.Hoy les mostraremos un procedimiento para medir la longevidad replicativa de las células madre de levadura. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar genes que influyen en la longevidad de las células de levadura. Así que comencemos.Para el experimento de duración de la vida replicativa y la preparación de células de levadura para el análisis de longevidad, es necesario preparar placas sólidas de YEPD. Utilice una técnica estéril adecuada para preparar estas placas de agar YEPD. Prepare al menos dos placas por cada cuatro o cinco cepas que se analizarán en el experimento de longevidad.Estas placas deben prepararse al menos dos días antes del experimento de duración de vida y deben dejarse secar antes de comenzar el ensayo de longevidad. Si el experimento no se llevará a cabo dentro de los cuatro o cinco días posteriores al vertido de las placas, estas deben envolverse con película de parafina o plástico y colocarse en una incubadora refrigerada para prevenir la desecación. Retire las cepas de levadura de los cultivos congelados y siembre por estría para obtener colonias aisladas.En las placas de agar YEPD. Hasta seis cepas pueden estriarse fácilmente en la misma placa YEPD dividiendo la placa en sectores triangulares de tamaño igual. Incubar las células a 30 grados Celsius durante dos días.Después de la incubación, retire las células del incubador y siembre células de una colonia individual en una placa YEPD fresca. En este momento, las cepas que se van a analizar deben ser revestidas para asegurar que el experimento de duración de la vida replicativa se realice de forma ciega, donde los microdisectores no conozcan la identidad de las cepas individuales.A continuación, incubar las células recubiertas con parche a 30 grados Celsius hasta la noche siguiente. Retirar las células y hacer un parche ligero de células de cada cepa recubierta en placas YEPD frescas. Estas servirán como las placas experimentales utilizadas para la vida útil replicativa.Las células de análisis deben sembrarse a lo largo de una línea vertical en el lado izquierdo de la placa YEPD. No transfiera demasiadas células a una sola placa YEPD fresca. Dado que esto provocaría un crecimiento denso de las células durante la incubación nocturna y afectaría su vida útil replicativa, entre tres y cinco siembras por placa es lo óptimo.Suponiendo que se realizará el análisis del tiempo de vida replicativo en 20 células de cada sector, ahora el experimento de longevidad está completamente preparado y todo lo que queda es incubarlo durante la noche sobre la superficie del banco de trabajo. Luego, mañana podremos comenzar la microdisección para posicionar las células de levadura en la placa y obtener células hijas vírgenes, para el análisis del tiempo de vida replicativo.Utilice un microscopio equipado con un aparato de microdisección adecuado para levaduras. Transfiera aproximadamente 50 células del primer cepa en placas a una posición en la placa distal a las células en placas. Si la platina de su microscopio está graduada, estas graduaciones pueden utilizarse para asegurar que las células sean fáciles de localizar durante iteraciones posteriores.A veces, las células pueden quedar atrapadas en la aguja, lo cual puede ser un problema si salen en el momento equivocado. Para asegurarse de que la aguja esté limpia y libre de células, tóquela repetidamente contra la superficie del agar. Luego, cree un orificio en el agar forzando la aguja a través de su superficie.Este orificio servirá como marcador para orientarse en la placa durante las iteraciones posteriores de la disección y la eliminación de las células puntuales. Tenga cuidado de no introducir células de levadura en el orificio, ya que podrían crecer y formar una colonia directamente encima del mismo. Alinee verticalmente células individuales de levadura en 20 posiciones equidistantes, dejando entre cada posición de célula uno a tres diámetros de aguja.Para cada grupo de pocas células, coloque dos células una al lado de la otra en la misma posición de la línea, en lugar de una sola. Esto permite redundancia durante la selección de células hijas vírgenes. Si una de las células transferidas no se divide entre las posiciones 10 y 11 de la línea, cree una serie horizontal de siete a ocho orificios en el agar. Esto servirá como marcador para orientarse en la placa durante las disecciones posteriores y la eliminación de células hijas. Nuevamente, tenga cuidado de no introducir células de levadura en los orificios, ya que podrían crecer y formar una colonia. Repita este procedimiento para cada sector de la placa, continuando con la disposición de las células verticalmente a lo largo del mismo eje.Es importante recordar que al crear el orificio en la AER, el número de orificios realizados debe corresponder al número de parche, de modo que haya un orificio para el primer parche y dos orificios para el segundo. Una vez que las células hayan sido dispuestas para cada parche, selle la placa con película adhesiva y incube a 30 grados Celsius durante aproximadamente dos horas. Recuerde que, a partir de este momento, todas las placas deben estar cubiertas con película adhesiva excepto cuando se estén sometiendo a disección.Con el fin de evitar la desecación, repita este procedimiento para cada placa en el experimento. Para el análisis de longevidad, es importante asegurarse de que cada célula comience como una célula hija virgen.Para hacer esto primero, retire las placas del incubador y verifique que la mayoría de las células del arreglo hayan experimentado una división celular. Lo que tenemos aquí son células que fueron alineadas previamente, y puede observarse que tras dos horas en el incubador, han comenzado a dividirse. Ahora tenemos una célula madre, la más grande unida a su cuerpo, la célula hija virgen, y esa célula hija virgen es la célula que se utilizará para iniciar la vida útil.Si se necesita tiempo adicional para permitir que se completen las divisiones celulares, regrese la placa al incubador. Comenzando con la primera célula de la matriz, use la aguja para separar las células hijas de la célula madre colocando suavemente la aguja encima de las células adheridas.A veces resulta útil golpear suavemente el lateral de la base del microscopio mientras la aguja descansa sobre las células. A continuación, coloque la célula hija separada en la línea vertical de células, reemplazando la célula madre y cualquier otra célula hija adicional, y desplace temporalmente las demás a un lado. Repita estos pasos para cada una de las células del arreglo.Si una célula no logra dividirse, tome una célula hija de una de las células redundantes colocadas junto a la célula de prueba. Al finalizar, debe tener 20 células hijas para cada sector, alineadas verticalmente en la placa de vida útil. Recolecte todas las células madre y las células hijas adicionales en un montón y transfiéralas de regreso a un área cercana a los sectores denominada cementerio.Es importante mantener las células no deseadas lejos de las células que están siendo analizadas para la determinación de la longevidad, a fin de prevenir la formación de microcolonias y el agotamiento de nutrientes locales. Una vez que las células hayan sido separadas, retire el medio del plato e incube a 30 grados Celsius durante aproximadamente dos horas. Repita estos pasos para cada placa del experimento.Para medir la capacidad replicativa de células individuales, deberá preparar hojas de datos de duración de vida. Una hoja de datos de duración de vida puede ser una cuadrícula sencilla donde cada fila corresponda a una célula madre individual y cada columna corresponda a un punto de edad. Asegúrese de etiquetar cada hoja de datos según el número de cepas que se analizarán.Para comenzar, primero retire las placas del incubador y verifique que la mayoría de las células del arreglo hayan experimentado al menos una división celular. Si se necesita más tiempo para permitir que se complete la división celular, regrese la placa al incubador. Comience con la primera célula del arreglo en la primera placa y observe visualmente la célula madre y la hija, o células, para determinar el número de divisiones celulares que han ocurrido.Por lo general, es fácil determinar cuántas células hijas ha producido una célula madre basándose en patrones característicos de disposición celular. Este caso es muy sencillo para ver cuántas células produjo, porque hay dos células, son del mismo tamaño y ambas son más pequeñas que la célula madre. Registre el número de células hijas producidas por la célula madre en el casillero correspondiente de la hoja de puntuación de duración de vida.A continuación, utilice la aguja para separar las células hijas de la célula madre como se describió previamente, colocando suavemente la aguja encima de las células adheridas y golpeando ligeramente el lateral de la base del microscopio mientras la aguja descansa sobre las células. Mantenga la célula madre en su posición sobre la línea vertical y mueva temporalmente la célula o células hijas hacia un lado. Repita estos pasos para cada una de las células de la matriz.Finalmente, recolecte todas las células hijas descartadas y trasládelas al cementerio ubicado cerca de los parches originales. Selle la placa con película de parafina e incube a 30 grados Celsius durante dos o tres horas. Repita el descarte de las células hijas y la incubación.Paso para cada placa en el experimento. Repita todo este procedimiento hasta que todas las células madre hayan dejado de dividirse. Tenga en cuenta que a medida que las células madre envejecen, la progresión del ciclo celular se vuelve más lenta y será conveniente incubar la placa durante períodos más largos entre los puntos de edad; posteriormente, las placas pueden colocarse a cuatro grados Celsius durante la noche.Los datos brutos producidos por un experimento de duración de la vida replicativa consisten en una lista de números que corresponden a las células hijas producidas por cada célula madre en cada punto de edad. Como se observa aquí. Al sumar cada fila de la hoja de puntuación, se obtiene la duración de la vida replicativa para cada célula madre.Se pueden agrupar datos de otras células del mismo grupo experimental para generar una curva de supervivencia y realizar cálculos estadísticos. La curva debe ser aproximadamente coherente con la cinética de Gompertz-Makeham, mostrando una forma sigmoidea con baja mortalidad temprana, seguida de una disminución relativamente rápida en la supervivencia y un aplanamiento de la curva a edades avanzadas. Acabamos de mostrarle cómo realizar un experimento de longevidad replicativa en levaduras.Al realizar este procedimiento, es importante recordar que las células continuarán dividiéndose siempre que no estén en frío. Por lo tanto, recuerde colocar las placas a cuatro grados durante la noche para no terminar con demasiadas células hijas que contar por la mañana. Eso es todo.Gracias por ver este video y mucha suerte con sus experimentos.

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Se describe aquí la operación de un dispositivo de microfluidos que permite imágenes microscópicas continua y de alta resolución de las células de levadura en ciernes individuales durante su completa replicativa y / o cronológico vida útil.

Continua observación microscópica de alta resolución de replicativa envejecimiento en la levadura en ciernes

Este artículo presenta un protocolo optimizado para la producción de chips de microfluidos y la configuración de los experimentos de microfluidos para medir la vida útil y los fenotipos celulares de células de levadura individuales.

El uso de dispositivos de microfluidos para Medir Lifespan y Celular fenotipos en células individuales levadura en ciernes

Aquí describimos el método Replica Set, un enfoque cuantitativo medida vida útil/supervivencia de C. elegans y healthspan en forma robusta y de alto rendimiento, permitiendo la proyección de muchas condiciones sin sacrificar la calidad de los datos. Este protocolo detalla la estrategia y proporciona una herramienta de software para análisis de datos de conjunto de réplica.

El método de conjunto de réplica: Un enfoque de alto rendimiento para cuantitativamente medida Caenorhabditis elegans vida útil

Aquí hay un protocolo para identificar interacciones genéticas a través de una mayor pantalla supresora de número de copia en Saccharomyces cerevisiae. Este método permite a los investigadores identificar, clonar y probar supresores en mutantes de levadura de corta duración. Probamos el efecto del aumento del número de copia de SIR2 en la vida útil en un mutante nulo de autofagia.

Una pantalla supresora para la caracterización de los vínculos genéticos que regulan la vida cronológica en Saccharomyces cerevisiae

Describimos dos protocolos complementarios para determinar con precisión la duración de la fase S en S. cerevisiae utilizando EdU, un análogo de la timidina, que se incorpora in vivo y se detecta mediante química Click por microscopía y citometría de flujo. Permite la fácil caracterización de la duración de la replicación del ADN y los defectos de replicación pasados por alto en los mutantes.

Determinación de la duración de la fase S mediante la incorporación de 5-etinil-2'-desoxiuridina en Saccharomyces cerevisiae

Aprende a medir el span replicativo en células madre de levadura Saccharomyces cerevisiae. Este protocolo permite estudiar genes que influyen en la longevidad celular y los mecanismos del envejecimiento.

Medición de Span replicativa vida en la levadura en ciernes

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