Chip microfluídico para la construcción de modelos de lesión axonal y permite el análisis multiómico

Hemos desarrollado chips microfluídicos a gran escala para permitir el análisis multiómico, con el objetivo de ilustrar el mecanismo metabólico de las neuronas después de una lesión axonal. Utilizamos principalmente tecnología microfluídica, análisis de flujo metabólico y transcriptómica para avanzar en la investigación sobre los mecanismos metabólicos de las neuronas durante la lesión axonal y la regeneración. Encontramos que existen diferencias metabólicas entre las neuronas corticales en diferentes enfermedades del desarrollo, y que las neuronas jóvenes experimentan una remodelación metabólica después de una lesión externa.

La principal ventaja de nuestro protocolo radica en el diseño de la plataforma microfluídica a mayor escala y los estándares operativos, que permiten una multiómica precisa y el tamaño de millones de células. Para comenzar, transfiera la base de PDMS y el agente de curado a un tubo de centrífuga. Coloque el tubo de centrífuga que contiene la mezcla en un mezclador de agitación centrífuga.

Centrifugar a 2.000 G durante cuatro minutos dos veces para mezclar y desgasificar. Vierta de 13 a 15 gramos del PDMS desgasificado en el molde microfluídico, asegurándose de que el fondo del molde esté completamente cubierto. Ahora, coloque el molde en un desecador al vacío, luego use una bomba de vacío para evacuar el aire durante cinco a 10 minutos para eliminar completamente las burbujas del PDMS.

Con una bombilla de goma, golpee suavemente la superficie del PDMS para romper las burbujas superficiales restantes. Transfiera el molde a un horno de convección y hornee a 80 grados centígrados durante 100 minutos para curar el polidimetilsiloxano. Una vez que el PDMS esté completamente curado, deslice suavemente la punta de un bisturí debajo del borde del PDMS para levantarlo y separarlo con cuidado del molde.

Usando un punzón de biopsia con un diámetro de 2.0 a 2.5 milímetros, cree orificios en el PDMS para la infusión del medio de cultivo y la carga celular. Elimine las impurezas de la superficie del PDMS con cinta adhesiva, luego colóquelo en un plato de vidrio limpio y envuélvalo con papel de aluminio para guardarlo. Antes del experimento, esterilizar en autoclave el dispositivo microfluídico a 121 grados Celsius y 101 kilopascales durante cinco minutos para garantizar la esterilidad.

Coloque un cubreobjetos destinado a dispositivos microfluídicos convencionales en una placa de cultivo de 35 milímetros. Agregue dos mililitros de 0,1 miligramos por mililitro de solución de poli-D-lisina al plato. Incube el plato a 37 grados centígrados durante seis horas o toda la noche.

Después de la incubación, recupere cuidadosamente la solución de poli-D-lisina para su reutilización o eliminación adecuada. Ahora, agregue dos mililitros de agua ultrapura estéril al plato. Gírelo 50 veces en el sentido de las agujas del reloj, seguido de 50 veces en el sentido contrario a las agujas del reloj.

Aspire el agua con una bomba de vacío conectada a una punta de pipeta estéril, recogiendo los desechos en un contenedor de desechos líquidos. Una vez completados todos los lavados, deje que los cubreobjetos se sequen al aire de forma natural en un gabinete de bioseguridad antes de usarlos. Con unas pinzas estériles de punta fina, coloque el chip microfluídico esterilizado en autoclave en el centro de la superficie de vidrio con los microcanales hacia abajo.

Presione suavemente el chip sobre la superficie de vidrio con una punta de pipeta de 200 microlitros para garantizar una adhesión completa. A continuación, marque la cámara izquierda con un punto usando un marcador permanente para designar el compartimento del soma. Aspire 10 microlitros de suspensión neuronal con una pipeta de 10 microlitros, luego dispense lentamente la suspensión en el puerto de carga sobre el compartimento de soma marcado.

Confirme el flujo de fluido adecuado hacia el depósito inferior de la cámara izquierda. Transfiera la placa de cultivo a una incubadora humidificada a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono durante 20 minutos. Después de la incubación, coloque la placa bajo un microscopio de 20X para confirmar la profusión de medios desde el compartimento soma hasta el compartimento axonal a través de los microcanales.

Ahora, pipetee 150 microlitros de medio basal neuronal al puerto superior del compartimento axonal. Del mismo modo, agregue 150 microlitros de medio neuronal completo al puerto superior del compartimento del soma. A continuación, vierta 20 mililitros de agua ultrapura en una placa de cultivo de 150 milímetros para crear una cámara de humedad.

Coloque la placa de cultivo de 35 milímetros dentro de la placa grande, luego transfiera todo el sistema de cultivo a la incubadora y manténgalo durante el tiempo requerido. Utilice una placa de Petri de 10 centímetros de ancho para colocar el dispositivo microfluídico a gran escala. Elija la siembra de canal completo o de canal de intervalo según las necesidades experimentales, ya que cada método requiere diferentes protocolos de lesión axonal.

Una vez completada la siembra, agregue cinco mililitros de medio de cultivo de neuronas completo a la placa de Petri para mantener el crecimiento de las neuronas. Transfiera una cantidad adecuada de medio basal neuronal a un nuevo tubo de centrífuga de 15 mililitros para su uso posterior. Coloque un dispositivo microfluídico que contenga neuronas corticales en un banco limpio.

Con papel sin pelusa, seque el fondo de la placa de cultivo de 35 milímetros, luego use una pipeta de 200 microlitros para aspirar el medio de los dos orificios laterales derechos del dispositivo microfluídico. A continuación, conecte un tubo de bomba de vacío a una punta de pipeta estéril y sin filtro de 200 microlitros. Encienda la bomba de vacío a una velocidad de succión de 60 litros por minuto y apunte la punta al punto de conexión entre el orificio inferior de la cámara terminal del axón y la cámara para aspirar el medio viejo, causando la rotura del axón debido a la presión negativa.

Vuelva a colocar la punta de la pipeta y extraiga 150 microlitros de medio basal neuronal, agregándolo lentamente a través del orificio inferior de la cámara derecha. Después de realizar la adición y aspiración cuatro veces, reemplácelo con un medio neuronal completo nuevo, luego aspire el medio viejo del orificio lateral del cuerpo celular y agregue un medio neuronal completo nuevo que contenga medicamentos si es necesario. Coloque el dispositivo microfluídico junto con la placa de cultivo en una placa de cultivo de 150 milímetros y continúe cultivando durante el tiempo requerido, como 24 horas.

Para la lesión axonal manual, siembra neuronas en todas las cámaras del dispositivo microfluídico a gran escala. Incube el dispositivo a 37 grados centígrados en una incubadora humidificada con 5% de dióxido de carbono durante tres días. El séptimo día in vitro, retire la placa de cultivo que contiene el dispositivo microfluídico de la incubadora y colóquela en una etapa estéril.

Prepare un microscopio con un aumento de 20X y esterilice el área de trabajo con etanol al 75%. Sostenga una punta de pipeta filtrada estéril de 10 microlitros e identifique los haces de axones en los microcanales originales bajo la guía del microscopio. Realice rasguños longitudinales a lo largo de cada haz de axones con la punta de la pipeta.

Observe la rotura del axón bajo el microscopio en tiempo real. Los microcanales de un dispositivo microfluídico estándar permiten el crecimiento de axones, pero no de soma, como lo confirma la tinción de tubulina beta tres a los siete días in vitro. La densidad neuronal no mostró diferencias significativas después de la lesión axonal, lo que indica que no se observó muerte neuronal.

Se desarrolló un dispositivo microfluídico a gran escala con un diseño expandible tridimensional para análisis multiómicos. Tanto las réplicas de PDMS perforadas como las perforadas se adhieren de forma segura a platos de 10 centímetros o placas de circuito impreso. El daño axonal inducido por el rascado de la punta de la pipeta condujo a axones claramente cortados con morfología alterada, en contraste con los axones intactos antes de la lesión.

La regeneración axonal se observó tanto a las seis horas como a las 24 horas después de la lesión, mientras que los axones no lesionados permanecieron estables. La concentración de proteína neuronal aumentó significativamente de 1420,4 microgramos por mililitro al inicio del estudio a 1748,9 por mililitro a las seis horas y 1823,7 microgramos por mililitro a las 24 horas posteriores a la lesión. Los rendimientos de ARN de los grupos de control y lesionados por axones fueron casi idénticos.

La secuenciación del ARN reveló 595 genes específicos de lesiones y 609 genes específicos de control, con 17.471 genes compartidos entre grupos. El análisis de la vía KEGG identificó una regulación positiva significativa de la fosforilación oxidativa, la respuesta de las especies reactivas de oxígeno, la autofagia y las vías del ciclo del TCA después de la lesión.