El uso de chips de microfluídica para imágenes en vivo y de estudio de las respuestas de lesiones en Drosophila Las larvas
7 de febrero de 2014
Larvas de Drosophila son un sistema modelo atractivo para imágenes en vivo debido a su cutícula translúcida y la genética de gran alcance. Este protocolo describe cómo utilizar un dispositivo de PDMS de una sola capa, llamada el 'chip de larva' para imágenes en vivo de procesos celulares dentro de las neuronas de 3 º estadio las larvas de Drosophila.
El objetivo general del siguiente experimento es inmovilizar de forma no invasiva larvas de Drosophila para obtener imágenes en vivo utilizando una cámara microfluídica modificada. Una tercera larva en estrella se coloca en el chip con un poco de aceite para ayudar a sellar las larvas. A continuación, el chip se coloca encima de las larvas de forma que su cuerpo quepa dentro de la cámara.
El chip se conecta a una jeringa para que se pueda aplicar una aspiradora. La motilidad de las larvas se restringe y las estructuras de la parte ventral del animal se acercan al cubreobjetos. Usando un microscopio confocal, las estructuras se visualizan fácilmente, como los detalles de las terminales de los axones de las neuronas sensoriales y la regeneración de los nervios segmentarios después de un daño nervioso inducido.
Otros métodos para inmovilizar josepha para la obtención de imágenes en vivo, éter de cloroformo enorme o anestésicos ISO. La principal ventaja de esta técnica es que evita la gran cantidad de toxinas, que interfieren con la fisiología del animal. Y el beneficio adicional de la ausencia de toxinas es que la larva GB segura y para trabajar con La inmovilización robusta permite obtener imágenes de eventos rápidos, como un transporte axonal más rápido y cambios en el calcio intracelular.
Una sola larva puede ser inmovilizada y visualizada en el chip varias veces. Esto permite vidas de tiempo. Imágenes de procesos que tienen lugar en el transcurso de hasta 72 horas Comience por obtener un chip PDMS de muestra para probar este protocolo.
Las instrucciones sobre cómo hacer un chip A-P-D-M-S a partir de un molde SU eight se pueden leer en el protocolo de texto utilizando una aguja dispensadora de calibre 21. Haga un agujero en el puerto de vacío del chip PDMS para un microscopio invertido. Retire una aguja de calibre 23 de su base, el cubo de la cerradura, con unos pocos giros.
A continuación, inserte la punta de la aguja en un pequeño trozo de tubo de polietileno de modo que el tubo cubra al menos un milímetro de la aguja. Usa una cuchilla de afeitar para cortar el exceso de tubo. Esto deja un anillo de plástico que puede hacer un sello.
Inserte la punta de la aguja de calibre 23 en el orificio del puerto de vacío. Para un microscopio vertical, haga un segundo orificio en el costado del chip PDMS con una aguja dispensadora de calibre 21. Este orificio proporcionará acceso al primer orificio desde el lateral.
A continuación, inserte la punta de la aguja de calibre 23 y el anillo del tubo en el orificio lateral. Coloque un trozo de cinta adhesiva de doble cara sobre la parte superior del chip PDMS para sellar el orificio superior. Conecte un tubo de polietileno de 20 centímetros de longitud entre la punta de la aguja insertada en el puerto de vacío del chip y uno de los puertos de una válvula de tres vías.
Luego conecte una jeringa de 20 mililitros en uno de los dos puertos restantes de la válvula, dejando el último puerto abierto. Limpie el chip PDMS con cinta adhesiva transparente. Coloca un trozo de cinta adhesiva en la parte inferior del chip.
Asegúrese de que la cinta toque toda la superficie del PDMS y, a continuación, despegue la cinta. Repite este método de limpieza tres veces. Dado que el chip PDMS es reutilizable, es muy importante eliminar los residuos de aceite, ya que pueden afectar la adhesión del PDM al forrajeo temprano de la transferencia de vidrio.
Larvas del tercer estadio del alimento a una placa de Petri que contiene agua. Debe tener entre 3,5 y cuatro milímetros de largo para que el chip se ajuste correctamente. Bañar las larvas para eliminar el medio de cultivo.
A continuación, se reproduce una pequeña gota de aceite de carbono 700 halo en el centro de un cubreobjetos de vidrio con pinzas, recoge suavemente una larva lavada. Colócalo brevemente en una toallita ligera para secarlo con una toalla y luego muévelo al aceite durante 10 segundos. La gota debe ser lo suficientemente pequeña como para que la tráquea de las larvas no quede cubierta.
A continuación, coloque brevemente las larvas en un cubreobjetos de vidrio limpio y muévalo a otro cubreobjetos. Eliminando así un poco más de aceite. Preste atención a la orientación de las larvas para obtener imágenes del cordón neural y los nervios segmentarios.
El lado ventral debe estar hacia abajo. Los tubos traqueales fácilmente identificables deben estar hacia arriba. Ahora coloque suavemente el chip PDMS encima de las larvas.
Alinee las larvas con el centro de la microcámara. Con su parte posterior orientada hacia el puerto de vacío, la larva no debe tocar los bordes de la cámara. Una vez alineado, empuje el chip PDMS contra el deslizamiento de la cubierta de vidrio para lograr un buen sellado.
A continuación, comprueba que las larvas están completamente encerradas en la microcámara. Ahora cambie la válvula de tres vías a la jeringa. Sostenga firmemente el conjunto PDMS y tire del émbolo de la jeringa para extraer de dos a 2,5 milímetros de aire hasta que se sienta resistencia.
Creando así un vacío. A continuación, cierre la válvula. Para mantener el vacío con cuidado, vuelva a verificar las larvas.
Su cuerpo debe estar inmovilizado dentro de la microcámara, y la tráquea debe ser visible. El resto del chip PDMS debe estar en contacto con el cubreobjetos Las orientaciones como estas no son correctas. Ahora imagínate las larvas.
Si usa un microscopio vertical, fije la parte superior del chip a la platina con cinta adhesiva de doble cara. Cuando se completen las imágenes, suelte la aspiradora. A continuación, separe el chip PDMS del cubreobjetos.
La larva debe ser móvil inmediatamente con pinzas. Regrese las larvas a una placa de agar jugo de uva para su recuperación. Coloque una sola larva anestesiada en un plato de agar jugo de uva.
Bajo el microscopio estereoscópico, voltee el animal con el lado ventral hacia arriba. Para visualizar el cordón nervioso ventral y los nervios segmentarios, asegúrese de que la larva esté completamente inmóvil. Localiza el cordón nervioso y las glándulas salivales.
Es importante no dañar estas estructuras. Localiza el extremo del tercer segmento abdominal. Las lesiones aquí dañan la mayoría de los nervios y son las más fáciles de reproducir sin matar al animal.
La lesión también se puede llevar a cabo en segmentos más posteriores utilizando un fórceps de estrella dúo número cinco. Pellizca los nervios segmentarios con fuerza a través de la cutícula durante cinco a 10 segundos. Cuando se hace correctamente, la cutícula permanece intacta y la pared del cuerpo no se perfora.
La maestría tomará práctica después de que la lesión colocó al animal con el lado ventral hacia abajo en el plato grande. Debe ser capaz de mover la cabeza y comer. Si la lesión fue exitosa, entonces la mitad posterior de las larvas quedará paralizada.
El chip de larva se utilizó para obtener imágenes del transporte mediado por kinesina de vesículas sinápticas dentro de axones periféricos individuales. El movimiento de grado entero de estas vesículas se midió a aproximadamente 1,0 micras por segundo. El movimiento retrógrado se registró a 0,8 micras por segundo.
La técnica de inmovilización se utilizó para la microcirugía láser mediante un láser de colorante UV pulsado. Se observaron niveles de calcio en neuronas específicas gracias a un indicador codificado genéticamente. G camp 3.0 se detecta un pico de calcio después de una neurona sensorial.
La dendrita es transectada. Permitir que el animal descanse entre sesiones de imágenes permite ver los eventos celulares a lo largo del tiempo. Después de triturar los axones de las neuronas motoras eméricas, el muñón del axón proximal experimentó una nueva brotación.
Mientras tanto, los axones distales formaron varices y se fragmentaron a través del proceso de degeneración walleriana. También es posible utilizar el seguimiento de chips de larvas de proteínas fluorescentes fotoconvertidas in vivo. Una proteína de fusión de alfa tubulina DRA dos expresada en neuronas sensoriales de clase cuatro fue fotoconvertida en los cuerpos celulares.
En dos días, una cantidad significativa de proteína fotoconvertida se reubicó en las terminales axónicas de las neuronas sensoriales a aproximadamente un milímetro de distancia de la ubicación original en el cuerpo celular. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo utilizar el chip de larvas para obtener imágenes en vivo de larvas de Drosophila y cómo realizar una lesión por aplastamiento de nervios. Una vez que se dominan estas técnicas, las larvas se pueden posicionar en el microscopio en solo unos minutos.
El aplastamiento de los nervios es igual de rápido. Por lo tanto, estos procedimientos se pueden utilizar para experimentos a gran escala, como los grados genéticos. El chip se puede utilizar para obtener imágenes de estructuras en el lado ventral de las larvas de Drosophila.
Estos incluyen, entre otros, los músculos, las sinapsis de la unión neuromuscular, las neuronas sensoriales, los nervios periféricos y el cordón nervioso ventral. Este procedimiento también se puede utilizar para tomar imágenes en vivo del corazón de las larvas, las glándulas salivales y la tráquea. El chip de larva utilizado en este video tiene un tamaño para animales de entre 3,5 y cuatro milímetros de longitud.
Para la imagen es más pequeña o más grande, los animales con una cámara más pequeña o más grande se pueden hacer fácilmente. Consulte el archivo de diseño complementario y las instrucciones para fabricar chips PDMS. Las instrucciones para fabricar los chips PDMS se incluyen en el protocolo escrito.
Podemos enviarle un chip de muestra si se pone en contacto con nosotros.
Resumen
Este protocolo describe un método para inmovilizar de forma no invasiva larvas de Drosophila para imágenes en vivo utilizando una cámara microfluídica modificada. La técnica permite la observación de procesos celulares dentro de neuronas, particularmente en el contexto del transporte axonal y la regeneración nerviosa.
Componentes Clave del Estudio
Área de la Ciencia
- Neurociencia
- Biología celular
- Técnicas de imagen en vivo
Antecedentes
- Las larvas de Drosophila son un modelo valioso para estudiar procesos neuronales debido a su transparencia y facilidad genética.
- El estudio mediante imágenes en vivo puede proporcionar información sobre eventos celulares dinámicos en tiempo real.
- Los métodos tradicionales de inmovilización suelen implicar anestésicos dañinos que pueden afectar la fisiología.
- Este protocolo tiene como objetivo ofrecer una alternativa más segura para la obtención de imágenes sin sustancias tóxicas.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método no invasivo para inmovilizar larvas de Drosophila para su observación mediante imágenes.
- Facilitar la observación de estructuras y procesos neuronales.
- Permitir la realización de imágenes repetidas de la misma larva durante períodos prolongados.
Métodos Utilizados
- Uso de un dispositivo microfluídico de PDMS para inmovilizar larvas.
- Aplicación de vacío para restringir la motilidad larval.
- Adquisición de imágenes mediante microscopía confocal para visualizar estructuras neuronales.
- Preparación detallada del chip de PDMS y posicionamiento larval para una imagen óptima.
Resultados principales
- Inmovilización exitosa de larvas sin el uso de anestésicos tóxicos.
- Imagen nítida de terminales axónicos de neuronas sensoriales y regeneración de nervios segmentarios.
- Capacidad para realizar imágenes de lapso de tiempo durante 72 horas.
- Visualización del transporte mediado por cinasina de vesículas sinápticas.
Conclusiones
- La cámara microfluídica modificada proporciona un método seguro y eficaz para la obtención de imágenes en vivo de larvas de Drosophila.
- Este enfoque permite el estudio de eventos neuronales rápidos y procesos de recuperación.
- El protocolo puede adaptarse para diversas aplicaciones de imagen en la investigación en neurociencia.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La inmovilización no invasiva de organismos modelo permite la obtención de imágenes longitudinales de procesos celulares dinámicos sin interferencias farmacológicas, lo que apoya la reducción de riesgos mecanicistas en la validación de dianas. El dispositivo para larvas facilita sesiones repetidas de obtención de imágenes durante 72 horas, permitiendo evaluar el transporte axonal, las respuestas a lesiones y la regeneración en un sistema fisiológicamente relevante. Este enfoque aumenta la confianza predictiva en los modelos preclínicos al preservar la biología nativa durante la observación de la dinámica neuronal.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación de hipótesis terapéuticas mediante la visualización directa del transporte axonal y la señalización de calcio en neuronas.
- Valor operativo: Facilita la validación funcional de dianas al permitir la obtención repetida de imágenes del mismo larva para evaluar la interacción con la diana y la modulación de la vía a lo largo del tiempo.
- Valor predictivo: Proporciona lecturas cuantitativas del tráfico de orgánulos y de las respuestas inducidas por lesiones, mejorando la confianza en las dianas durante el descubrimiento en neurociencia.
Desarrollo de ensayos y cribado
- Listo para ensayo: Prepara sistemas biológicos validados para cribados posteriores mediante la inmovilización de larvas para obtener imágenes consistentes y de alta resolución de estructuras ventrales.
- Reproducibilidad: Permite la preparación y sellado estandarizados de larvas en microcámaras de PDMS, reduciendo la variabilidad en ensayos de imágenes en vivo.
- Escalabilidad: Facilita ciclos rápidos de inmovilización e imagen, lo que permite la evaluación de mediano rendimiento de perturbaciones genéticas o farmacológicas.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Relevancia para enfermedades: Modela los procesos de lesión y regeneración axonal relevantes para los mecanismos de enfermedades neurodegenerativas.
- Continuidad traslacional: Conecta el descubrimiento mediante imágenes con la validación preclínica al permitir estudios de imágenes de lapso de tiempo de la degeneración walleriana y el brotamiento axonal.
- Avance ajustado al riesgo: Apoya las decisiones de continuar o interrumpir proyectos al cuantificar las respuestas regenerativas frente a las degenerativas tras una lesión por compresión del nervio.
Integración de la Línea de Producción y Flujo de Trabajo
El chip de larva se integra en flujos de trabajo de descubrimiento temprano al permitir la obtención de imágenes en vivo de procesos neuronales antes de la identificación del fármaco candidato, lo que apoya la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías en modelos basados en Drosophila.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis mediante la obtención de imágenes directas del transporte de vesículas mediado por cinasinas y los flujos de calcio en neuronas sensoriales.
- Selección: Permite la preparación del ensayo gracias a la inmovilización reproducible y la proximidad al lado ventral del cubreobjetos para un registro de imágenes constante.
- Análisis: Facilita la medición cuantitativa de las velocidades de transporte axonal (1.0 µm/s anterógrado, 0.8 µm/s retrógrado) y la detección de picos de calcio mediante indicadores genéticamente codificados.
- Investigación Traducional: Se conecta con trabajos preclínicos al modelar las respuestas a lesiones axonales, incluyendo brotamiento y fragmentación, durante periodos prolongados.
- Reutilización Empresarial: Establece el chip microfluídico de PDMS como una plataforma reutilizable para estudios longitudinales en múltiples sesiones experimentales.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva al permitir la observación de eventos neuronales rápidos sin interrupciones fisiológicas inducidas por anestésicos.
- Valor operativo: Garantiza la reproducibilidad mediante la preparación estandarizada del chip, la inmovilización basada en vacío y los protocolos de limpieza para prevenir interferencias por residuos de aceite.
- Valor estratégico: Mejora la eficiencia del capital al permitir el uso repetido de una misma larva, reduciendo el número de animales necesarios para estudios longitudinales.
- Impacto en el portafolio: Permite la priorización ajustada al riesgo mediante imágenes cuantificables de métricas de degeneración y regeneración tras una lesión.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el manejo de dispositivos microfluídicos, operación de sistemas de vacío y microscopía confocal para una imagen óptima.
- Depende del acceso a herramientas para moldear PDMS, puertos de vacío basados en jeringas y tubos de polietileno para sellado y conexiones fluídicas.
- Necesita una estandarización entre equipos en la preparación de larvas, aplicación de aceite y alineación de la cámara para garantizar una inmovilización consistente.
- Implica consideraciones de adaptación para diferentes tamaños larvales, requiriendo ajustes en las dimensiones del chip según la longitud del cuerpo (3,5–4 mm para el chip estándar).
- Incluye limitaciones prácticas, como la necesidad de evitar el recubrimiento de aceite en la tráquea y asegurar una orientación adecuada del lado ventral para la visualización de la cuerda nerviosa.
