Fabricación de un dispositivo de microfluidos para la compartimentación de las neuronas y los axones Soma

Bienvenidos al laboratorio del Dr. Newly John. El John Lab se especializa en la ingeniería de plataformas microfluídicas para aplicaciones biológicas. En este video, demostraremos la producción y utilización de un dispositivo microfluídico diseñado para la compartimentación y el cultivo de neuronas primarias.

El dispositivo neuronal se publicó por primera vez en Nature Methods en agosto de 2005. Desde su introducción, el dispositivo neuronal ha sido ampliamente utilizado por colaboradores de todo el mundo. El dispositivo neuronal consiste en una pieza de PDMS que se ha fundido sobre una oblea de silicio que contiene un patrón SUA del dispositivo, que se creó previamente mediante fotolitografía.

El dispositivo tiene tres características principales, cuatro depósitos, de ocho milímetros de diámetro, dos canales principales de 1,5 milímetros de ancho cada uno, siete milímetros de largo y cien micras de alto y micro ranuras, que tienen 10 micrómetros de ancho y tres micrómetros de altura que unen los dos canales principales. Las microranuras pueden variar en longitud de 150 micras a 900 micras, aunque la longitud estándar de elección es de 450 micras. Observando el dispositivo de modo que los canales principales y las microranuras estén verticales, podemos ver que los depósitos de la izquierda de las ranuras están conectados a través de los canales principales, al igual que los depósitos de la derecha.

Esta característica permite que el líquido fluya a través del canal principal, que es una característica importante, lo que permite cargar celdas y cambiar los medios. El dispositivo neuronal tiene tres ventajas principales sobre las plataformas tradicionales de cultivo de tejidos. Por un lado, permite la compartimentación de los cuerpos celulares o soma y los axones Con el dispositivo neuronal, es posible obtener fracciones axonales puras.

El tamaño y la longitud de las microranuras permiten que los axones pasen a través del otro canal principal y evitan que los cuerpos de sierra se crucen. En segundo lugar, debido al diseño del dispositivo y aprovechando la presión hidrostática, es posible someter el lado de la célula o el lado del axón del dispositivo a tratamientos separados simplemente manteniendo el volumen y los depósitos más altos en un lado del dispositivo frente al otro. Y número tres, la fracción axonal pura del dispositivo se puede cortar por succión al vacío, lo que permite al investigador estudiar y observar la regeneración axonal.

La investigadora Hina Lee ahora demostrará la preparación del dispositivo de neurona microfluídica. Se utiliza una oblea de silicio de tres Ang con un patrón hecho de SU eight por una fotolitografía para fundir el molde microfluídico de polidimetil Sloane PDMS. Nos referimos a la oblea de silicio con patrón SUA como moldes maestros o simplemente maestros.

El PDMS se mezcla con el agente de curado en una proporción de peso por peso de 10 a uno. Es decir, por ejemplo, 15 gramos de PDMS por 1,5 gramos de agente de curado. A continuación, el PDMS se mezcla bien y se vierte sobre la oblea de silicio.

La oblea de silicio está contenida dentro de una placa de Petri de poliestireno de 10 centímetros. Se necesitan aproximadamente de 12 a 15 gramos de PDMS para cubrir los MA con un grosor de aproximadamente cuatro milímetros. A continuación, el maestro con el PDMS se coloca en una desecación al vacío con la tapa fuera de la placa de Petri y se aplica el vacío.

Esto se hace para ayudar a eliminar las burbujas de aire del PDMS que se introdujeron durante la agitación del agente de curado. Las burbujas de aire tardan aproximadamente 15 minutos en eliminarse. El maestro con PDMS se retira del desecado después de 15 minutos en el desecado al vacío.

Todavía quedan algunas burbujas en el maestro PDMS. Se utiliza una pistola de aire con un filtro de 0,45 micras para eliminar las burbujas restantes. A continuación, el maestro se coloca en una placa calefactora de 80 grados durante una hora para que se cure.

Si no se dispone de un desecador al vacío, el maestro puede dejarse a temperatura ambiente durante varias horas. Las burbujas de aire eventualmente se disiparán por sí solas. Si no hay una placa caliente disponible, el PDMS se curará a temperatura ambiente después de 24 horas.

Es importante asegurarse de que el maestro esté nivelado durante el proceso de curado. Una vez que el PDMS se cura en el maestro, se lleva a una campana limpia con una cuchilla quirúrgica. Se realiza un corte circular alrededor del perímetro de los dispositivos.

Es importante que cuando se inserte la cuchilla en el PDMS entre en contacto con la oblea de silicona, pero no ejerza demasiada presión sobre la oblea o de lo contrario el maestro se agrietará con un corte circular alrededor de los dispositivos. Hay cuatro dispositivos por cada maestro de silicio de tres pulgadas. El PDMS se levanta con cuidado del maestro.

Esto se puede iniciar girando suavemente la cuchilla quirúrgica a medida que se inserta en el corte anterior. Es realmente delgado con los dispositivos PDMS en el molde. Los reservorios boca arriba se perforan en el dispositivo con un punzón de biopsia de tejido de ocho milímetros.

Los residuos que quedan en el punzón se empujan hacia afuera con una varilla. A continuación, los dispositivos se cortan en cuartos y se recorta el exceso de PDMS para que el dispositivo quepa perfectamente en una cubierta Corning. El vidrio número uno, tamaño 24 milímetros por 40 milímetros, se utiliza aire de nitrógeno para soplar cualquier exceso de desechos.

Los residuos persistentes también se pueden eliminar con cinta de vinilo 3M Scotch Brand 4 7 1. Los dispositivos limpios ya están listos para la unión por plasma. Se utiliza un limpiador de plasma herrick para unir los dispositivos neuronales a los cubreobjetos brevemente.

Los dispositivos y los cubreobjetos se colocan en una bandeja, y luego la bandeja se coloca en el limpiador de plasma y se utiliza una bomba de vacío para evacuar el aire de la cámara. Es importante tener en cuenta que los dispositivos PDMS se colocan boca arriba. Es decir, con el diseño hacia arriba para que estén expuestos al gas plasma.

Una vez que la presión de vacío ha alcanzado 300, la potencia militorr se enciende en la bobina eléctrica y se configura a alta. Todo está abierto en la puerta para dejar entrar un poco de aire en la cámara, lo que ayudará a generar el plasma. Los dispositivos y el cubreobjetos se tratan con plasma durante dos minutos.

Fíjate en el color púrpura de la cámara. Ese es el plasma real. La bobina eléctrica crea plasma, que es un gas parcialmente ionizado que consta de electrones, iones y atos o moléculas neutras.

El plasma crea especies reactivas en la superficie del vidrio y del dispositivo, que cuando se colocan juntas formarán un enlace permanente. El plasma también convierte la superficie en hidrófila, lo que ayuda a facilitar la adición de líquidos. El limpiador de plasma también esteriliza los dispositivos.

Después del tratamiento con plasma durante dos minutos, se apaga la energía en el vacío y se conduce el aire a la cámara. Los servicios tratados con plasma del vidrio y el dispositivo microfluídico se ensamblan en contacto entre sí en un banco limpio. A continuación, los dispositivos se colocan en placas estériles de 60 milímetros.

Las superficies tratadas con plasma del vidrio y el dispositivo forman una unión estrecha e irreversible. Dentro de los 10 minutos posteriores a la unión del plasma, el dispositivo se agrega al vidrio de poliol lisina que se agrega al dispositivo. Después de 10 minutos, la hidrofilicidad del dispositivo disminuirá.

Lo que dificulta la entrada del PLL en el dispositivo. Es importante comprobar si hay burbujas de aire en el dispositivo después de la adición de PLL. Un método sencillo para eliminar las burbujas de aire presentes es utilizar una pipeta P 200 llena de 100 microlitros de líquido.

En este caso, PLL coloque la punta directamente en la apertura del canal principal, luego presione el P 200 con fuerza. Es posible que sea necesario repetirlo varias veces, pero con el tiempo la fuerza de la pipeta expulsará las burbujas. Los dispositivos que contienen PLL se dejan incubar durante la noche y una incubadora de cultivo de tejidos estándar a 37 grados con 5% de CO2.

Después de 24 horas de incubación con PLL, los dispositivos se enjuagan dos veces rápidamente con agua desionizada en autoclave. Durante este proceso, el líquido nunca se elimina por completo de los canales principales, solo de los depósitos. La eliminación del líquido de los canales principales introducirá burbujas.

Después de dos enjuagues rápidos, los dispositivos se llenan con agua desionizada en autoclave una vez más y se vuelven a colocar en la incubadora durante un mínimo de tres horas o toda la noche. Al día siguiente, después de que los dispositivos se hayan incubado con agua durante toda la noche o durante un mínimo de tres horas, se vuelven a introducir en la cabina de bioseguridad y se enjuagan dos veces con agua desionizada. A continuación, se añaden a los dispositivos medios neuronales basales que contienen los suplementos necesarios, B27 y glutamato para el cultivo de neuronas primarias de rata.

A continuación, los dispositivos se vuelven a colocar en la incubadora para su uso futuro. Los dispositivos ya están listos para asentar neuronas. En este vídeo, hemos demostrado la técnica de litografía blanda, que utilizamos para fabricar nuestros dispositivos neuronales.

Estos dispositivos se pueden utilizar para cultivar neuronas y otros tipos de células de interés. La principal ventaja de estos dispositivos es la capacidad de separar y compartimentar el cultivo de los cuerpos de las células neuronales en un lado del dispositivo de una fracción axonal pura en el otro lado del dispositivo. En el siguiente vídeo, te mostraremos cómo preparamos las neuronas corticales del rack fetal E 18 y cómo cargamos las células en el dispositivo.

Así que eso es todo del John Lab. Gracias por mirar.