Evaluación de la seguridad microbiana de las lecherías mediante perfiles proteómicos bacterianos mediante el enfoque MALDI

Desarrollamos un protocolo para preparar y aislar comunidades microbianas a partir de diversos productos diarios, como leche, nata, mantequilla y queso. Una vez aislado, este microorganismo puede identificarse rápida y con precisión usando la MALDI-TOF MS. Optimizar las condiciones del cultivo sigue siendo un desafío clave, junto con lagunas en bases de datos y la exigente extracción de bacterias grampositivas y formadoras de esporas. Para empezar, obtén una muestra representativa del producto lácteo y mezcla bien para asegurar la uniformidad.

Asépticamente, transfiere un mililitro o un gramo de muestras sólidas a un tubo cónico de centrífuga de 15 mililitros que contiene nueve mililitros de medio líquido estéril. Agita vigorosamente el tubo durante 30 a 60 segundos para homogeneizar la muestra. A continuación, prepara una serie de diluciones de diez veces más transfiriendo un mililitro de la suspensión homogeneizada en tubos sucesivos, cada uno con nueve mililitros de solución estéril.

Mezcla cada dilución a fondo mediante vórtices o agitaciones. Luego, toma 0,1 mililitros de la muestra original, o de una de las diluciones preparadas, y transfiere a la superficie de una placa de Petri preparada que contenga el medio de agar adecuado. Utilizando un esparcidor estéril, distribuye uniformemente el inóculo sobre la superficie de la placa de ágar.

Para la incubación aeróbica, inocúla las placas de agar APT, M17, CBL, MPCA y TSA con las muestras preparadas. Incubar las placas en condiciones aeróbicas a 37 y 30 grados Celsius durante 24 horas. Para la incubación anaeróbica, colocar las placas de agar de MRS inoculadas en una cámara anaeróbia e incubar a 37 y 30 grados Celsius durante 24 a 72 horas.

Retira las placas de la incubadora y explínalas diariamente para monitorizar el crecimiento microbiano. Utilizando un lazo microbiano de un microlitro, esparcir las colonias seleccionadas sobre el mismo medio de agar para subcultivarlas. Incubar bajo las mismas condiciones que se usaban anteriormente.

Para el análisis de espectrometría de masas, comienza preparando la solución de la matriz MALDI. Prepara la mezcla de disolventes usando 50% acetonitrilo, 47,5% agua de grado HPLC y ácido tricloroacético al 2,5%. Disolver el compuesto de la matriz en la mezcla de disolventes hasta una concentración final de aproximadamente 10 miligramos por mililitro.

Para la identificación de bacterias en EM mediante el método de transferencia directa de colonias, se utiliza un lazo estéril para transferir un microlitro de una colonia bacteriana crecida a un punto de la placa objetivo de MALDI. Extiende el material bacteriano para crear una capa fina y uniforme en la placa. Una vez secado, añade un microlitro de solución matriz HCCA encima y déjalo secar al aire a temperatura ambiente.

Para el método de extracción de ácido fórmico objetivo, utiliza un lazo microbiano desechable o un palillo estéril para extraer una pequeña cantidad de biomasa bacteriana de una sola colonia. Unta el material directamente sobre un punto de la placa objetivo de MALDI para crear una capa fina y uniforme. Añade un microlitro de solución de ácido fórmico al 70% sobre la zona manchada.

Una vez secado el punto, cúptalo con un microlitro de solución de matriz HCCA y déjalo secar al aire a temperatura ambiente. Para el método de extracción de proteínas en tubo, transfiere de una a tres colonias completas de una placa de cultivo de agar a un tubo microcentrífuga de 1,5 mililitros que contiene 300 microlitros de agua estéril. Añade 900 microlitros de etanol absoluto para lograr una concentración final de aproximadamente el 75%. Después de mezclar brevemente el contenido, centrifugar el tubo durante dos minutos a 15.000 g a temperatura ambiente.

Después, descarta cuidadosamente el sobrenadante sin alterar la célula. Luego, añade entre 20 y 50 microlitros de ácido fórmico al 70% al pellet de células secas. Mezcla el contenido pipeteando o haciendo vórtices hasta que el pellet esté completamente resuspendido.

Ahora, añade un volumen igual de acetonitrilo a la suspensión de ácido fórmico y mezclad bien. Centrifuga el tubo a 15.000 g durante dos minutos. Transfiere un microlitro del sobrenadante resultante a un punto designado en una placa objetivo MALDI y déjelo secar.

Luego, superpon la zona seca con un microlitro de solución de matriz HCCA. Pipete un microlitro de la prueba bacteriana que contiene un extracto de Escherichia coli DH5 alfa o del calibrador microbiológico que contiene extracto de proteína E.coli ATCC 25922, ribonucleasa y mioglobina. Para la adquisición de espectros e identificación microbiana, prepare puntos de calibración en la placa objetivo de MALDI.

Carga la placa objetivo MALDI con los puntos de muestra preparados y los puntos calibrantes en el instrumento de espectrometría de masas. Ejecuta el análisis de calibración en modo calibración para calibrar el sistema. Operar el espectrómetro de masas en modo lineal positivo de iones para la adquisición general de espectros.

Luego, ajusta el rango de detección de masa del espectrómetro de masas para cubrir entre 2.000 y 20.000 de relación masa-carga. Adquiere espectros duplicados para cada punto para generar al menos cuatro réplicas técnicas por muestra. Ahora, aplica el método de Savitzky-Golay como un algoritmo de suavización.

Utiliza el algoritmo TopHat para la corrección de la línea base y eliminar el ruido de fondo. Luego, detecta picos usando el modo centroide. Sube los espectros de masas procesados de aislados bacterianos desconocidos a la plataforma de identificación microbiana dentro del software MALDI y ejecuta la identificación.

Evalúa las puntuaciones de identificación según los estándares umbral del fabricante. Los espectros de espectrometría de masas mostraron perfiles proteicos específicos de cada especie, lo que permitió la identificación a nivel de género o especie. El dendrograma reveló una alta similitud observada entre cepas de la misma especie y una clara diferenciación entre especies.

Un tiempo de incubación más corto, de 12 horas, para Bacillus licheniformis produjo un valor de puntuación de DI más alto, de 2,38, mientras que una incubación más larga de 18 a 24 horas llevó a un valor de puntuación de DI más bajo, de 1,85, debido a la predominancia de las señales de esporas. Entre los métodos de preparación de muestras, la extracción de proteínas en tubo dio el valor de puntuación DI más alto, 2,23, seguida de la extracción de ácido fórmico en el objetivo con 1,97, y la transferencia directa de colonias, que resultó en la puntuación más baja de 1,61. Al combinar cultivomics con preparación de muestras personalizada, MALDI permite un análisis del microbioma más preciso y rápido a menor coste, produciendo resultados comparables a los métodos de referencia de 16S rRNA.

Este protocolo permite un monitoreo rutinario y de alto rendimiento de microorganismos en productos lácteos, mejorando la velocidad y precisión de la detección y, en última instancia, reforzando los sistemas de calidad y seguridad alimentaria. Ampliar las bases de datos MALDI y automatizar los flujos de trabajo en los laboratorios industriales mejorará la identificación microbiana, aumentará el rendimiento, reducirá errores y acelerará la monitorización de la microbiota.