Análisis específico del subtipo celular del proteasoma de membrana neuronal en neuronas somatosensoriales

Estamos investigando los mecanismos de cómo las neuronas somatosensoriales se comunican a través del proteasoma de membrana neuronal o NNP recientemente descubierto para modular la forma en que sentimos el tacto, la picazón y el dolor. Recientemente descubrimos el proteasoma de la membrana neuronal, un complejo especializado en degradación de proteínas que se encuentra en algunas neuronas sensoriales, que funciona para modular la sensibilidad al tacto, la picazón y el dolor. Con este protocolo, podremos investigar la dinámica de expresión y modulación de la NMP de una manera específica del tipo de célula en condiciones de salud y enfermedad.

Nuestro protocolo permite aislar las neuronas que expresan NMP de las neuronas que no expresan NMP para poder estudiar su función con la especificidad del tipo de célula. Es importante destacar que estas poblaciones neuronales aisladas siguen siendo viables para los análisis posteriores. Con estos protocolos, comenzaremos a investigar cómo las diferentes condiciones neuropáticas afectan la expresión y función del NMP, y cómo esto contribuye a la alteración del tacto, la picazón y la sensación de dolor.

Para comenzar, transfiera los ganglios de la raíz dorsal cosechados a un tubo cónico de 15 mililitros. Con una pipeta, agregue siete mililitros de solución de trabajo de mezcla de enzimas de disociación tisular al tubo e incube a 37 grados Celsius con agitación suave durante 20 minutos. Coloque el tubo en una centrífuga y gire los ganglios a 120 G durante dos minutos.

Aspira con cuidado el sobrenadante sin alterar el gránulo. Vuelva a suspender los ganglios en siete mililitros de mezcla de enzimas de disociación tisular de baja trituración con papaína. Después de centrifugar el tubo nuevamente, aspire y deseche el sobrenadante.

Luego vuelva a suspender los ganglios en 500 microlitros de solución de BSA, TI y DMEM. Con una pipeta de pasto de vidrio pulido al fuego de un mililitro, triture los ganglios de 12 a 16 veces. Pase la suspensión celular a través de un filtro celular de 40 micrómetros para filtrar los desechos celulares.

Lave el colador con un mililitro de solución de BSA, TI y DMEM para recolectar las neuronas restantes de los ganglios de la raíz dorsal. Transfiera la suspensión celular filtrada a un tubo cónico de 15 mililitros. Prepare una bandeja de tinción de inmunofluorescencia forrándola con un trozo grande de parafilm.

Usando pinzas estériles 5-45, transfiera los resbalones de la cubierta de la placa de cultivo de tejidos a la película para, asegurándose de que el lado que contiene las neuronas de los ganglios de la raíz dorsal mire hacia arriba. Pipetea lentamente 100 microlitros de medios de ganglios de la raíz dorsal en cada cubreobjetos para evitar que las células se sequen. Luego diluya el anticuerpo primario go anti PSM alfa dos en medios de ganglios de la raíz dorsal calientes para lograr una dilución de uno a 20.

Con un aspirador equipado con una punta P10 sin filtrar, retire lentamente el medio del borde de cada cubreobjetos. Agregue 100 microlitros de la solución de anticuerpos go anti PSM alfa dos a cada cubreobjetos e incube a temperatura ambiente durante 40 minutos. Después de eso, aspire cuidadosamente la solución de anticuerpos primarios de cada cubreobjetos.

Agregue 100 microlitros de PBS a temperatura ambiente a las células e incube a temperatura ambiente durante tres minutos para lavar. Ahora, para preparar el anticuerpo secundario anti go, dilúyalo en medios de ganglios de la raíz dorsal calientes en una dilución de uno a 250. Después de completar el tercer lavado, agregue 100 microlitros de la solución de anticuerpos secundarios diluida a cada cubreobjetos.

Incube los cubreobjetos a temperatura ambiente durante 40 minutos mientras protege las células de la luz. Luego aspire la solución de anticuerpos secundarios de los cubreobjetos y lave las células tres veces, usando PBS como se describió anteriormente. Después del lavado final de PBS, agregue 100 microlitros de solución fijadora que contenga 4% de formaldehído y 4% de sacarosa en PBS.

Una vez que las células se incuban a temperatura ambiente durante 10 minutos, aspire el fijador de cada cubreobjetos. Luego lave las células tres veces con PBS como se describió anteriormente. Para permeabolizar las células, agregue 100 microlitros de detergente no iónico al 0,1% en PBS.

Incube los cubreobjetos a temperatura ambiente durante cinco minutos. Luego aspire la solución permeable de los cubreobjetos y lave las celdas tres veces, usando PBS como se describió anteriormente. Agregue 100 microlitros de solución bloqueadora compuesta por suero bovino fetal al 5% y suero de burro al 5% en PBS a cada cubreobjetos.

A continuación, diluya el conjugado de biotina de conejo anti CGRP, el conjugado de biotina A selectina B cuatro y el anti NFH de pollo en la solución de bloqueo para preparar la mezcla de anticuerpos primarios específicos del tipo de célula de neurona ganglionar de la raíz dorsal. Aspire la solución de bloqueo de los cubreobjetos, luego agregue 100 microlitros de la mezcla de anticuerpos primarios preparada a cada cubreobjetos. Incube los cubreobjetos a temperatura ambiente durante 45 minutos mientras los protege de la luz.

Luego, retire la solución de anticuerpos primarios de los cubreobjetos y lave las células tres veces, usando PBS como se describió anteriormente. Ahora prepare la mezcla de anticuerpos secundarios diluyendo estreptavidina, burro anti conejo y burro anti pollo a uno a 500 cada uno en una solución de bloqueo. Aspire el lavado final de PBS de cada cubreobjetos, luego agregue 100 microlitros de la solución de anticuerpos secundarios preparada.

Incube los cubreobjetos a temperatura ambiente durante 45 minutos en la oscuridad. Aspira el lavado final del cubreobjetos. Con pinzas de punta fina, levante cada cubreobjetos del parafilm y seque suavemente el exceso de líquido tocando el borde del cubreobjetos con un pañuelo sin pelusa.

Coloque una gota de siete microlitros de medio de montaje en un portaobjetos de microscopio. Baje con cuidado el cubreobjetos sobre el medio de montaje con el lado de la celda hacia abajo, asegurando un contacto total con el medio. Coloque las diapositivas preparadas en un cajón o caja oscura y seca para que se sequen durante al menos una hora.

Selle el borde del cubreobjetos con esmalte de uñas de secado rápido y espere de 10 a 15 minutos antes de obtener imágenes. Los anticuerpos que se alimentan de neuronas ganglionares de la raíz dorsal vivas revelaron una subpoblación de neuronas con proteasomas accesibles en la superficie, mientras que las muestras de control que carecen de anticuerpos primarios no mostraron etiquetado en la superficie. La citometría de flujo identificó dos poblaciones distintas de neuronas ganglionares de la raíz dorsal, según la intensidad de la fluorescencia, separando las células NMP positivas de las NMP negativas con regiones de activación claras establecidas, utilizando controles.

La cuantificación de las poblaciones clasificadas por flujo mostró que aproximadamente el 4% de las neuronas ganglionares de la raíz dorsal eran positivas para NMP, mientras que la mayoría restante eran negativas para NMP. Las neuronas NMP positivas y NMP negativas seleccionadas conservaron la viabilidad y expresaron marcadores específicos del tipo de célula NFH, IB cuatro y CGRP, lo que confirma la idoneidad del flujo de trabajo para el análisis molecular posterior.