Preparación de sináptica Membrana plasmática y proteínas postsináptica densidad utilizando un gradiente discontinuo de sacarosa
3 de septiembre de 2014
Este artículo detalla el enriquecimiento de las proteínas asociadas con la membrana plasmática sináptica por ultracentrifugación en un gradiente discontinuo de sacarosa. También se describe la preparación posterior de las proteínas de densidad post-sináptica. Preparaciones de proteínas son adecuados para el Western Blot o análisis DIGE 2D.
El objetivo general de este procedimiento es demostrar el fraccionamiento subcelular del tejido cerebral utilizando un gradiente discontinuo de sacarosa para enriquecer proteínas de las membranas sinápticas y las densidades postsinápticas. Esto se logra homogeneizando primero el tejido cerebral con un homogeneizador motorizado. A continuación, se presentan una serie de pasos de centrifugación para preparar extractos crudos de proteínas de membrana.
A continuación, los extractos de membrana se colocan en capas en un gradiente discontinuo de sacarosa para su ultracentrifugación. El paso final es recolectar las proteínas del gradiente. En última instancia, los resultados pueden mostrar cambios en los niveles de proteínas sinápticas a través del análisis de Western blot.
Esta es una técnica bien establecida que ha sido utilizada por los neurocientíficos durante más de 40 años. Lo usamos en nuestro laboratorio para comprender cómo cambia la composición proteica de la sinapsis cuando perturbamos diferentes sistemas de neurotransmisores. La principal ventaja de esta técnica sobre otros métodos, como los gradientes por llamada o los gradientes continuos de sacarosa, es que los gradientes discontinuos de sacarosa son más fáciles de construir a mano.
Este protocolo hace uso de un homogeneizador de teflón de vidrio accionado por motor, siempre reemplace el mortero entre muestras y enjuague y seque. En primer lugar, el homogeneizador carga el tejido disecado en un tubo de 13 mililitros con cuatro mililitros de solución de sacarosa tamponada HEPA 0,32 molar. A continuación, transfiera el tejido a un homogeneizador de vidrio limpio.
Ajuste el motor a 900 RPM y homogeneice la muestra con 12 golpes durante 30 segundos utilizando menos de cuatro gramos de tejido, asegure un buen fraccionamiento, transfiera la muestra de nuevo al tubo y almacene una alícuota de 100 microlitros a 80 grados centígrados negativos para el análisis de proteínas. A continuación, separe el material nuclear haciendo girar el homogeneizado a 900 G durante 10 minutos. A cuatro grados centígrados, transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de 15 mililitros.
El sobrenadante contiene la fracción bruta de la membrana. Ahora, para enriquecer para la centrífuga de sinaptosomas crudos, el sobrenadante a 10, 000 G durante 15 minutos a cuatro grados centígrados, elimine el sobrenadante. El pellet contiene la fracción cruda de sinaptosomas Resus.
Suspenderlo en un mililitro de solución de sacarosa 0,32 molar. Luego, a otros tres mililitros de solución a la centrífuga en suspensión, la fracción bruta durante 15 minutos A 10, 000 G a cuatro grados centígrados, retire el sobrenadante. Ahora pique rápidamente el pellet, vuelva a suspender el pellet en un mililitro de agua pura.
Luego agregue otros tres mililitros de agua rápidamente. Transfiera esto al homogeneizador. Aplique tres pasadas a mano y transfiéralo nuevamente al tubo de 13 mililitros.
Ajuste rápidamente la muestra a cuatro milimolares de HEAs con una adición de 16 microlitros de HEAs de un molar y mézclela por inversión. Ahora coloque la muestra en un rotador a cuatro grados centígrados durante media hora. Para asegurar la lisis de la muestra, finalice el fraccionamiento granulando la fracción de dos primos Lysed P.
Girar a 25.000 g durante 20 minutos a cuatro grados centígrados, retirar el sobrenadante, volver a suspender el pellet en un mililitro de solución de sacarosa. Contiene las membranas episomales sinapicas enriquecidas. En primer lugar, mida previamente los tampones para crear un gradiente discontinuo de sacarosa.
Cargue tres tubos de la siguiente manera, uno con exactamente 3,5 mililitros de solución de sacarosa tamponada de montones 1,2 molares. Otro con exactamente tres mililitros de solución 1,0 molar, y el tercero con tres mililitros de solución 0,8 molar. A continuación, con una pipeta de vidrio para plagas, transfiera la solución de sacarosa 1,2 molar a un tubo ultracentrífugo de polímero de 12 mililitros.
Con una pipeta nueva, coloque cuidadosamente la solución 1,0 molar sobre la solución 1,2 molar. No molar la solución 1,2 molar ni introducir burbujas con la pipeta. Utiliza la misma técnica para colocar la solución 0,8 molar en capas encima.
Ten precaución. Las pequeñas vibraciones de un vórtice de banco o una microcentrífuga son suficientes para perturbar la integridad del gradiente. Es importante construir los degradados de manera cuidadosa y eficiente.
Si tarda demasiado o si el gradiente está expuesto a vibraciones, no podrá recuperar las membranas sinápticas en los pasos posteriores. Ahora, con otra capa de pipeta pastor, la fracción de membrana episomal sinap enriquecida sobre el gradiente preparado. Equilibre con precisión el gradiente en una ultracentrífuga en un rotor de cucharón oscilante.
A continuación, gíralo a 150.000 g durante dos horas a cuatro grados centígrados. Tenga mucho cuidado al eliminar el gradiente del balde después de la centrifugación, debe haber bandas claras de solución de sacarosa. Con fracciones de proteína en cada interfaz y un pellet, las fracciones no deben ser difusas.
Con una aguja de calibre 18 y una jeringa de un mililitro, perfore la parte más baja de la interfaz molar hasta 1,2 y extraiga la banda blanca de proteína, que contiene las membranas plasmáticas sinápticas. Registra el volumen de esta capa. Transfiera la capa a un tubo ultracentrífugo de pared de 3,5 mililitros de grosor.
Añada exactamente 2,5 volúmenes de cuatro HEAs milimolares. A continuación, prepare un tubo equilibrador con una solución de sacarosa tamponada de HEAs 0,32 molares en un rotor de ángulo fijo, ultracentrífugo la muestra a 200.000 G durante 30 minutos a cuatro grados centígrados. A continuación, deseche el sen y vuelva a suspender la pastilla de membrana plasmática sináptica.
En 300 microlitros de 50 milimolares de HEAs dos milimolares de solución de EDTA. La fracción de densidad postsináptica o fracción PSD ahora se puede recolectar mediante el uso adicional de las mismas técnicas. Los pasos están claramente descritos en el protocolo de texto.
Se ejecutó un western blot con una proteína total, la membrana plasmática sináptica, y las primeras fracciones de proteínas de densidad postsináptica. La fracción PSD se sometió a un solo tratamiento con detergente, y el tejido procedía de cuerpo estriado de ratón. Las proteínas presinápticas, como el transportador de dopamina, se enriquecen en la fracción SPM, pero se eliminan en el paso posterior del detergente para el enriquecimiento de PSD.
Al intentar este procedimiento, es importante recordar mantener todas las muestras en hielo e incluir inhibidores de la proteasa y la fosfatasa después de este procedimiento. Se pueden realizar otros métodos, como el análisis de sangre occidental o la electroforesis en gel bidimensional. A continuación, puede responder a preguntas como cómo el tratamiento farmacológico afecta a los niveles de receptores en la sinapsis.
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Descripción general
Este artículo describe el enriquecimiento de proteínas asociadas con la membrana plasmática sináptica mediante ultracentrifugación en un gradiente discontinuo de sacarosa. El procedimiento demuestra la fraccionación subcelular de tejido cerebral para enriquecer proteínas procedentes de membranas sinápticas y densidades postsinápticas.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología celular
- Análisis de proteínas
Antecedentes
- Comprender los niveles de proteínas sinápticas es fundamental para la investigación en neurociencia.
- Las membranas sinápticas y las densidades postsinápticas desempeñan funciones clave en la comunicación neuronal.
- La ultracentrifugación es una técnica estándar para el enriquecimiento de proteínas.
- El inmunotransferencia (Western blotting) y la DIGE 2D son métodos comunes para el análisis de proteínas.
Objetivo del estudio
- Enriquecer proteínas a partir de membranas sinápticas y densidades post-sinápticas.
- Preparar extractos proteicos adecuados para análisis posteriores.
- Demostrar la eficacia de un gradiente discontinuo de sacarosa en el enriquecimiento de proteínas.
Métodos Utilizados
- Homogeneización del tejido cerebral utilizando un homogeneizador mecánico.
- Serie de pasos de centrifugación para preparar extractos crudos de proteínas de membrana.
- Deposición de los extractos de membrana sobre un gradiente discontinuo de sacarosa.
- Ultracentrifugación para recolectar proteínas del gradiente.
Resultados principales
- Enriquecimiento exitoso de proteínas de membrana plasmática sináptica.
- Preparación de proteínas de la densidad post-sináptica para análisis.
- Los resultados pueden indicar cambios en los niveles de proteínas sinápticas.
- Adecuado para análisis mediante inmunotransferencia (Western blot) y DIGE 2D.
Conclusiones
- El método enriquece eficazmente proteínas de membranas sinápticas.
- Proporciona una base para estudiar la dinámica de las proteínas sinápticas.
- Puede aplicarse a diversas preguntas de investigación en neurociencia.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La cuantificación de proteínas sinápticas permite reducir riesgos mecanicistas en la validación de dianas del SNC al vincular cambios moleculares con fenotipos funcionales. Este método de fraccionamiento subcelular respalda la confianza predictiva en las fases iniciales del descubrimiento mediante el aislamiento de compartimentos sinápticos relevantes para la enfermedad. Proporciona un sistema relevante para la enfermedad que permite evaluar la interacción con la diana y la modulación de vías en modelos preclínicos.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la verificación de hipótesis terapéuticas mediante la cuantificación del tráfico de proteínas de la membrana plasmática sináptica y de la densidad postsináptica.
- Valor operativo: Proporciona un enfoque estandarizado para aislar compartimentos sinápticos con fines de reducción de riesgos en dianas.
- Valor predictivo: Facilita la alineación de biomarcadores al medir los cambios en los niveles de proteínas presinápticas y postsinápticas tras la modulación de vías.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Prepara fracciones de proteínas sinápticas validadas para su uso en ensayos de cribado fenotípico destinados a evaluar los efectos de compuestos sobre la integridad sináptica.
- Valor operativo: Genera salidas proteicas cuantitativas y reproducibles, adecuadas para la estandarización de ensayos y análisis de alto contenido.
- Escalabilidad: El método de gradiente discontinuo de sacarosa permite el procesamiento por lotes de muestras para una disponibilidad constante en cribados.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Valor científico: Permite la modelización de sistemas relevantes para enfermedades mediante el aislamiento de proteínas sinápticas de regiones cerebrales específicas, como el estriado, para estudiar dianas neuropsiquiátricas.
- Valor operativo: Apoya el desarrollo de biomarcadores traslacionales al proporcionar lecturas cuantificables de proteínas sinápticas correlacionadas con resultados funcionales.
- Reducción de riesgos: Facilita la continuidad preclínica al vincular la modulación de dianas con cambios medibles en la composición de proteínas sinápticas.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
Este método se integra en el continuo de descubrimiento, desde la prueba de hipótesis sobre dianas hasta la identificación de compuestos activos y la validación preclínica, al proporcionar datos cuantitativos sobre proteínas sinápticas.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías al aislar compartimentos sinápticos afectados por perturbaciones en sistemas de neurotransmisores.
- Selección: Permite la preparación del ensayo mediante la producción de fracciones enriquecidas de membrana plasmática sináptica y del PSD, adecuadas para análisis por inmunotransferencia o DIGE en 2D.
- Análisis: Proporciona mediciones cuantitativas de variables dependientes (intensidad de bandas proteicas) que permiten comparar los niveles de proteínas sinápticas entre distintas condiciones experimentales.
- Investigación Traducional: Conecta los hallazgos del descubrimiento con la continuidad preclínica al permitir la evaluación de cambios en proteínas sinápticas en modelos de enfermedad.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable para el aislamiento de proteínas sinápticas en múltiples proyectos del SNC y clases de dianas.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la validación de objetivos al reducir la ambigüedad mecanicista mediante la medición directa del tráfico de proteínas sinápticas.
- Valor operativo: Garantiza la reproducibilidad y la estandarización mediante un protocolo bien establecido de gradiente discontinuo de sacarosa con pasos definidos de centrifugación.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al proporcionar datos sinápticos cuantitativos tempranos que reducen los riesgos en la progresión de objetivos del SNC.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de objetivos del SNC basada en efectos medibles sobre la composición de proteínas sinápticas y la función sináptica.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en fraccionamiento subcelular, ultracentrifugación y biología sináptica para garantizar la formación adecuada del gradiente y la recolección de fracciones.
- Depende del acceso a un ultracentrífugo con rotor de cesta oscilante y rotor de ángulo fijo, y de la capacidad para mantener las muestras a 4 °C durante todo el proceso.
- Necesita una estandarización entre equipos en la preparación del gradiente, la homogenización del tejido y el uso de inhibidores de proteasas/fosfatasas para asegurar la reproducibilidad entre diferentes centros.
- Requiere consideraciones de adaptación al aplicarse a distintas regiones cerebrales o modelos de enfermedad debido a las variaciones en la expresión de proteínas sinápticas y el rendimiento del tejido.
- Las limitaciones prácticas incluyen la necesidad de tejido fresco o almacenado adecuadamente, así como un manejo cuidadoso para evitar la alteración del gradiente por vibraciones o retrasos durante la preparación.
