Preparación de sináptica Membrana plasmática y proteínas postsináptica densidad utilizando un gradiente discontinuo de sacarosa

El objetivo general de este procedimiento es demostrar el fraccionamiento subcelular del tejido cerebral utilizando un gradiente discontinuo de sacarosa para enriquecer proteínas de las membranas sinápticas y las densidades postsinápticas. Esto se logra homogeneizando primero el tejido cerebral con un homogeneizador motorizado. A continuación, se presentan una serie de pasos de centrifugación para preparar extractos crudos de proteínas de membrana.

A continuación, los extractos de membrana se colocan en capas en un gradiente discontinuo de sacarosa para su ultracentrifugación. El paso final es recolectar las proteínas del gradiente. En última instancia, los resultados pueden mostrar cambios en los niveles de proteínas sinápticas a través del análisis de Western blot.

Esta es una técnica bien establecida que ha sido utilizada por los neurocientíficos durante más de 40 años. Lo usamos en nuestro laboratorio para comprender cómo cambia la composición proteica de la sinapsis cuando perturbamos diferentes sistemas de neurotransmisores. La principal ventaja de esta técnica sobre otros métodos, como los gradientes por llamada o los gradientes continuos de sacarosa, es que los gradientes discontinuos de sacarosa son más fáciles de construir a mano.

Este protocolo hace uso de un homogeneizador de teflón de vidrio accionado por motor, siempre reemplace el mortero entre muestras y enjuague y seque. En primer lugar, el homogeneizador carga el tejido disecado en un tubo de 13 mililitros con cuatro mililitros de solución de sacarosa tamponada HEPA 0,32 molar. A continuación, transfiera el tejido a un homogeneizador de vidrio limpio.

Ajuste el motor a 900 RPM y homogeneice la muestra con 12 golpes durante 30 segundos utilizando menos de cuatro gramos de tejido, asegure un buen fraccionamiento, transfiera la muestra de nuevo al tubo y almacene una alícuota de 100 microlitros a 80 grados centígrados negativos para el análisis de proteínas. A continuación, separe el material nuclear haciendo girar el homogeneizado a 900 G durante 10 minutos. A cuatro grados centígrados, transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de 15 mililitros.

El sobrenadante contiene la fracción bruta de la membrana. Ahora, para enriquecer para la centrífuga de sinaptosomas crudos, el sobrenadante a 10, 000 G durante 15 minutos a cuatro grados centígrados, elimine el sobrenadante. El pellet contiene la fracción cruda de sinaptosomas Resus.

Suspenderlo en un mililitro de solución de sacarosa 0,32 molar. Luego, a otros tres mililitros de solución a la centrífuga en suspensión, la fracción bruta durante 15 minutos A 10, 000 G a cuatro grados centígrados, retire el sobrenadante. Ahora pique rápidamente el pellet, vuelva a suspender el pellet en un mililitro de agua pura.

Luego agregue otros tres mililitros de agua rápidamente. Transfiera esto al homogeneizador. Aplique tres pasadas a mano y transfiéralo nuevamente al tubo de 13 mililitros.

Ajuste rápidamente la muestra a cuatro milimolares de HEAs con una adición de 16 microlitros de HEAs de un molar y mézclela por inversión. Ahora coloque la muestra en un rotador a cuatro grados centígrados durante media hora. Para asegurar la lisis de la muestra, finalice el fraccionamiento granulando la fracción de dos primos Lysed P.

Girar a 25.000 g durante 20 minutos a cuatro grados centígrados, retirar el sobrenadante, volver a suspender el pellet en un mililitro de solución de sacarosa. Contiene las membranas episomales sinapicas enriquecidas. En primer lugar, mida previamente los tampones para crear un gradiente discontinuo de sacarosa.

Cargue tres tubos de la siguiente manera, uno con exactamente 3,5 mililitros de solución de sacarosa tamponada de montones 1,2 molares. Otro con exactamente tres mililitros de solución 1,0 molar, y el tercero con tres mililitros de solución 0,8 molar. A continuación, con una pipeta de vidrio para plagas, transfiera la solución de sacarosa 1,2 molar a un tubo ultracentrífugo de polímero de 12 mililitros.

Con una pipeta nueva, coloque cuidadosamente la solución 1,0 molar sobre la solución 1,2 molar. No molar la solución 1,2 molar ni introducir burbujas con la pipeta. Utiliza la misma técnica para colocar la solución 0,8 molar en capas encima.

Ten precaución. Las pequeñas vibraciones de un vórtice de banco o una microcentrífuga son suficientes para perturbar la integridad del gradiente. Es importante construir los degradados de manera cuidadosa y eficiente.

Si tarda demasiado o si el gradiente está expuesto a vibraciones, no podrá recuperar las membranas sinápticas en los pasos posteriores. Ahora, con otra capa de pipeta pastor, la fracción de membrana episomal sinap enriquecida sobre el gradiente preparado. Equilibre con precisión el gradiente en una ultracentrífuga en un rotor de cucharón oscilante.

A continuación, gíralo a 150.000 g durante dos horas a cuatro grados centígrados. Tenga mucho cuidado al eliminar el gradiente del balde después de la centrifugación, debe haber bandas claras de solución de sacarosa. Con fracciones de proteína en cada interfaz y un pellet, las fracciones no deben ser difusas.

Con una aguja de calibre 18 y una jeringa de un mililitro, perfore la parte más baja de la interfaz molar hasta 1,2 y extraiga la banda blanca de proteína, que contiene las membranas plasmáticas sinápticas. Registra el volumen de esta capa. Transfiera la capa a un tubo ultracentrífugo de pared de 3,5 mililitros de grosor.

Añada exactamente 2,5 volúmenes de cuatro HEAs milimolares. A continuación, prepare un tubo equilibrador con una solución de sacarosa tamponada de HEAs 0,32 molares en un rotor de ángulo fijo, ultracentrífugo la muestra a 200.000 G durante 30 minutos a cuatro grados centígrados. A continuación, deseche el sen y vuelva a suspender la pastilla de membrana plasmática sináptica.

En 300 microlitros de 50 milimolares de HEAs dos milimolares de solución de EDTA. La fracción de densidad postsináptica o fracción PSD ahora se puede recolectar mediante el uso adicional de las mismas técnicas. Los pasos están claramente descritos en el protocolo de texto.

Se ejecutó un western blot con una proteína total, la membrana plasmática sináptica, y las primeras fracciones de proteínas de densidad postsináptica. La fracción PSD se sometió a un solo tratamiento con detergente, y el tejido procedía de cuerpo estriado de ratón. Las proteínas presinápticas, como el transportador de dopamina, se enriquecen en la fracción SPM, pero se eliminan en el paso posterior del detergente para el enriquecimiento de PSD.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar mantener todas las muestras en hielo e incluir inhibidores de la proteasa y la fosfatasa después de este procedimiento. Se pueden realizar otros métodos, como el análisis de sangre occidental o la electroforesis en gel bidimensional. A continuación, puede responder a preguntas como cómo el tratamiento farmacológico afecta a los niveles de receptores en la sinapsis.