Preparación de sináptica Membrana plasmática y proteínas postsináptica densidad utilizando un gradiente discontinuo de sacarosa
September 3rd, 2014
Este artículo detalla el enriquecimiento de las proteínas asociadas con la membrana plasmática sináptica por ultracentrifugación en un gradiente discontinuo de sacarosa. También se describe la preparación posterior de las proteínas de densidad post-sináptica. Preparaciones de proteínas son adecuados para el Western Blot o análisis DIGE 2D.
El objetivo general de este procedimiento es demostrar el fraccionamiento subcelular del tejido cerebral utilizando un gradiente discontinuo de sacarosa para enriquecer proteínas de las membranas sinápticas y las densidades postsinápticas. Esto se logra homogeneizando primero el tejido cerebral con un homogeneizador motorizado. A continuación, se presentan una serie de pasos de centrifugación para preparar extractos crudos de proteínas de membrana.
A continuación, los extractos de membrana se colocan en capas en un gradiente discontinuo de sacarosa para su ultracentrifugación. El paso final es recolectar las proteínas del gradiente. En última instancia, los resultados pueden mostrar cambios en los niveles de proteínas sinápticas a través del análisis de Western blot.
Esta es una técnica bien establecida que ha sido utilizada por los neurocientíficos durante más de 40 años. Lo usamos en nuestro laboratorio para comprender cómo cambia la composición proteica de la sinapsis cuando perturbamos diferentes sistemas de neurotransmisores. La principal ventaja de esta técnica sobre otros métodos, como los gradientes por llamada o los gradientes continuos de sacarosa, es que los gradientes discontinuos de sacarosa son más fáciles de construir a mano.
Este protocolo hace uso de un homogeneizador de teflón de vidrio accionado por motor, siempre reemplace el mortero entre muestras y enjuague y seque. En primer lugar, el homogeneizador carga el tejido disecado en un tubo de 13 mililitros con cuatro mililitros de solución de sacarosa tamponada HEPA 0,32 molar. A continuación, transfiera el tejido a un homogeneizador de vidrio limpio.
Ajuste el motor a 900 RPM y homogeneice la muestra con 12 golpes durante 30 segundos utilizando menos de cuatro gramos de tejido, asegure un buen fraccionamiento, transfiera la muestra de nuevo al tubo y almacene una alícuota de 100 microlitros a 80 grados centígrados negativos para el análisis de proteínas. A continuación, separe el material nuclear haciendo girar el homogeneizado a 900 G durante 10 minutos. A cuatro grados centígrados, transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de 15 mililitros.
El sobrenadante contiene la fracción bruta de la membrana. Ahora, para enriquecer para la centrífuga de sinaptosomas crudos, el sobrenadante a 10, 000 G durante 15 minutos a cuatro grados centígrados, elimine el sobrenadante. El pellet contiene la fracción cruda de sinaptosomas Resus.
Suspenderlo en un mililitro de solución de sacarosa 0,32 molar. Luego, a otros tres mililitros de solución a la centrífuga en suspensión, la fracción bruta durante 15 minutos A 10, 000 G a cuatro grados centígrados, retire el sobrenadante. Ahora pique rápidamente el pellet, vuelva a suspender el pellet en un mililitro de agua pura.
Luego agregue otros tres mililitros de agua rápidamente. Transfiera esto al homogeneizador. Aplique tres pasadas a mano y transfiéralo nuevamente al tubo de 13 mililitros.
Ajuste rápidamente la muestra a cuatro milimolares de HEAs con una adición de 16 microlitros de HEAs de un molar y mézclela por inversión. Ahora coloque la muestra en un rotador a cuatro grados centígrados durante media hora. Para asegurar la lisis de la muestra, finalice el fraccionamiento granulando la fracción de dos primos Lysed P.
Girar a 25.000 g durante 20 minutos a cuatro grados centígrados, retirar el sobrenadante, volver a suspender el pellet en un mililitro de solución de sacarosa. Contiene las membranas episomales sinapicas enriquecidas. En primer lugar, mida previamente los tampones para crear un gradiente discontinuo de sacarosa.
Cargue tres tubos de la siguiente manera, uno con exactamente 3,5 mililitros de solución de sacarosa tamponada de montones 1,2 molares. Otro con exactamente tres mililitros de solución 1,0 molar, y el tercero con tres mililitros de solución 0,8 molar. A continuación, con una pipeta de vidrio para plagas, transfiera la solución de sacarosa 1,2 molar a un tubo ultracentrífugo de polímero de 12 mililitros.
Con una pipeta nueva, coloque cuidadosamente la solución 1,0 molar sobre la solución 1,2 molar. No molar la solución 1,2 molar ni introducir burbujas con la pipeta. Utiliza la misma técnica para colocar la solución 0,8 molar en capas encima.
Ten precaución. Las pequeñas vibraciones de un vórtice de banco o una microcentrífuga son suficientes para perturbar la integridad del gradiente. Es importante construir los degradados de manera cuidadosa y eficiente.
Si tarda demasiado o si el gradiente está expuesto a vibraciones, no podrá recuperar las membranas sinápticas en los pasos posteriores. Ahora, con otra capa de pipeta pastor, la fracción de membrana episomal sinap enriquecida sobre el gradiente preparado. Equilibre con precisión el gradiente en una ultracentrífuga en un rotor de cucharón oscilante.
A continuación, gíralo a 150.000 g durante dos horas a cuatro grados centígrados. Tenga mucho cuidado al eliminar el gradiente del balde después de la centrifugación, debe haber bandas claras de solución de sacarosa. Con fracciones de proteína en cada interfaz y un pellet, las fracciones no deben ser difusas.
Con una aguja de calibre 18 y una jeringa de un mililitro, perfore la parte más baja de la interfaz molar hasta 1,2 y extraiga la banda blanca de proteína, que contiene las membranas plasmáticas sinápticas. Registra el volumen de esta capa. Transfiera la capa a un tubo ultracentrífugo de pared de 3,5 mililitros de grosor.
Añada exactamente 2,5 volúmenes de cuatro HEAs milimolares. A continuación, prepare un tubo equilibrador con una solución de sacarosa tamponada de HEAs 0,32 molares en un rotor de ángulo fijo, ultracentrífugo la muestra a 200.000 G durante 30 minutos a cuatro grados centígrados. A continuación, deseche el sen y vuelva a suspender la pastilla de membrana plasmática sináptica.
En 300 microlitros de 50 milimolares de HEAs dos milimolares de solución de EDTA. La fracción de densidad postsináptica o fracción PSD ahora se puede recolectar mediante el uso adicional de las mismas técnicas. Los pasos están claramente descritos en el protocolo de texto.
Se ejecutó un western blot con una proteína total, la membrana plasmática sináptica, y las primeras fracciones de proteínas de densidad postsináptica. La fracción PSD se sometió a un solo tratamiento con detergente, y el tejido procedía de cuerpo estriado de ratón. Las proteínas presinápticas, como el transportador de dopamina, se enriquecen en la fracción SPM, pero se eliminan en el paso posterior del detergente para el enriquecimiento de PSD.
Al intentar este procedimiento, es importante recordar mantener todas las muestras en hielo e incluir inhibidores de la proteasa y la fosfatasa después de este procedimiento. Se pueden realizar otros métodos, como el análisis de sangre occidental o la electroforesis en gel bidimensional. A continuación, puede responder a preguntas como cómo el tratamiento farmacológico afecta a los niveles de receptores en la sinapsis.
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Visión general
Este artículo detalla el enriquecimiento de proteínas asociadas con la membrana plasmática sináptica mediante ultracentrifugación en un gradiente discontinuo de sacarosa. El procedimiento demuestra el fraccionamiento subcelular del tejido cerebral para enriquecer proteínas de membranas sinápticas y densidades post-sinápticas.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología celular
- Análisis de proteínas
Antecedentes
- Comprender los niveles de proteínas sinápticas es crucial para la investigación en neurociencia.
- Las membranas sinápticas y las densidades post-sinápticas juegan roles clave en la comunicación neuronal.
- La ultracentrifugación es una técnica estándar para el enriquecimiento de proteínas.
- El Western blotting y el 2D DIGE son métodos comunes para el análisis de proteínas.
Propósito del estudio
- Enriquecer proteínas de las membranas sinápticas y densidades post-sinápticas.
- Preparar extractos de proteínas adecuados para análisis posteriores.
- Demostrar la efectividad de un gradiente discontinuo de sacarosa en el enriquecimiento de proteínas.
Métodos utilizados
- Homogeneización del tejido cerebral utilizando un homogeneizador motorizado.
- Serie de pasos de centrifugación para preparar extractos crudos de proteínas de membrana.
- Capas de extractos de membrana en un gradiente discontinuo de sacarosa.
- Ultracentrifugación para recolectar proteínas del gradiente.
Resultados principales
- Enriquecimiento exitoso de proteínas de la membrana plasmática sináptica.
- Preparación de proteínas de densidad post-sináptica para análisis.
- Los resultados pueden indicar cambios en los niveles de proteínas sinápticas.
- Apto para análisis de Western blot y 2D DIGE.
Conclusiones
- El método enriquece eficazmente proteínas de las membranas sinápticas.
- Proporciona una base para el estudio de la dinámica de proteínas sinápticas.
- Puede aplicarse a varias preguntas de investigación en neurociencia.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Synaptic protein quantification enables mechanistic de-risking in CNS target validation by linking molecular changes to functional phenotypes. This subcellular fractionation method supports predictive confidence in early discovery by isolating disease-relevant synaptic compartments. It provides a disease-relevant system for assessing target engagement and pathway modulation in preclinical models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through quantification of synaptic plasma membrane and postsynaptic density protein trafficking.
- Operational Value: Provides a standardized approach to isolate synaptic compartments for target de-risking.
- Predictive Value: Supports biomarker alignment by measuring changes in presynaptic and postsynaptic protein levels following pathway modulation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated synaptic protein fractions for use in phenotypic screening assays to evaluate compound effects on synaptic integrity.
- Operational Value: Generates reproducible, quantitative protein outputs suitable for assay standardization and high-content analysis.
- Scalability: The discontinuous sucrose gradient method allows batch processing of samples for consistent screening readiness.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Enables disease-relevant system modeling by isolating synaptic proteins from specific brain regions, such as striatum, to study neuropsychiatric targets.
- Operational Value: Supports translational biomarker development by providing quantifiable synaptic protein readouts correlated with functional outcomes.
- Risk Mitigation: Facilitates preclinical continuity by linking target modulation to measurable changes in synaptic protein composition.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification to preclinical validation by providing quantitative synaptic protein data.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by isolating synaptic compartments affected by neurotransmitter system perturbations.
- Screening: Enables assay readiness through production of enriched synaptic plasma membrane and PSD fractions suitable for Western blot or 2D DIGE analysis.
- Analytics: Delivers quantitative dependent variable measurements (protein band intensity) that allow comparison of synaptic protein levels across experimental conditions.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical continuity by enabling assessment of synaptic protein changes in disease models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for synaptic protein isolation across multiple CNS projects and target classes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through direct measurement of synaptic protein trafficking.
- Operational Value: Ensures reproducibility and standardization via a well-established discontinuous sucrose gradient protocol with defined centrifugation steps.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early, quantitative synaptic protein data that de-risks CNS target progression.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of CNS targets based on measurable effects on synaptic protein composition and synaptic function.
Implementation Considerations
- Requires expertise in subcellular fractionation, ultracentrifugation, and synaptic biology to ensure proper gradient formation and fraction collection.
- Dependent on access to ultracentrifuge with swinging bucket and fixed angle rotors, and capability to maintain samples at 4°C throughout processing.
- Necessitates cross-team standardization of gradient preparation, tissue homogenization, and protease/phosphatase inhibitor use to ensure reproducibility across sites.
- Requires adaptation considerations when applying to different brain regions or disease models due to variations in synaptic protein expression and tissue yield.
- Practical limitations include the need for fresh or properly stored tissue and careful handling to prevent gradient disruption from vibration or delays during setup.
