Fraccionamiento subcelular para el aislamiento de componentes sinápticos del cerebro murino

Las sinapsis son las unidades computacionales básicas del cerebro. El método presentado es una herramienta simple y valiosa para estudiar las sinapsis y sus procesos moleculares y también para comprender cómo podrían alterarse en diversos trastornos cerebrales. Esta técnica implica un fraccionamiento de estructuras sinaptosómicas aisladas del cerebro.

Esto permite al investigador capturar efectos que pueden estar compartimentados en la sinapsis. Los niveles de distribución y la actividad de proteínas específicas también se pueden analizar con resolución subsináptica. Este procedimiento toma alrededor de 11 horas para que un investigador individual lo complete si todo va bien.

Una persona que nunca ha realizado esta técnica puede tener dificultades con la duración de este procedimiento, ya que naturalmente tomará un poco más de tiempo para alguien que no está familiarizado con los pasos. Debido a la duración de este día experimental, recomendamos encarecidamente realizar las disecciones con un compañero que pueda ayudarlo a facilitar la recolección rápida de tejido para garantizar que no haya muestras en hielo durante más tiempo del necesario. También recomendamos preparar tampones y materiales de sobremesa el día anterior a ejecutar este experimento para que todo esté al alcance de la mano cuando sea necesario.

Esto es particularmente cierto para los tubos de recolección. Se recogerán múltiples alícuotas de un total de 11 fracciones subcelulares al final de este procedimiento. Por lo tanto, tener estos tubos claramente etiquetados con anticipación hará que su día sea mucho más fácil.

Para comenzar, inserte tijeras finas debajo de la piel en la incisión de decapitación a una profundidad pericraneal y haga una incisión sagital media hasta la sutura intranasal para retraer el cuero cabelludo del cráneo. Trabajando desde el área occipital hacia cada aspecto temporal, recorte la fascia y el músculo para exponer la superficie externa del cráneo más allá de cada meato acústico externo. Asegure el cuero cabelludo y la cara rostral del cráneo con la mano no dominante y con la otra mano, inserte tijeras finas dos milímetros en el lado caudal del foramen magnum donde la médula espinal es visible saliendo.

Haga una incisión en la línea media hasta que las tijeras lleguen a la superficie interna del hueso intraparietal. Cambie el ángulo de las tijeras para que las cuchillas corran paralelas a la superficie dorsal del cráneo. Continúe avanzando la incisión sagital media rostralmente a través de los huesos parietal y frontal utilizando las suturas sagital e interfrontal como guía y termine la incisión justo más allá de la sutura internasal.

A continuación, haga una incisión perpendicular de tres milímetros al hueso nasal, rostral a la sutura internasal, colocando las tijeras perpendiculares al cráneo con cada cuchilla colocada en una sutura premaxilar nasal y haciendo un corte uniforme. Mientras asegura el aspecto rostral, use un lado de un par de pinzas texturizadas para levantar suavemente el cráneo desde el cerebro y luego levantarlo lateral y ventralmente. Repita a lo largo de la línea media según sea necesario, luego para el otro hemisferio hasta que toda la superficie del cerebro esté expuesta.

Usando fórceps curvos o una espátula fina, levante suavemente el lado rostral del cerebro. Cortar los nervios óptico y craneal para completar la escisión del cráneo. Homogeneice los cerebros usando un homogeneizador de plumones de vidrio colocado en un baño de hielo en 12 pases hacia arriba a 500 rpm.

Haga una breve pausa en cada carrera descendente para asegurar una homogeneización completa del tejido. Transfiera el homogeneizado cerebral total a un tubo de centrífuga de fondo redondo de alta velocidad de 14 mililitros y gírelo a 800 G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados para obtener el sobrenadante denominado S1. Tomar dos alícuotas de cinco microlitros de S1 para el ensayo de ácido bicinchonínico y dos alícuotas de 100 microlitros de S1 para el western blot.

Girar S1 a 9, 000 G durante 15 minutos a cuatro grados centígrados para obtener el sobrenadante somal sináptico, o S2, y el pellet sinaptosómico crudo o P2. Tomar dos alícuotas de 10 microlitros de S2 para el ensayo de ácido bicinchonínico y dos alícuotas de 500 microlitros de S2 para el western blot. Desechar el sobrenadante después de obtener las alícuotas. después de centrifugar a 9, 000 G durante 15 minutos a cuatro grados centígrados, obtener el sobrenadante S2' y lavar el sinaptosoma, P2'Desechar el sobrenadante y resuspender P2' en tres mililitros de tampón A.Evite resuspender la porción de color rojo oscuro en el fondo del pellet, que contiene principalmente mitocondrias.

Tomar dos alícuotas de 20 microlitros de P2' para el ensayo de ácido bicinchonínico y dos alícuotas de 100 microlitros de P2' para el western blot. Para la lisis hipotónica del sinaptosoma lavado, agregue nueve volúmenes de tampón B refrigerado para resuspender P2' y homogeneizar el sinaptosoma en un homogeneizador de vidrio hacia abajo. Transfiera las muestras a tubos de centrífuga cónica tapados de 50 mililitros y gírelos en un revólver de tubo en una cámara frigorífica de cuatro grados centígrados durante 15 minutos.

Centrifugar el lisado P2'at 25, 000 G durante 20 minutos a cuatro grados centígrados para obtener el sobrenadante de lisis o LS1, y el pellet de lisis que contiene membranas sinaptosómicas, o LP1. Tomar dos alícuotas de 50 microlitros de LS1 para el ensayo de ácido bicinchonínico y dos alícuotas de 400 microlitros de LS1 para el western blot. Transfiera LS1 a un tubo de centrífuga tapado para ultra centrifugación.

Centrífuga LS1 en un rotor de ultracentrífuga de ángulo fijo a 100, 000 G durante 60 minutos a cuatro grados centígrados para obtener sobrenadante de citosol sináptico, o LS2, y pellet de vesícula sináptica, o LP2. Resuspender LP2 en 500 microlitros de tampón A y utilizando una aguja calibre 23 y una jeringa de un mililitro LP transparente dos con trituración suave. Tomar dos alícuotas de 10 microlitros de LP2 para el ensayo de ácido bicinchonínico y dos alícuotas de 250 microlitros de LP2 para el western blot.

Transfiera alrededor de 30 mililitros de LS2 a unidades de filtro centrífugas con un corte de 10 miliDalton y concentre el LS2 a aproximadamente 0.5 mililitros girando a 5, 000 G durante hasta una hora a cuatro grados centígrados. Tomar dos alícuotas de 10 microlitros de LS2 concentrado para el ensayo bicinchonínico, y dos alícuotas de 250 microlitros de LS2 concentrado para el western blot. Resuspender LP1 en un mililitro de tampón B, y tomar dos, 10 alícuotas microlitros de LP1 para el ensayo de ácido bicinchonínico y dos alícuotas de 50 microlitros de LP1 para el western blot.

Ajuste el LP1 restante a un volumen final de 7,5 mililitros y una concentración final de sacarosa de 1,1 molares con tampón B y tampón C.Luego transfiera 7,5 mililitros del LP1 resuspendido a un tubo de ultracentrífuga de 14 mililitros. Superponga cuidadosamente el LP1 con 3,75 mililitros de tampón D y marque la parte superior de la solución con una pluma. Luego superponga con alrededor de 1.25 mililitros de tampón A. Y marque de manera similar la parte superior de la solución con una pluma.

Equilibre los tubos para la ultracentrifugación por peso, no por volumen, con la adición gota a gota del tampón A dentro de los 10 miligramos. Centrifugar a 48.000 G durante 2,5 horas a cuatro grados centígrados en un rotor ultracentrífugo de cucharón oscilante y adquirir imágenes de los gradientes intactos para documentar la distinción de cada interfaz de sacarosa y el éxito del fraccionamiento. Retire con cuidado la capa superficial de sacarosa de 320 milimolares y recupere la fracción de mielina en la interfaz de sacarosa de 320 milimolares y 855 milimolares en un volumen de 800 microlitros.

Pipetear hacia arriba desde la pared de los tubos de manera circular para asegurarse de que se recoge la fracción completa. Luego recupere la fracción SPM en la interfaz de sacarosa de 855 milimolares y 1.1 milimolares en un volumen de 1000 microlitros. Aspirar cuidadosamente la sacarosa restante y recuperar el pellet mitocondrial resuspendiendo en 200 microlitros de tampón B.Diluir la fracción SPM con dos volúmenes de tampón B, y luego centrifugar en un rotor de ángulo fijo en un tubo de centrífuga de 3,5 mililitros.

Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet SPM en el tampón A para obtener un volumen final de 250 microlitros. Tome dos alícuotas de cinco microlitros de SPM para el ensayo de ácido bicinchonínico y divida el SPM restante por la mitad para el western blot. Las imágenes de microscopía electrónica del sinaptosoma se muestran en esta figura.

Aquí se muestra un sinaptosoma que contiene vesículas sinápticas tanto componentes pre y post sinápticos como vesículas sinápticas en una mitocondria. Se realizó un análisis de inmunotransferencia de fracciones subcelulares para evaluar los marcadores de pureza de la fracción. Cuando se comparó con el homogeneizado inicial de todo el cerebro, el análisis reveló el enriquecimiento de n-cadherina en la fracción de la membrana plasmática sináptica, alfa sinucleína en el citosol sináptico, sinaptofisina en la fracción de vesículas sinápticas y proteína básica de mielina en la fracción de mielina.

Una vez que se ha establecido la pureza de la fracción, se puede utilizar la inmunotransferencia cuantitativa para determinar la localización de proteínas de interés, o consultar diferencias en la distribución de proteínas entre genotipos o tratamientos. Al intentar este procedimiento, asegúrese de usar cristalería sin detergente para que se pueda recolectar el sinaptosoma intacto. Además, tenga cuidado al preparar gradientes de sacarosa para asegurarse de obtener interfaces claras.

Esto le permitirá aislar con éxito la fracción de la membrana plasmática sináptica. Se pueden realizar varios análisis estructurales y funcionales para ayudar a la calidad de las fracciones sinápticas, como la microscopía electrónica, la inmunotransferencia, la proteómica y otros métodos moleculares. La liberación de neurotransmisores o ensayos enzimáticos también se pueden realizar para ayudar a la viabilidad metabólica del sinaptosoma.

El aislamiento de las estructuras sinaptosómicas fue una técnica de cambio de paradigma para el análisis de la función y composición de la sinapsis. Como vemos la disfunción sináptica temprana en la neurodegeneración, la disección cuidadosa de los cambios moleculares a nivel de sinapsis nos ayudará a explorar los mecanismos moleculares de estos trastornos.