Preparación de Synaptoneurosomes de ratón con una corteza discontinua de Percoll-sacarosa gradiente de densidad

El objetivo general de este procedimiento es preparar sinaps traduccionalmente activa a las zonas neuronales de la corteza cerebral del ratón, utilizando un gradiente de densidad de sacarosa peral discontinuo. Esto se logra primero recolectando y homogeneizando las cortezas del ratón, y luego centrifugando el homogeneizado. A continuación, aplique el homogeneizado de centrífuga o el supnatante a los gradientes de sacarosa preport per co.

El paso final es centrifugar y recoger la fracción de sinaptosoma. En última instancia, el análisis de Western blot y los experimentos de incorporación de metionina S 35 muestran que la fracción de sinaptosomas está enriquecida sinápticamente y es traduccionalmente activa. Las principales ventajas de esta técnica sobre los métodos existentes como la centrifugación y la filtración, nuestro primer daño mecánico se evita mediante la utilización de gradientes de densidad, y el segundo por llamada tiene baja toxicidad hacia las células en sus constituyentes.

Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades con este protocolo porque el tiempo juega un papel clave. Una vez que se han recolectado las cortis, el procedimiento debe completarse rápidamente. Para comenzar el procedimiento, prepare las capas de gradiente de 3, 10, 15 y 23% agregando las cantidades respectivas de SIP como se describe en el manuscrito adjunto al tampón GM y mezcle bien.

Vierta las capas de gradiente pipeteando dos mililitros de cada una de las soluciones de perol isosmótico al 23 15, 10 y 3 % en los tubos de centrífuga Beckman con tapones. Con una pipeta P 1000, la interfaz entre las capas debe ser claramente discernible sin que se mezclen las capas. Guarde los gradientes de cuatro grados centígrados durante al menos 20 minutos antes de usar.

Antes de comenzar este procedimiento, prepare otras soluciones necesarias como se describe en el manuscrito adjunto. Sacrificar al ratón entre los 13 y los 21 años y prepararlo para la disección rociando la nuca y la cabeza con etanol al 70%. Luego, use un par de tijeras afiladas para cortar la médula espinal en la base del cráneo.

A continuación, retira la piel de la parte superior del cráneo. Corta el cráneo lateralmente entre el hueso parietal y el hueso interparietal, o entre las regiones del cerebro y la corteza. Después de eso, corta el cráneo desde la base hasta la nariz a lo largo de la sutura sagital.

En este paso, retire con cuidado el hueso parietal blando tirando de cada hemisferio hacia un lado. Después de eso, inserte la espátula en el cerebro por encima del cerebelo para sacar la corteza. Colóquelo en un tampón transgénico helado y repita los procedimientos nuevamente para recolectar más cortezas.

Ahora enjuague las cortezas con tampón GM helado. A continuación, transfiera dos cortezas a un homogeneizador de vidrio que contenga cinco mililitros de tampón transgénico frío. Homogeneice suavemente las cortezas con cinco a 10 golpes de mortero A, el mortero suelto, seguido de cinco a 10 golpes de mortero B, el tipo de mortero.

El número de carreras varía en función del homogeneizador individual. Transfiera el homogeneizado a un tubo cónico de 15 mililitros. Centrifugarlo 1000 veces.

Gravedad durante 10 minutos a cuatro grados centígrados en una centrífuga Allegra Six KR para pellet restos y núcleos celulares. Superponga dos mililitros de supinato por cada gradiente de sacarosa con un gradiente por cada corteza entera y tape los tubos. A continuación, centrífugalos en un rotor de ángulo fijo a 32.500 veces la gravedad durante cinco minutos a cuatro grados centígrados en una centrífuga Beckman J 2 21.

Usando los adaptadores apropiados una vez completado, el gradiente debe dar una pipeta de banda SN fuerte y desechar la solución por encima de la banda SN. Usando una pipeta de pasta de vidrio pipetas fuera de la banda SN en la interfaz del 15 al 23%, un gradiente generalmente da alrededor de 0,9 a 1,1 mililitros de SNS. Después de eso, transfiéralo a un tubo cónico y guárdelo en hielo.

A continuación, ajuste la concentración de sal del SNS añadiendo un décimo volumen de 10 veces el tampón de estimulación. Opcionalmente añadir 1000 veces cloruro de calcio para dar una concentración final de 12 ano molar. A continuación, agregue un material TTX milimolar para dar una concentración final de un micromolar para suprimir la excitación inespecífica.

El siguiente paso es utilizar el SNS en la aplicación posterior aplicable, como los estudios de traducción de proteínas. Para otras aplicaciones, el lisado de SN se puede limpiar o concentrar utilizando el kit de preparación de muestras de página Pierce SDS. La concentración de proteínas del SNS se puede determinar utilizando el kit de ensayo de proteínas micro BCA.

Este es un ejemplo de seis bandas o fracciones. Cuando la corteza del ratón se homogeneizó y se separó en gradientes discontinuos de perol sacarosa, los SNS enriquecidos se contuvieron en la banda cinco en la interfaz del 23 al 15%, esta banda se eliminó y se examinó mediante microscopía electrónica. Un ejemplo de vesículas sinápticas intactas y la preservación de elementos presinápticos y postsinápticos se muestran aquí en el Western blot.

Se muestra un aumento de los marcadores sinápticos y una disminución de las impurezas en la banda SN a partir de un gradiente discontinuo por sacarosa para confirmar que el aumento en la incorporación de metionina S 35 tras la adición de glutamato se debe a la síntesis de proteínas de novo. Se añadieron 40 micromolares de anesa micina, un inhibidor de la síntesis de proteínas. Esta figura muestra la marcada disminución en la incorporación de metionina S 35 en presencia de ansomicina con o sin glutamato presente en comparación con los niveles basales.

Por lo tanto, los gradientes perales discontinuos de sacarosa producen rápidamente SNS altamente activos y relativamente puros que se pueden utilizar para estudiar la traducción de proteínas. Esta figura muestra que la banda cinco del gradiente discontinuo de sacarosa por núcleo contiene los niveles más altos de síntesis de proteínas de novo. El SNS preparado haciendo pasar la corteza homogeneizada a través de una serie de filtros con un tamaño de poro decreciente y luego centrifugando sobre un gradiente de sacarosa discontinuo por núcleo para comparar, contiene más membranas rotas y menos SNS enteros que el SNS preparado con el método de gradiente de sacarosa perol discontinuo, se muestra que los SNS preparados con el método de gradiente de sacarosa peral discontinuo contienen más actividad de síntesis de proteínas de novo que el SNS preparado usando el método de filtración.

Se ha demostrado que los SNS preparados a partir de ratones más jóvenes tienen una mayor actividad traslacional que los ratones más viejos. Después de ver este video, debería tener una buena idea de cómo aislar las zonas neuronales sinápticas traduccionalmente activas homogeneizando las cortezas de ratón, centrifugando el homogeneizado en un rotor de cubo oscilante, centrifugando el sobrenadante sobre un gradiente de sacarosa por llamada en un rotor de ángulo fijo y luego recolectando la banda de la zona neuro sináptica resultante.