Utilizando metodologías combinadas para definir el papel de la membrana plasmática de entrega Durante Axon ramas y morfogénesis neuronal

El objetivo general de este procedimiento es realizar observaciones cuantificables de la ocurrencia temporal y espacial de la fusión de vesículas exocíticas neuronales y la ramificación axonal. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurociencia, como cuándo y dónde la fusión de vesículas inserta material de membrana en la membrana plasmática en expansión durante el desarrollo neuronal. La principal ventaja de esta técnica es que combina imágenes de células vivas para obtener alta resolución espacial y temporal en células individuales, junto con enfoques bioquímicos para obtener información basada en poblaciones.

Después de cultivar y simular neuronas corticales con Netrin-1 o un control según el texto del protocolo. Aspire el PBS del primer pocillo de una condición y reemplace con 250 microlitros de tampón de homogenización. Incube en hielo durante cinco minutos y luego, utilizando un lifter celular, homogenice las células en hielo.

Aspire el PBS del siguiente pocillo de la misma condición y agregue la mezcla recién homogenizada al pocillo para aumentar las concentraciones de proteína. A continuación, transfiera la solución homogenizada a un tubo microcentrífugo de 1,6 mililitros previamente enfriado sobre hielo y agregue Tritón X-100 al 20% para alcanzar una concentración final del 1%. Luego, con una pipeta de 1.000 microlitros, pase la mezcla diez veces para triturarla, minimizando la formación de burbujas. Incube los tubos sobre hielo durante dos minutos para solubilizar las proteínas.

Luego, centrifugue a 6.010 RCF a 4 grados Celsius durante 10 minutos para obtener el sedimento del material no solubilizado. Transfiera el sobrenadante líquido a un nuevo tubo de 1,6 mililitros enfriado sobre hielo. A continuación, utilice el ensayo de Bradford para determinar la concentración de proteína.

Luego, utilice tampón de homogenización con 1 % de Triton X-100 y tampón de muestra 5X suplementado con BME para diluir las muestras hasta una concentración final de 3-5 miligramos por mililitro. Divida cada muestra experimental por igual en dos tubos. A continuación, incube una muestra a 37 grados Celsius durante 30 minutos y la otra a 100 grados Celsius durante 30 minutos.

Invierta los tubos intermitentemente para mantener las muestras en solución. Luego realice electroforesis SDS-PAGE y transferencia Western blot según el protocolo descrito en el texto. Después de configurar el microscopio TIRF y la muestra, y encontrar un plano focal neuronal según el protocolo descrito en el texto.

Inicie el software del láser y conéctese al software de control del láser. Configure la iluminación en campo amplio y seleccione el objetivo. Luego, establezca el índice de refracción de la muestra y ajuste la intensidad del láser desactivando TTL para el láser de 491.

La optimización de los parámetros de imagen es importante durante la adquisición de imágenes de vesículas exocíticas con el piso intacto para evitar la deriva del enfoque y la fototoxicidad, a la vez que se producen imágenes con una relación señal-ruido suficientemente alta para su análisis. Ajuste el control deslizante a 100 y luego regresarlo a un valor entre 20 y 40. A continuación, verifique nuevamente el TTL.

A continuación, enfoque nuevamente la muestra con iluminación de luz transmitida. Luego, en el software de imagen, seleccione la iluminación con láser de 491 y abra el obturador. Coloque el condensador boca abajo sobre el banco óptico para no rayar la lente.

Ajuste finamente el punto focal del láser en el techo y, con el condensador retirado, centre el punto en el centro del diafragma de campo cerrado. Luego, vuelva a colocar el condensador y en el software de TIRF establezca la profundidad de penetración en 110 nanómetros. A continuación, cambie del modo de iluminación de campo amplio al modo de iluminación TIRF para la adquisición de imágenes.

Ahora, utilizando epifluorescencia de campo amplio, localice células que expresan VAMP2 fluorescente a través de los oculares. Luego, para reducir el fotoblanqueo y la fototoxicidad, ajuste los parámetros de adquisición de imágenes para maximizar la relación señal-ruido y el rango dinámico empleando el tiempo de exposición y la intensidad del láser mínimos necesarios. Establezca el enfoque automático continuo por célula.

Luego, adquiera un conjunto de imágenes de lapso de tiempo con una adquisición cada 0,5 segundos durante cinco minutos. Para la condición estimulada con Netrin-1 en una campana de flujo laminar, agregue Netrin-1 hasta una concentración final de 500 nanogramos por mililitro a un cultivo de células y devuelva el cultivo al incubador durante una hora antes de la adquisición de imágenes. Para cuantificar la frecuencia de eventos exocíticos normalizados por área celular y tiempo.

En ImageJ, abra las pilas de imágenes arrastrando el archivo a la ventana o seleccionando Archivo, Abrir, nombre del archivo. Para eliminar las señales fluorescentes estables que no representan eventos de fusión de vesículas, utilice Imagen, Pila, Proyección Z, tipo de proyección Intensidad promedio. Para crear una proyección Z promedio de toda la pila.

Reste la imagen media resultante a cada imagen de la serie temporal utilizando Procesar, Calculadora de imágenes, Imagen 1 su pila, Operación Restar imagen dos. Resultando en una nueva proyección Z. Esto resaltará los eventos exocíticos.

Ahora, a simple vista, cuente los eventos de fusión exocítica, que pueden identificarse como manchas de señales fluorescentes limitadas por difracción que se difunden rápidamente cuando el fluorocromo VAMP2 se difunde dentro de la membrana plasmática. Resalte la primera imagen con Imagen, Ajustar, Umbral, y ajuste el control deslizante hasta que toda la célula quede resaltada por umbral. Luego, en Analizar, elija Establecer mediciones y marque área y mostrar etiqueta.

Con la herramienta de trazado de puntero, establezca el área celular umbralizada y presione M para medir. Transfiera los datos recopilados a una hoja de cálculo según el protocolo descrito en el texto. A las dos días in vitro, coloque el platillo de imagen con fondo de vidrio que contiene neuronas no transfectadas en una cámara ambiental húmeda previamente calentada.

Utilice un microscopio equipado con un objetivo DIC plan apocromático de seis DX, 1,4 NA y un condensador de alta apertura numérica para obtener la mejor calidad de imagen y resolución. A continuación, con iluminación de luz transmitida, ajuste el plano focal para localizar neuronas mediante los oculares. Para la obtención de imágenes DIC del ramificado axonal, la configuración adecuada de la iluminación fría será fundamental para la optimización de la imagen y es crítica para producir resultados analizables.

Luego, con las neuronas de interés dentro del campo de visión, utilice la función de adquisición de múltiples áreas en el software de imagen para localizar y guardar las posiciones XYZ de al menos seis células. A continuación, agregue una concentración final de 250 nanogramos por mililitro de Netrin-1 u otro factor de interés para estimular las células y presione iniciar adquisición de múltiples áreas. Adquiera secuencialmente imágenes en cada posición cada 20 segundos durante 24 horas.

Detener la adquisición y volver a enfocar según sea necesario. Dentro del software de imagen, revise las imágenes seleccionando Aplicaciones, Revisar Datos Multidimensionales y abra el archivo deseado. Identifique ramas axonales estables que se formaron durante la sesión de imagen.

Utilice la herramienta de región de trazado para medir una rama axonal estable desde la base del axón hasta su extremo. Después de tratar las neuronas con netrina y toxina botulínica, fijarlas y realizar la inmunotinción, e inmunotinción para beta-3 tubulina y actina según el protocolo descrito en el texto. Utilice un microscopio invertido para obtener imágenes de epifluorescencia de campo amplio.

Abra una pila de imágenes en ImageJ y, para analizar manualmente la ramificación, utilice la herramienta de línea, línea segmentada y trace el axón, definido como la neurita más larga que se extiende desde el soma. Con Analizar, Herramientas, Administrador de ROI, guarde el trazado del axón como una región de interés. Luego trace y guarde cada rama del axón, definida como una neurita de longitud mayor o igual a 20 micrómetros.

Incluya solo las ramas primarias en el análisis. Se muestra aquí una transferencia Western tras la finalización del ensayo de complejo SNARE resistente a SDS. Revelado para SNAP25, Syntaxin 1A y VAMP2.

Proteínas SNARE en complejo, se muestran aquí los monómeros identificables. Aquí se muestra un ejemplo de un evento exocítico mediado por VAMP2 con fluorescencia que ocurre a lo largo del tiempo en una neurona cortical. Los recuadros ampliados indican el soma, una rama axonal y un cono de crecimiento axonal, mostrando la utilidad espacial de este ensayo.

Los círculos indican eventos individuales de fusión exocitótica, que pueden observarse mediante microscopía de fluorescencia por reflexión total (TIRF). Esta imagen en tiempo real con contraste de interferencia diferencial (DIC) muestra la formación estimulada por Netrina de una rama axonal en tiempo real. Estas ubicaciones indican la protrusión inicial desde un sitio de ramificación.

Estas representan ramas estables completamente formadas de al menos 20 micrómetros, medidas desde el axón principal hasta el extremo de la rama. En este experimento, neuronas corticales a 3 DIV fueron tratadas con Netrina-1, que estimula la ramificación, o con toxina botulínica tipo A, que escinde SNAP25, un componente del complejo SNARE y bloquea la exocitosis. Los resultados demuestran que la exocitosis mediada por el complejo SNARE es necesaria para la ramificación dependiente de Netrina.

Una vez dominada, la microscopía DIC puede completarse en una sola sesión de imagenología nocturna. La microscopía TIRF de eventos exocíticos individuales puede realizarse en 4-5 horas. El protocolo de bioquímica para la formación del complejo SNARE puede llevarse a cabo en dos horas.

Al intentar estos procedimientos, es importante recordar mantener un ritmo adecuado y no apresurar ningún paso en particular. Cada procedimiento requiere atención y paciencia para obtener los mejores resultados. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la cotransfección de componentes de vesículas marcados con cargas candidatas marcadas, para responder preguntas adicionales.

¿Por ejemplo, cuál es la carga de las vesículas exocíticas? Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la neurociencia exploraran la neuritogénesis, la ramificación axonal y otras etapas de la morfogénesis en cualquier cultivo neuronal disociado. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo observar y cuantificar la naturaleza espacial y temporal de los eventos de fusión de vesículas exocíticas neuronales correspondientes a los cambios en la morfogénesis neuronal.

No olvide que trabajar con toxina botulínica o láseres de alta potencia puede ser extremadamente peligroso, y siempre se deben tomar precauciones, como usar prendas de seguridad adecuadas y utilizar el mecanismo de bloqueo de seguridad del microscopio, al realizar este procedimiento.