Name: Utilizando metodologías combinadas para definir el papel de la membrana plasmática de entrega Durante Axon ramas y morfogénesis neuronal (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-03-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 28 s
Description: Aprende a combinar microscopía de fluorescencia y ensayos bioquímicos para estudiar la exocitosis mediada por SNARE en la ramificación axonal dependiente de netrina. Este método permite observar la fusión vesicular en tiempo real.

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Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud: SR1-GM108970 (SLG) y F31-NS087837 (CW).

Declaración de ética de la investigación: Todos los experimentos con animales que se detallan en este documento están sujetos a las reglas y regulaciones del Comité de Cuidado de Animales UNC y con las normas del NIH para el cuidado y uso de animales de laboratorio. 1. Preparación y revestimiento del disociada de las neuronas corticales <ol><li> La eutanasia a las mujeres embarazadas oportunas por inhalación de CO 2 seguido por dislocación cervical. Retire todo el cerebro de los cráneos de embriones día 15.5 (E15.5) ratones y microdissect cortezas de cada hemisferio. Para obtener instrucciones detalladas relativas a la microdisección de la corteza de embriones de ratón consulte Viesselmann et al 8. </li><li> Colocar no más de 4 cortezas en 1 ml de medio de disección estéril en un microtubo de 1,6 ml. Añadir 120 l de 10x tripsina y se invierte el tubo de 3 - 5 veces para mezclar. </li><li> El uso de un hemocitómetro, contar las células para sembrar placas de cultivo celular. Nota: 1 hemisferio cortical proporciona aproximately tres millones de células. <ol><li> Para el ensayo de la bioquímica complejo SNARE SDS-resistente, placa de seis millones de células por placa de 35 mm y utilizar dos platos por condición. Nota: Esto se simplifica mediante el uso de placas de 6 pocillos al comparar varias condiciones. </li><li> Para los ensayos de ramificación, las neuronas de placas en ácido nítrico lavaron los cubreobjetos circulares a una densidad de 250.000 células por placa de 35 mm, por DIC imágenes de axón de ramificación placa a una densidad de 150.000. Estas densidades de evitar el hacinamiento y simplificar el análisis. </li></ol></li><li> Para la microscopía TIRF vivo de células, volver a suspender dos millones de neuronas por transfección en nucleofection solución a temperatura ambiente. <ol><li> Añadir 100 l de suspensión celular a microtubo que contiene 10 g de VAMP2-pHlourin plásmido de expresión y electroporación con un nucleofector acuerdo con el protocolo del fabricante 9. </li><li> Después de transfecciones añadir inmediatamente 500 l de tripsina temple medios, anular la suspensión de células cubetas y placas en una cuevasidad de 400.000 células por 35 mm de vidrio recubierta con PDL plato inferior. </li></ol></li><li> Plate todas las neuronas corticales en 2 ml de medio libre de suero. </li></ol> 2. SNARE Ensayo de Formación de complejos Nota: los complejos SNARE SDS-resistentes fueron procesados ​​y analizados como se describe originalmente 10 con las modificaciones que se detallan a continuación. Para los anticuerpos validados alternativos a los que se usan aquí, consulte la sección de materiales. <ol><li> Estimular las neuronas corticales E15.5 2 días in vitro (DIV) con 250 netrina-1 o simulada de control ng / ml durante 1 hora antes de la lisis. </li><li> Antes de procesamiento de muestras, centrífuga fría a 4 ° C, y ajuste la temperatura del baño de agua a 37 ° C, y el bloque de calor a 100 ° C. </li><li> Sacar los recipientes de células de la incubadora y colocar en hielo. <ol><li> Aspirar los medios de comunicación a partir de células, reemplazan solución salina tamponada con ~ 2 ml de hielo frío de fosfato (PBS) suavemente 2 veces para 1 - 2 min por lavado. </li><li> Para este ensayo, utilizar 2 pocillos por condition. </li><li> Aspirar PBS desde el primer pocillo de una condición y reemplazar con 250 l tampón de homogeneización. Deja en hielo durante 5 min, y a continuación, utilizando un elevador de células, homogeneizar las células en hielo. </li><li> Aspirar el PBS del siguiente pozo de la misma condición y añadir la mezcla homogeneizada recientemente al pozo. Esto aumentará las concentraciones de proteína. Repita este procedimiento para todas las condiciones. </li><li> Al finalizar, la pipeta solución a un pre-enfriado 1,6 ml microtubo homogeneizó en hielo y añadir 20% Triton X-100 para llegar a una concentración final de 1% Triton X-100. Se tritura la mezcla 10 veces con una pipeta 1.000 l minimizando al mismo tiempo las burbujas. </li></ol></li><li> Incubar los tubos en hielo durante 2 min para solubilizar proteínas. Después de la incubación, se centrifuga durante 10 min a 6010 RCF a 4 ° C para sedimentar el material no solubilizado. Mueva sobrenadante lisado en un nuevo tubo de 1,6 ml enfriado en hielo. </li><li> Realizar un análisis de la concentración de proteína usando el ensayo de Bradford 11 y diluir las muestras a una final concentración de proteína de 3-5 mg / ml con tampón de homogeneización suplementado con 1% Triton X-100 y 5x tampón de muestra suplementado con B-Mercaptethanol (BME) restante. </li><li> Divide cada muestra experimental uniformemente en 2 tubos. Incubar una muestra a 37 ° C durante 30 min (complejos SNARE), y el otro a 100 ° C durante 30 min (monómeros SNARE). Invertir los tubos de forma intermitente para mantener las muestras en solución. </li><li> Congelar las muestras a -20 ° C hasta el momento de separar por medio de SDS-PAGE. Antes de ejecutar muestras mediante electroforesis usando técnicas estándar, re-ebullición muestras previamente hervida durante 5 minutos a 100 ° C, pero descongelar 37 ° C las muestras a temperatura ambiente. </li><li> duplicados serie de muestras (30 - 40 g de proteína por muestra) tanto en un 8% y un 15% en gel; el 8% proporciona la separación ideal del complejo, mientras que el 15% se utiliza para cuantificar monómeros de proteínas SNARE (SNAP-25 ~ 25 kDa, VAMP2 ~ 18kDa, sintaxina-1 ~ 35 kDa). Mantener la fuente de alimentación a 70 V hasta que la línea de tinte es a través del STACgel de rey y aumento de tensión a 90V. Correr geles hasta que el colorante se escapa. </li><li> Para preservar monómeros, transferir las proteínas a 0,2 micras membrana de nitrocelulosa en hielo usando tampón de transferencia en frío con 20% de metanol (MeOH) añadido, a 70 V durante 45 min. </li><li> membrana seca en un recipiente cubierto durante 2 horas a O / N a TA (O / N proporciona los mejores resultados). </li><li> Bloquear SNARE membranas complejos en 10% albúmina de suero bovino (BSA) durante 1 hora a RT. </li><li> Preparar anticuerpos primarios (que reconocen componentes específicos complejos SNARE) a una dilución de 1: 1000 y la sonda de O / N a 4 ° C en un agitador rotatorio. <ol><li> Enjuague borrones en Tris Buffered Saline más 0,1% de Tween-20 (TBS-T) 3 veces durante 5 min cada uno. </li></ol></li><li> Preparar soluciones de anticuerpos secundarios fluorescentes a una dilución de 1: 20.000 en 1% de BSA en TBS-T y la sonda para 1 hr, cubierto a TA. Repita el paso 2.12.1 Después de 1 hora. </li><li> Las transferencias de imagen en una máquina de escaneo fluorescente equipados con la suite de software y cuantificar tanto la co proteínas SNAREmplex (bandas inmunorreactivas por encima de 40 kDa) y bandas de monómero (bandas inmunorreactivas a 25 kDa, 18 kDa, 35 kDa para la SNAP-25, VAMP2 y sintaxina-1, respectivamente) utilizando las instrucciones del fabricante para la elaboración de ROI rectangular. </li></ol> 3. Imaging exocytic eventos mediante microscopía TIRF Nota: Este protocolo requiere un equipo de microscopía especializado incluyendo una cámara ambiental para mantener la temperatura, la humedad y CO 2, un microscopio TIRF invertido equipado con una iluminación epifluorescente, una gran ampliación / alta apertura numérica (NA) objetivo TIRF, una etapa XYZ automatizado, y un detector sensible dispositivo de carga acoplada (CCD). Este protocolo utiliza un microscopio invertido totalmente automatizado equipado con un objetivo de un sólido de estado 491 nm láser 100x 1.49NA TIRF y un CCD multiplicador de electrones (EM-CCD). Todo el equipo es controlado por un software de imagen y control del láser. Antes del comienzo del poder protocolo de formación de imágenes en el medio amben materia de medio de cámara, el escenario, la lámpara, el ordenador y la cámara. <ol><li> Elija un objetivo en el software de imágenes. Una vez que el objetivo está en su lugar, fijar el calentador objetivo alrededor del collar. </li><li> Confirmar que el objetivo es bajado por completo antes de asegurar la incubadora etapa en la ranura etapa. Vierta agua destilada en las entradas de la etapa de la incubadora de manera uniforme para evitar derrames. </li><li> Encienda el sistema de incubación. Abrir la válvula al depósito de CO 2 y confirme la presión es adecuado para el sistema según las instrucciones del fabricante. Permitir cámara de un cierto tiempo para alcanzar el 5% de CO2 y 37 ° C. Antes de añadir el plato de imagen, coloque un plato vacío en la incubadora para evitar la condensación de agua en el objetivo. </li><li> Energía de la fuente de láser. </li><li> incubadora de carga abierta y añadir aceite de inmersión de la lente. Coloque la muestra en la incubadora y estabilizar con los brazos de estabilidad o un peso plato. Elevar el objetivo hasta que el aceite se pone en contacto con la parte inferior de la muestra. switch de iluminación de luz transmitida y encontrar plano focal neuronal a través de los oculares. </li><li> Iniciar el software de láser y conectar con el software de control de láser. iluminación de campo amplio y seleccionar el objetivo que se usa set (100X 1.49 NA TIRF se recomienda). Cambiar el índice de refracción de la muestra (células ~ 1,38). Ajustar la intensidad del láser desmarcando &quot;TTL&quot; para el láser de 491 nm. Ajuste el control deslizante a 100 y luego traerlo de vuelta a un valor entre 20 - 40%. Vuelva a revisar &quot;TTL&quot;. </li><li> Centrarse en la muestra de nuevo en la iluminación de luz transmitida. Ir al software de imagen y seleccione iluminación láser 491 nm y obturador abierto. Fine ajustar el punto focal del láser en el techo y centrar el punto al centro del diafragma campo cerrado con el condensador eliminado. Coloque el condensador boca abajo sobre el banco óptico, de manera que no lente de cero. </li><li> Reemplazar el condensador y vaya al software TIRF y establecer la profundidad de penetración (PD) a 110 nm. Interruptor de la iluminación de campo amplio de Illum TIRFmodo minación para formación de imágenes. </li><li> Encuentra VAMP2-pHluorin las células que expresan a través de los oculares de campo amplio uso de epifluorescencia con fuente de luz de epifluorescencia. <ol><li> Ajustar los parámetros de imagen (tiempo de exposición, la ganancia y la potencia del láser) para maximizar la relación señal-ruido y rango dinámico utilizando el tiempo de exposición mínima y la intensidad del láser para reducir photobleaching y fototoxicidad (por ejemplo: una exposición de entre 50 - 100 ms, con un 15 - 30 obtener al 30% como máximo la potencia del láser). </li><li> Ajuste de enfoque automático continuo por célula. Adquirir una imagen de conjunto con Timelapse de adquisición se produce cada 0,5 segundos durante 5 minutos. Para la condición de netrina-1 estimulada, añadir 500 netrina-1 ng / ml a placa de células en una campana de flujo laminar y devolver el plato a la incubadora durante 1 h antes de la formación de imágenes. </li></ol></li><li> Para cuantificar la frecuencia de eventos exocytic normalizados por área de la celda y el tiempo, las pilas de imágenes abiertas en ImageJ arrastrando el archivo a la ventana o ir a Archivo&gt; Abrir&gt; Nombre de archivo (Figura0; 2A recuadro 1). <ol><li> Para eliminar las señales fluorescentes estables que no representan eventos de fusión de vesículas, cree una proyección promedio z de toda la pila usando Imagen&gt; Pila&gt; Z-Proyecto&gt; Tipo de proyección: Intensidad Media. Restar esta imagen media de cada imagen en el timelapse usando procesos&gt; Calculadora de imágenes&gt; Imagen1: Operación su pila: restar Image2 proyección z promedio de nueva creación. Esto pone de relieve los acontecimientos exocytic (Figura 2A de la inserción 2 - 3). </li><li> Contar los eventos de fusión exocytic por ojo. Eventos exocytic se definen como la aparición de una señal de fluorescencia de difracción limitada, que se difunde rápidamente como VAMP2-pHluorin se difunde dentro de la membrana plasmática (Figura 2A recuadro 6). </li><li> Utilice el comando Umbral para resaltar la primera imagen usando Imagen&gt; Ajustar&gt; Umbral&gt; ajustar el control deslizante hasta que toda la célula es resaltada umbral (Figura 2A Recuadro 7 - 8). </li><li> bajo Analizar, seleccionar y comprobar SetMeasurements área y etiqueta de visualización. Seleccione el área celular de umbral utilizando la herramienta varita rastreo y presione &#39;m&#39; para medir (Figura 2A Recuadro 7 - 8). </li><li> Mezclar las dos cuentan los eventos de fusión exocytic, las mediciones de área celular, y el tiempo transcurrido de imágenes a una hoja de cálculo para calcular el número de eventos exocytic / mm2 / hora (Figura 2A recuadro 9). </li></ol></li></ol> 4. contraste de interferencia diferencial (DIC) Timelapse Microscopía de Axon ramificación Nota: Un protocolo completo y demostración de un enfoque general de formación de imágenes DIC está disponible 12. Mientras que este protocolo utiliza DIC, otros métodos de microscopía de luz transmitida pueden utilizarse para los mismos fines (por ejemplo: de contraste de fase). <ol><li> A las 2 DIV, el plato de cristal lugar de imágenes de fondo que contiene las neuronas transfectadas en cámara ambiental pre-calentado para mantener un env húmedoironment con 5% de CO2 y 37 ° C. Utilizar un microscopio equipado con un Plan de 60X-Apocromático, 1.4 lente objetivo NA DIC y alta del condensador NA para la mejor calidad de imagen y resolución. </li><li> Ajustar el plano focal para encontrar las neuronas a través de los oculares utilizando iluminación de luz transmitida. </li><li> Uso de la función multi adquisición zona en software de imágenes, encontrar y salvar a los lugares XYZ de al menos 6 células. Coloque el escenario para que las neuronas de interés quepan dentro del campo de visión para obtener los mejores resultados. <ol><li> Estimular con 250 ng / ml netrina-1 y pulse &#39;iniciar la adquisición de múltiples área&#39;. adquirir imágenes secuencialmente en cada posición cada 20 segundos durante 24 horas, haciendo una pausa adquisición y reorientación como sea necesario. </li></ol></li><li> Revisar las imágenes en el software de imágenes utilizando Aplicaciones&gt; revisión de datos&gt; nombre de archivo abierto Multi Dimensional. Identificar las ramas del axón estables (20 m de largo) que se forman durante la sesión de imágenes. Utilice la herramienta de línea de drenaje para medir una branc stableaxonh desde la base en el axón hasta la punta para asegurar que se cumpla la longitud de calificación de 20 micras. <ol><li> En una hoja de cálculo, registre el número de trama después de la estimulación netrina cuando protuberancias de la membrana inician en zonas en las ramas más tarde forman, así como el número de trama después de la estimulación netrina cuando nacientes ramas alcanzan los 20 m de longitud. </li><li> Multiplicar el número de fotogramas entre la protrusión y la formación de la rama por 20 segundos para calcular el tiempo de formación por cada rama. </li></ol></li></ol> 5. Las manipulaciones toxina y Inmunofluorescencia teléfono fijo <ol><li> A las 2 DIV, el tratamiento de las neuronas en condiciones experimentales con 250 ng / ml netrina-1 y / o 10 nM de toxina botulínica A (TBA), que escinde la proteína SNARE SNAP25 y efectivamente inhibe la exocitosis mediada por SNARE 13, más 250 ng / ml netrin- 1. Deja un conjunto de neuronas no tratadas como condición de control. PRECAUCIÓN: BoNTA requiere el uso de protección ocular y respiratoria cuando la preparación y usosoluciones. Mantener todos los materiales contaminados como material de riesgo biológico y autoclave tan pronto como sea posible. </li><li> A las 3 DIV (tratamiento post 24 h) medios de aspirado, y vuelva a colocar inmediatamente con al menos 1 ml de solución PHEM (véase la Tabla 1 para más detalles) se calienta a 37 ° C. Incubar durante 20 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente. </li><li> Enjuagar 3 veces con PBS (para una futura utilización del sello con parafilm y se almacena a 4 ° C). </li><li> Coloque los cubreobjetos en la cámara de tinción oscura, humidificado y permeabilizar las membranas de las células durante 10 min en recién diluido 0,2% Triton X-100 en PBS (hecho de 10% Triton X-100 de valores). </li><li> Retire la solución de permeabilización y enjuague con 50 l de 1x con PBS. Bloquear durante 30 min en ~ 50 l de 10% de albúmina sérica bovina en PBS (BSA-PBS) o 10% hervidos burro suero en PBS a RT. </li><li> Enjuague con 1x PBS de nuevo. Incubar cubreobjetos en 50 l de anticuerpo primario (1: 1000 βIII tubulina, para confirmar la identidad neuronal) en 1% BSA-PBS durante 1 hora a RT, en la oscuridad. </li><li> Realizar 3 x 5 min lavados en PBS. Incubar cubreobjetos en 50 l de anticuerpo secundario espectralmente distinta de la tubulina (1: 400), y faloidina fluorescente (varía por excitación: 488 faloidina a 1: 400, 647 faloidina en 1: 100) en 1% BSA-PBS durante 1 hr . </li><li> Lavar 3x 5 min en 1 x PBS y montar los cubreobjetos sobre portaobjetos en medio de montaje. </li><li> el exceso de vacío del material de montaje de los bordes del cubreobjetos y el sello con esmalte de uñas transparente. </li><li> Recoger las imágenes de campo amplio de epifluorescencia en un microscopio invertido con un objetivo de 40X 1.4NA, las capacidades de epifluorescencia y EM-CCD. <ol><li> analizar manualmente ramificación usando ImageJ. Pilas de imágenes abiertas en ImageJ arrastrando el archivo a la ventana o ir a Archivo&gt; Abrir&gt; Nombre de archivo (Figura 4A recuadro 1). </li><li> El uso de la línea&gt; línea segmentada, trace el axón, que se define como la neurita más larga que se extiende desde el soma (Figura 4A recuadro 2 - 3). </li><li>Utilizando Análisis&gt; Herramientas&gt; Administrador de retorno de la inversión, guardar el axón de rastreo como una región de interés. Rastrear y guardar cada rama axón, que se define como una de las neuritas ≥20 micras de longitud. Incluir ramas solamente primarios (excrecencias que brotan directamente desde el axón) en el análisis (Figura 4A inserción 3-4). </li><li> Pulse &#39;m&#39; para medir las regiones guardados de interés, y la transferencia de longitudes en píxeles a una hoja de cálculo para calcular la longitud en cm. </li><li> Se divide el número de ramificaciones del axón ≥20 micras de longitud, por la longitud del axón en micras dividido por 100 para obtener el número de ramificaciones del axón por 100 m de longitud. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La ramificación de los axones es un proceso fundamental del neurodesarrollo y sustenta la vasta neuroconectividad del sistema nervioso de los mamíferos. Comprender los mecanismos involucrados en la expansión localizada de la membrana plasmática es parte integral de nuestra comprensión del neurodesarrollo normal y patológico. El uso de un enfoque múltiple que incorpora metodologías a nivel de población y a nivel de célula única mejora la reproducibilidad y aumenta la resolución espacial y temporal sin comprometer el análi...

Estimaciones recientes sugieren que el cerebro humano contiene 1011 neuronas con 1014 conexiones sinápticas1, lo que destaca la importancia de la ramificación de los axones in vivo. Las señales de guía de los axones extracelulares, como la netrina-1, guían los axones a los socios sinápticos apropiados y estimulan la ramificación axonal, aumentando así la capacidad sináptica2-5. La arborización axonal dependiente de netrina-1 implica una expansión sustancial de la membrana plasmática6, que hipotetizamos requiere la entrega de componentes adicionales de la membrana a través de la fusión de vesículas exocíticas dependientes del complejo SNARE7. 
Investigar el papel de la exocitosis mediada por SNARE en la ramificación de los axones dependientes de netrina-1 es complicado por varios factores. En primer lugar, la heterogeneidad de las neuronas corticales aumenta el tamaño de la muestra necesaria para identificar efectos significativos, lo que complica las técnicas unicelulares como la obtención de imágenes. En segundo lugar, aunque las técnicas bioquímicas permiten observar los cambios que ocurren a nivel poblacional, carecen de la resolución temporal y espacial necesaria para localizar la expansión de la membrana plasmática en el axón en el marco temporal de la ramificación del axón. Por último, aunque las ramas axónicas se forman a lo largo de las horas, los cambios celulares que contribuyen a la extensión axonal pueden comenzar en cuestión de minutos y ocurrir en el orden de segundos, ampliando así el alcance temporal para la consideración experimental. 
Describimos un enfoque multitécnico que aborda estas diversas escalas temporales y espaciales de exocitosis y ramificación de axones, y por lo tanto mejora nuestra comprensión de los mecanismos celulares fundamentales. El uso de estos enfoques proporciona evidencia que respalda un papel crítico de la exocitosis mediada por SNARE en la ramificación de los axones.

<table><tbody><tr><td>Placas tratadas con cultivo de tejidos de 6 pocillos</td><td>Olympus Plastics</td><td>25-105</td><td></td></tr><tr><td>cubreobjetos de vidrio</td><td>Fisher scientific</td><td>12-545-81</td><td>12CIR-1.5; deben tratarse con ácido nítrico durante 24 horas, enjuagarse con agua desionizada 2 veces y secarse antes de su uso. Debe recubrirse con 1 mg/ml de poli-d-lisina y enjuagarse antes de la siembra de las celdas.</td></tr><tr><td>Amaxa nucleofección</td><td>solución</td><td>Lonza VPG-1001</td><td>100 ml/transfección</td></tr><tr><td>Amaxa Nucleofector/electroporador</td><td>Lonza</td><td></td><td>program O-005</td></tr><tr><td>35 mm Placas de imagen de células vivas con fondo de vidrio</td><td>Matek Corporation</td><td>p356-1.5-14-C</td><td>debe recubrirse con 1 mg/ml de poli-d-lisina y enjuagarse antes de la siembra de las células</td></tr><tr><td>Microscopio invertido Olympus IX81-ZDC2</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lámpara de xenón Lambda LS</td><td>Sutter Instruments Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubadora superior de etapa ambiental</td><td>Tokai Hit</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100x 1.49 NA Objetivo TIRF</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Andor iXon EM-CCD</td><td>Andor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Odyssey Licor Sistema de imágenes infrarrojas</td><td>LI-COR</td><td>Odyssey CL-X</td><td>Se utiliza para escanear manchas</td></tr><tr><td>Estudio de imagen paquete de software</td><td>LI-COR</td><td></td><td>Se utiliza para escanear en el sistema de infrarrojos Odyssey; Image studio lite utilizado para el análisis fuera de línea de manchas</td></tr><tr><td>Metamorph para Olympus</td><td>Molecular devices, LLC</td><td>versión 7.7.6.0</td><td>Software utilizado para todas las imágenes y el análisis de DIC timelapse Software de</td></tr><tr><td>control CELL TIRF</td><td>Olympus</td><td></td><td>Software utilizado para controlar láseres para imágenes TIRF</td></tr><tr><td>Fiji (Imagen J)</td><td>NIH</td><td>ImageJ Versión 1.49t</td><td></td></tr><tr><td>60x Plan Apochromat 1.4 NA objetivo</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>40x 1.4 NA Plan Objetivo apocromático</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Medios neurobasales</td><td>GIBCO</td><td>21103-049</td><td>Solución base para medios de enfriamiento sin suero y tripsina</td></tr><tr><td>Suplemento B27</td><td>GIBCO</td><td>17504-044</td><td>500 ml/50 ml Medios sin suero y medios de enfriamiento con tripsina</td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td></td><td>35050-061</td><td>1 ml/50 ml Medios sin suero</td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>Bio Basic Incorporated</td><td>9048-46-8</td><td>Solución al 10% en 1x PBS para el bloqueo de cubreobjetos; solución al 5% en TBS-T para el bloqueo de membranas de nitrocelulosa.</td></tr><tr><td>10x&nbsp; tripsina</td><td>Sigma</td><td>59427C</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>CELLGRO</td><td>25-060-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS)+ Ca + Mg</td><td>Corning</td><td>21-030-cm</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Corning/CELLGRO</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina equilibrada de Hank (HBSS)</td><td>Corning/CELLGRO</td><td>20-021-CV</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher científico</td><td>BP358-10</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Fisher científico</td><td>CAS67-42-5</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Fisher científico</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>TRIS HCl</td><td>Sigma</td><td>T5941-500</td><td></td></tr><tr><td>TRIS base</td><td>Fisher científico</td><td>BP152-5</td><td></td></tr><tr><td>N-galato de propilo</td><td>MP Biomedicals</td><td>102747</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol Grado fotométrico</td><td>Acros Organics</td><td>18469-5000</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol (grado no óptico)</td><td>Fisher scientific</td><td>CAS56-81-5</td><td></td></tr><tr><td>B-mercaptoethonal</td><td>Fisher scientific</td><td>BP176-100</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Fisher scientific</td><td>BP166-500</td><td></td></tr><tr><td>Agua destilada&nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>152340-147</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-Lisina</td><td>Sigma</td><td>p-7886</td><td>Disuelto en agua estéril a 1 mg/ml</td></tr><tr><td>Toxina botulínica A Lista BoNTA</td><td>Laboratorios Biológicos</td><td>128-A</td><td></td></tr><tr><td>Conejo policlonal anti VAMP2</td><td>humano Señalización celular</td><td>11829</td><td></td></tr><tr><td>Ratón monoclonal anti rata Sintaxina1A</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-12736</td><td></td></tr><tr><td>Cabra policlonal anti humano SNAP-25</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-7538</td><td></td></tr><tr><td>Ratón monoclonal anti humano y beta; III-tubulina&nbsp;</td><td>Covance</td><td>MMS-435P</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 y Alexa Fluor 488 faloidina, o Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LI-COR IR-dye anticuerpos secundarios</td><td>LI-COR</td> P<td>/N 925-32212,P/N 925-68023, P/N 926-68022</td><td>800 burro anti-ratón, 680 burro anti conejo, 680 burro anti cabra</td></tr><tr><td>0.2 &#956; m tamaño de poro membrana de nitrocelulosa</td><td>Biorad</td><td>9004-70-0</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher scientific</td><td>S25426A</td><td></td></tr><tr><td>Bromphenol Blue</td><td>Sigma</td><td>B5525-5G</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Fisher scientific</td><td>S6-212</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Fisher scientific</td><td>O-4042-500</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Fisher scientific</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Fisher scientific</td><td>BP150-20</td><td></td></tr><tr><td>40% Bis-Acrylimida</td><td>Fisher scientific</td><td>BP1408-1</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</strong</td><td>>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Alternative Validated Antibodies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mouse Monoclonal Anti-Syntaxin HPC-1 clon</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S0664</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Sinaptobrevina 2 monoclonal de ratón (VAMP2)</td><td>Sistemas sinápticos</td><td>104-211</td><td></td></tr><tr>Sistemas <td>sinápticos</td><td>monoclonales de ratón SNAP25</td><td>111-011</td><td></td></tr></tbody></table>

utilizando metodologías combinadas para definir el papel de la membrana plasmática de entrega durante axon ramas y morfogénesis neuronal

Utilizing Combined Methodologies to Define the Role of Plasma Membrane Delivery During Axon Branching and Neuronal Morphogenesis

Durante el desarrollo neuronal, los axones en crecimiento se extienden a múltiples socios sinápticos mediante la elaboración de ramas axonales. La ramificación de los axones es promovida por señales de guía extracelular como la netrina-1 y da como resultado aumentos dramáticos en el área superficial de la membrana plasmática axonal. La ramificación del axón dependiente de la netrina-1 probablemente implica el control temporal y espacial de la expansión de la membrana plasmática, cuyos componentes se suministran a través de la fusión de vesículas exocíticas. Estos eventos de fusión están precedidos por la formación de complejos SNARE, que comprenden un v-SNARE, como VAMP2 (proteína de membrana asociada a vesículas 2) y t-SNAREs de membrana plasmática, sintaxina-1 y SNAP25 (proteína 25 asociada a sinaptosomasoma). En este trabajo se detalla un enfoque múltiple utilizado para examinar el papel de la exocitosis mediada por SNARE en la ramificación de los axones. La fortaleza del enfoque combinado es la adquisición de datos en un rango de resoluciones espaciales y temporales, que abarcan desde la dinámica de los eventos de fusión de vesículas individuales en neuronas individuales hasta la formación del complejo SNARE y la ramificación de axones en poblaciones de neuronas cultivadas. Este protocolo aprovecha los enfoques bioquímicos establecidos para analizar los niveles de complejos SNARE endógenos y la microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF) de neuronas corticales que expresan VAMP2 marcadas con una GFP sensible al pH (VAMP2-pHlourin) para identificar cambios dependientes de la netrina-1 en la actividad exocítica en neuronas individuales. Para dilucidar el momento de la ramificación dependiente de la netrina-1, se utiliza la microscopía de contraste de interferencia diferencial (DIC) de lapso de tiempo de neuronas individuales del orden de horas. La inmunofluorescencia celular fija emparejada con neurotoxinas botulínicas que escinden la maquinaria SNARE y bloquean la exocitosis demuestra que la ramificación del axón dependiente de la netrina-1 requiere actividad exocítica mediada por SNARE.

Utilizando técnicas bioquímicas in vitro para ensayar la cantidad de complejos SNARE SDS-resistentes en una población de neuronas. La figura 1 muestra la transferencia de Western resultante después de la terminación de la SNARE complejo de ensayo SDS-resistente probaron para SNAP-25, y Sintaxina1A VAMP2. Microscopía TIRF en la membrana celular basal proporciona imágenes de alta resolución de los event...

Las técnicas de microscopía óptica junto con ensayos bioquímicos dilucidan la implicación de la exocitosis mediada por SNARE en la ramificación de los axones dependiente de la netrina. Esta combinación de técnicas permite identificar los mecanismos moleculares que controlan la ramificación de los axones y el cambio de forma de las células.

Utilizando metodologías combinadas para definir el papel de la membrana plasmática de entrega Durante Axon ramas y morfogénesis neuronal

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular ...

El objetivo general de este procedimiento es realizar observaciones cuantificables de la ocurrencia temporal y espacial de la fusión de vesículas exocíticas neuronales y la ramificación axonal. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurociencia, como cuándo y dónde la fusión de vesículas inserta material de membrana en la membrana plasmática en expansión durante el desarrollo neuronal. La principal ventaja de esta técnica es que combina imágenes de células vivas para obtener alta resolución espacial y temporal en células individuales, junto con enfoques bioquímicos para obtener información basada en poblaciones.Después de cultivar y simular neuronas corticales con Netrin-1 o un control según el texto del protocolo. Aspire el PBS del primer pocillo de una condición y reemplace con 250 microlitros de tampón de homogenización. Incube en hielo durante cinco minutos y luego, utilizando un lifter celular, homogenice las células en hielo.Aspire el PBS del siguiente pocillo de la misma condición y agregue la mezcla recién homogenizada al pocillo para aumentar las concentraciones de proteína. A continuación, transfiera la solución homogenizada a un tubo microcentrífugo de 1,6 mililitros previamente enfriado sobre hielo y agregue Tritón X-100 al 20% para alcanzar una concentración final del 1%. Luego, con una pipeta de 1.000 microlitros, pase la mezcla diez veces para triturarla, minimizando la formación de burbujas. Incube los tubos sobre hielo durante dos minutos para solubilizar las proteínas.Luego, centrifugue a 6.010 RCF a 4 grados Celsius durante 10 minutos para obtener el sedimento del material no solubilizado. Transfiera el sobrenadante líquido a un nuevo tubo de 1,6 mililitros enfriado sobre hielo. A continuación, utilice el ensayo de Bradford para determinar la concentración de proteína.Luego, utilice tampón de homogenización con 1 % de Triton X-100 y tampón de muestra 5X suplementado con BME para diluir las muestras hasta una concentración final de 3-5 miligramos por mililitro. Divida cada muestra experimental por igual en dos tubos. A continuación, incube una muestra a 37 grados Celsius durante 30 minutos y la otra a 100 grados Celsius durante 30 minutos.Invierta los tubos intermitentemente para mantener las muestras en solución. Luego realice electroforesis SDS-PAGE y transferencia Western blot según el protocolo descrito en el texto. Después de configurar el microscopio TIRF y la muestra, y encontrar un plano focal neuronal según el protocolo descrito en el texto.Inicie el software del láser y conéctese al software de control del láser. Configure la iluminación en campo amplio y seleccione el objetivo. Luego, establezca el índice de refracción de la muestra y ajuste la intensidad del láser desactivando TTL para el láser de 491.La optimización de los parámetros de imagen es importante durante la adquisición de imágenes de vesículas exocíticas con el piso intacto para evitar la deriva del enfoque y la fototoxicidad, a la vez que se producen imágenes con una relación señal-ruido suficientemente alta para su análisis. Ajuste el control deslizante a 100 y luego regresarlo a un valor entre 20 y 40. A continuación, verifique nuevamente el TTL.A continuación, enfoque nuevamente la muestra con iluminación de luz transmitida. Luego, en el software de imagen, seleccione la iluminación con láser de 491 y abra el obturador. Coloque el condensador boca abajo sobre el banco óptico para no rayar la lente.Ajuste finamente el punto focal del láser en el techo y, con el condensador retirado, centre el punto en el centro del diafragma de campo cerrado. Luego, vuelva a colocar el condensador y en el software de TIRF establezca la profundidad de penetración en 110 nanómetros. A continuación, cambie del modo de iluminación de campo amplio al modo de iluminación TIRF para la adquisición de imágenes.Ahora, utilizando epifluorescencia de campo amplio, localice células que expresan VAMP2 fluorescente a través de los oculares. Luego, para reducir el fotoblanqueo y la fototoxicidad, ajuste los parámetros de adquisición de imágenes para maximizar la relación señal-ruido y el rango dinámico empleando el tiempo de exposición y la intensidad del láser mínimos necesarios. Establezca el enfoque automático continuo por célula.Luego, adquiera un conjunto de imágenes de lapso de tiempo con una adquisición cada 0,5 segundos durante cinco minutos. Para la condición estimulada con Netrin-1 en una campana de flujo laminar, agregue Netrin-1 hasta una concentración final de 500 nanogramos por mililitro a un cultivo de células y devuelva el cultivo al incubador durante una hora antes de la adquisición de imágenes. Para cuantificar la frecuencia de eventos exocíticos normalizados por área celular y tiempo.En ImageJ, abra las pilas de imágenes arrastrando el archivo a la ventana o seleccionando Archivo, Abrir, nombre del archivo. Para eliminar las señales fluorescentes estables que no representan eventos de fusión de vesículas, utilice Imagen, Pila, Proyección Z, tipo de proyección Intensidad promedio. Para crear una proyección Z promedio de toda la pila.Reste la imagen media resultante a cada imagen de la serie temporal utilizando Procesar, Calculadora de imágenes, Imagen 1 su pila, Operación Restar imagen dos. Resultando en una nueva proyección Z. Esto resaltará los eventos exocíticos.Ahora, a simple vista, cuente los eventos de fusión exocítica, que pueden identificarse como manchas de señales fluorescentes limitadas por difracción que se difunden rápidamente cuando el fluorocromo VAMP2 se difunde dentro de la membrana plasmática. Resalte la primera imagen con Imagen, Ajustar, Umbral, y ajuste el control deslizante hasta que toda la célula quede resaltada por umbral. Luego, en Analizar, elija Establecer mediciones y marque área y mostrar etiqueta.Con la herramienta de trazado de puntero, establezca el área celular umbralizada y presione M para medir. Transfiera los datos recopilados a una hoja de cálculo según el protocolo descrito en el texto. A las dos días in vitro, coloque el platillo de imagen con fondo de vidrio que contiene neuronas no transfectadas en una cámara ambiental húmeda previamente calentada.Utilice un microscopio equipado con un objetivo DIC plan apocromático de seis DX, 1,4 NA y un condensador de alta apertura numérica para obtener la mejor calidad de imagen y resolución. A continuación, con iluminación de luz transmitida, ajuste el plano focal para localizar neuronas mediante los oculares. Para la obtención de imágenes DIC del ramificado axonal, la configuración adecuada de la iluminación fría será fundamental para la optimización de la imagen y es crítica para producir resultados analizables.Luego, con las neuronas de interés dentro del campo de visión, utilice la función de adquisición de múltiples áreas en el software de imagen para localizar y guardar las posiciones XYZ de al menos seis células. A continuación, agregue una concentración final de 250 nanogramos por mililitro de Netrin-1 u otro factor de interés para estimular las células y presione iniciar adquisición de múltiples áreas. Adquiera secuencialmente imágenes en cada posición cada 20 segundos durante 24 horas.Detener la adquisición y volver a enfocar según sea necesario. Dentro del software de imagen, revise las imágenes seleccionando Aplicaciones, Revisar Datos Multidimensionales y abra el archivo deseado. Identifique ramas axonales estables que se formaron durante la sesión de imagen. Utilice la herramienta de región de trazado para medir una rama axonal estable desde la base del axón hasta su extremo. Después de tratar las neuronas con netrina y toxina botulínica, fijarlas y realizar la inmunotinción, e inmunotinción para beta-3 tubulina y actina según el protocolo descrito en el texto. Utilice un microscopio invertido para obtener imágenes de epifluorescencia de campo amplio.Abra una pila de imágenes en ImageJ y, para analizar manualmente la ramificación, utilice la herramienta de línea, línea segmentada y trace el axón, definido como la neurita más larga que se extiende desde el soma. Con Analizar, Herramientas, Administrador de ROI, guarde el trazado del axón como una región de interés. Luego trace y guarde cada rama del axón, definida como una neurita de longitud mayor o igual a 20 micrómetros.Incluya solo las ramas primarias en el análisis. Se muestra aquí una transferencia Western tras la finalización del ensayo de complejo SNARE resistente a SDS. Revelado para SNAP25, Syntaxin 1A y VAMP2.Proteínas SNARE en complejo, se muestran aquí los monómeros identificables. Aquí se muestra un ejemplo de un evento exocítico mediado por VAMP2 con fluorescencia que ocurre a lo largo del tiempo en una neurona cortical. Los recuadros ampliados indican el soma, una rama axonal y un cono de crecimiento axonal, mostrando la utilidad espacial de este ensayo.Los círculos indican eventos individuales de fusión exocitótica, que pueden observarse mediante microscopía de fluorescencia por reflexión total (TIRF). Esta imagen en tiempo real con contraste de interferencia diferencial (DIC) muestra la formación estimulada por Netrina de una rama axonal en tiempo real. Estas ubicaciones indican la protrusión inicial desde un sitio de ramificación.Estas representan ramas estables completamente formadas de al menos 20 micrómetros, medidas desde el axón principal hasta el extremo de la rama. En este experimento, neuronas corticales a 3 DIV fueron tratadas con Netrina-1, que estimula la ramificación, o con toxina botulínica tipo A, que escinde SNAP25, un componente del complejo SNARE y bloquea la exocitosis. Los resultados demuestran que la exocitosis mediada por el complejo SNARE es necesaria para la ramificación dependiente de Netrina.Una vez dominada, la microscopía DIC puede completarse en una sola sesión de imagenología nocturna. La microscopía TIRF de eventos exocíticos individuales puede realizarse en 4-5 horas. El protocolo de bioquímica para la formación del complejo SNARE puede llevarse a cabo en dos horas.Al intentar estos procedimientos, es importante recordar mantener un ritmo adecuado y no apresurar ningún paso en particular. Cada procedimiento requiere atención y paciencia para obtener los mejores resultados. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la cotransfección de componentes de vesículas marcados con cargas candidatas marcadas, para responder preguntas adicionales.¿Por ejemplo, cuál es la carga de las vesículas exocíticas? Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la neurociencia exploraran la neuritogénesis, la ramificación axonal y otras etapas de la morfogénesis en cualquier cultivo neuronal disociado. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo observar y cuantificar la naturaleza espacial y temporal de los eventos de fusión de vesículas exocíticas neuronales correspondientes a los cambios en la morfogénesis neuronal.No olvide que trabajar con toxina botulínica o láseres de alta potencia puede ser extremadamente peligroso, y siempre se deben tomar precauciones, como usar prendas de seguridad adecuadas y utilizar el mecanismo de bloqueo de seguridad del microscopio, al realizar este procedimiento.

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Se describe aquí el uso de una variante de proteína fluorescente verde sensible al pH, pHluorin, para estudiar la dinámica espacio-temporal de los receptores de guía de axones que se trafficking en la superficie celular. El receptor marcado con pHluorin se expresa tanto en cultivo celular como in vivo,utilizando la electroporación del embrión de pollito.

Uso De pHluorin Para Evaluar La Dinámica De Los Receptores De Orientación Axón En El Cultivo Celular Y En El Embrión De Polluelo

Este protocolo describe el aislamiento de neuronas del ganglio de la raíz dorsal (DRG) aisladas de ratas y el cultivo de neuronas DRG en un sistema de cultivo celular estático preestirado para mejorar la alineación de los axones, con el posterior cocultivo de células de Schwann (SC) para promover la mielinización.

Un Enfoque para Mejorar la alineación y la mielinización de las neuronas del ganglio de la raíz dorsal

Este procedimiento describe cómo iniciar, extender y conectar rápidamente neuritas organizadas en cámaras microfluídicas usando perlas revestidas con poli-D-lisina fijadas a micropipetas que guían la elongación de las neuritas.

Rewiring Neuronal Circuits: Un Nuevo Método Para La Extensión Neurítica Rápida Y La Conexión Neuronal Funcional

Nos muestra el desarrollo de los paquetes uno mismo-montado, tridimensionales de somata astrocytic longitudinalmente alineado y procesos dentro de un protector nuevo biomaterial. Estos diseñados "andamios de vida", que diámetro de la escala del micrón pero extiende centímetros de longitud, puede servir como bancos de pruebas para estudiar los mecanismos del desarrollo neurológico o facilitar la Neurorregeneración por dirige la migración neuronal y axonal pathfinding.

Ingeniería tisular tridimensional alineado astrositos redes para recapitular los mecanismos del desarrollo y facilitar la regeneración del sistema nervioso

Este protocolo describe un método para la proyección de imagen simultánea de talamocorticales axon ramas y sinapsis formación en organotypic cocultures del tálamo y corteza cerebral. Axones individuales talamocorticales y sus terminales presinápticos se visualizan mediante una técnica de electroporación unicelular con DsRed y synaptophysin tagged GFP.

Visualización de axón talamocorticales ramificación y sinapsis formación en Organotypic Cocultures

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In situ Visualización del crecimiento de axones y la dinámica de los conos de crecimiento en cultivos agudos de cortes cerebrales embrionarios ex vivo

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Utilizando metodologías combinadas para definir el papel de la membrana plasmática de entrega Durante Axon ramas y morfogénesis neuronal (Video) | JoVE Journal

Utilizando metodologías combinadas para definir el papel de la membrana plasmática de entrega Durante Axon ramas y morfogénesis neuronal

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