Utilizando metodologías combinadas para definir el papel de la membrana plasmática de entrega Durante Axon ramas y morfogénesis neuronal

Las técnicas de microscopía óptica junto con ensayos bioquímicos dilucidan la implicación de la exocitosis mediada por SNARE en la ramificación de los axones dependiente de la netrina. Esta combinación de técnicas permite identificar los mecanismos moleculares que controlan la ramificación de los axones y el cambio de forma de las células.

El objetivo general de este procedimiento es realizar observaciones cuantificables de la ocurrencia temporal y espacial de la vesícula exocítica neuronal, el fushion y la ramificación de los axones. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurociencia, como cuándo y dónde la fusión de vesículas inserta material de membrana en la membrana plasmática en expansión durante el desarrollo neuronal. La principal ventaja de esta técnica es que combina la obtención de imágenes de células vivas para adquirir una alta resolución espacial y temporal en células individuales y enfoques bioquímicos para adquirir información basada en la población.

Después de cultivar y simular neuronas corticales con Netrina-1 o un control según el texto del protocolo. Aspire PBS desde el primer pocillo de una condición y reemplácelo con 250 microlitros de tampón de homogeneización. Incubar en hielo durante cinco minutos, y luego, usando un elevador de células, homogeneizar las células en hielo.

Aspire el PBS del siguiente pocillo de la misma condición y agregue la mezcla recientemente homogeneizada al pocillo, lo que aumentará las concentraciones de proteínas. A continuación, transfiera la solución homogeneizada a un tubo de microfuga de 1,6 mililitros preenfriado sobre hielo y agregue 20%Triton X-100 para alcanzar una concentración final de 1%Luego, con una pipeta de 1,000 microlitros, triture la mezcla diez veces minimizando las burbujas. Incubar los tubos en hielo durante dos minutos para solubilizar las proteínas.

A continuación, centrifugar a 6.010 RCF a 4 grados centígrados durante 10 minutos para granular el material no solubilizado. Transfiera el sobrenadante de estado de mentira a un nuevo tubo enfriado de 1,6 mililitros en hielo. A continuación, utilice el ensayo de Bradford para determinar la concentración de proteínas.

A continuación, utilice un tampón de homogeneización con Triton X-100 al 1% y un tampón de muestra 5X complementado con BME para diluir las muestras hasta una concentración final de 3-5 miligramos por mililitro. Divida cada muestra experimental uniformemente en dos tubos. A continuación, incubar una muestra a 37 grados centígrados durante 30 minutos y la otra a 100 grados centígrados durante 30 minutos.

Invierta los tubos de forma intermitente para mantener las muestras en solución. A continuación, lleve a cabo la página SDS y la transferencia Western de acuerdo con el protocolo de texto. Después de configurar el microscopio TIRF y la muestra y encontrar un plano focal neuronal de acuerdo con el protocolo de texto.

Inicie el software láser y conéctelo al software de control láser. Ajuste la iluminación a campo amplio y seleccione el objetivo. A continuación, configure el índice de refracción de la muestra y ajuste la intensidad del láser desmarcando TTL para el láser 491.

La optimización de los parámetros de imagen es importante durante la obtención de imágenes de vesículas exocíticas intactas en el suelo para evitar la deriva del foco y la fototoxicidad, al tiempo que se producen imágenes de alta relación señal-ruido suficientes para el análisis. Ajuste el control deslizante a 100 y luego vuelva a reducirlo a un valor entre 20 y 40. A continuación, vuelva a comprobar el TTL.

A continuación, vuelva a enfocar la muestra con iluminación de luz transmitida. A continuación, en el software de imagen, seleccione la iluminación láser 491 y abra el obturador. Coloque el condensador boca abajo sobre el banco óptico para no rayar la lente.

Ajuste con precisión el punto focal del láser en el techo y, con el condensador retirado, centre el punto al centro del diafragma de campo cerrado. Luego reemplace el condensador y en el software TIRF envió la profundidad de penetración a 110 nanómetros. A continuación, cambie de la iluminación de campo amplio al modo de iluminación TIRF para la obtención de imágenes.

Ahora, utilizando la epifluorescencia de campo amplio, encuentre células que expresan fluorente VAMP2 a través de los oculares. A continuación, para reducir el fotoblanqueo y la fototoxicidad, ajuste los parámetros de imagen para maximizar la relación señal-ruido y el rango dinámico utilizando un tiempo de exposición y una intensidad láser mínimos. Establezca el enfoque automático continuo por celda.

A continuación, adquiera un conjunto de imágenes de lapso de tiempo con la adquisición cada 0,5 segundos durante cinco minutos. Para la condición estimulada por Netrin-1 en una campana de flujo laminar, agregue una concentración final de 500 nanogramos por mililitro de Netrin-1 a una placa de células y devuelva la placa a la incubadora durante una hora antes de la obtención de imágenes. Cuantificar la frecuencia de eventos exocíticos normalizados por área celular y tiempo.

En ImageJ, abra pilas de imágenes arrastrando el archivo a la ventana o eligiendo Archivo, Abrir, nombre de archivo. Para eliminar señales fluorescentes estables que no representan eventos de fusión de vesículas, utilice Imagen, Pila, Proyecto Z, Tipo de proyección Intensidad media. Para crear una proyección Z promedio de toda la pila.

Reste la imagen media resultante de cada imagen en el lapso de tiempo usando Proceso, Calculadora de imágenes, Imagen 1 su pila, Operación Restar imagen dos. El resultado es una proyección Z recién creada. Esto enfatizará los eventos exocíticos.

Ahora, a ojo, cuente los eventos de fushion exocítico, que se pueden identificar como puntos de difracción de señales fluorescentes limitadas que se difunden rápidamente a medida que el fluorado VAMP2 se difunde dentro de la membrana plasmática. Resalte la primera imagen con Imagen, Ajustar, Umbral y ajuste el control deslizante hasta que toda la celda esté resaltada por umbral. A continuación, en Analizar, elija Establecer medidas y compruebe el área y la etiqueta de visualización.

Con la herramienta de trazado de varita, establezca el área celular umbralizada y presione M para medir. Transfiera los datos recopilados a una hoja de cálculo de acuerdo con el protocolo de texto. A los dos días in vitro, coloque la placa de imágenes con fondo de vidrio que contiene neuronas no transfectadas en una cámara ambiental húmeda precalentada.

Utilice un microscopio equipado con una lente de objetivo DIC 1.4 NA apocromático de plano DX y un condensador de alta apertura numérica para obtener la mejor calidad de imagen y resolución. A continuación, con la iluminación de luz transmitida, ajuste el plano focal para encontrar neuronas a través de los oculares. Para la obtención de imágenes DIC de la ramificación de los axones, la configuración adecuada de la iluminación del refrigerador será fundamental para la optimización de la imagen y es fundamental para producir resultados analizables.

A continuación, con las neuronas de interés dentro del campo de visión, utilice la función de adquisición de áreas múltiples en el software de imágenes para encontrar y guardar las ubicaciones XYZ de al menos seis células. Ahora, agregue a una concentración final de 250 nanogramos por mililitro de Netrin-1 u otro factor de interés para simular las células y presione iniciar la adquisición de múltiples áreas. Adquiera imágenes secuencialmente en cada posición cada 20 segundos durante 24 horas.

Pausa la adquisición y el reenfoque según sea necesario. Dentro del software de imágenes, revise las imágenes eligiendo Aplicaciones, Revisar datos multidimensionales y abra el archivo deseado. Identifique las ramas estables de los axones que se formaron durante la sesión de imágenes.

Utilice la herramienta trazar región para medir una rama axónica estable desde la base del axón hasta la punta. Después de tratar las neuronas con Netrin y toxina botulínica y fijar e inmunotinción, e inmunotinción para beta-3 tubolina y actina de acuerdo con el protocolo de texto. Utilice un microscopio invertido para recolectar imágenes de epifluorescencia de campo amplio.

Abra una pila de imágenes en ImageJ y para analizar manualmente la ramificación, use línea, línea segmentada y trace el axón que se define como la neurita más larga que se extiende desde el soma. Con Analizar, Herramientas, Administrador de ROI, guarde el trazado de axones como una región de interés. A continuación, trace y guarde cada rama del axón, que se define como una neurita mayor o igual a 20 micrómetros de longitud.

Incluya solo las ramas principales en el análisis. Aquí se muestra una transferencia de Western después de la finalización del ensayo del complejo SNARE resistente a SDS. Sondeado para SNAP25, sintaxina 1A y VAMP2.

Aquí se muestran las proteínas SNARE en complejo, un monómero identificable. Aquí se muestra un ejemplo de un evento exocítico mediado por fluroen VAMP2 que ocurre a lo largo del tiempo en una neurona cortical. Los recuadros ampliados denotan el soma, una rama axónica y un cono de crecimiento axonal, lo que muestra la utilidad espacial de este ensayo.

Los círculos detonan eventos de fusión exocítica individuales, que se pueden ver a través de la microscopía TIRF. Esta imagen DIC de lapso de tiempo muestra la formación estimulada por Netrin de una rama axonal en tiempo real. Estas ubicaciones denotan la protuberancia inicial de un sitio de bifurcación.

Estos representan ramas estables completamente formadas de al menos 20 micrómetros medidos desde el axón principal hasta la punta de la rama. En este experimento, las neuronas corticales en 3 DIV fueron tratadas con Netrin-1, que estimula la ramificación, o toxina botulínica A, que escinde SNAP25, un componente del complejo SNARE y bloquea la exocitosis. Los resultados demuestran que la exocitosis mediada por SNARE es necesaria para la ramificación dependiente de Netrin.

Una vez dominado, las imágenes DIC se pueden completar en una sola sesión de imágenes durante la noche. Las imágenes TIRF de eventos exocíticos individuales se pueden manejar en 4-5 horas. El protocolo de bioquímica de formación de complejos SNARE se puede realizar en dos horas.

Al intentar estos procedimientos, es importante recordar que debe mantener el ritmo y no apresurarse en ningún paso. Cada procedimiento requiere atención y paciencia para obtener los mejores resultados. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la cotransfección de componentes de vesículas marcadas con cargas candidatas marcadas, para responder preguntas adicionales.

¿Cuál es la carga de las vesículas exocíticas? Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la neurociencia exploraran la neuritogénesis, la ramificación de los axones y otras etapas de la morfogenis en cualquier cultivo neuronal disociado. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo observar y cuantificar la naturaleza espacial y temporal de los eventos de fusión de vesículas exocíticas neuronales correspondientes a cambios en la morfogenia neuronal.

No olvide que trabajar con toxina botulínica o láseres de alta potencia puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben tomar precauciones como el uso de prendas de seguridad adecuadas y el uso del mecanismo de bloqueo de seguridad del microscopio al realizar este procedimiento.