Ensayo de Perfilado de Trombo: Una plataforma basada en microfluídica para caracterizar de forma exhaustiva la trombogénesis biomecánica

Hemos desarrollado un nuevo método que puede capturar adecuadamente los atributos biomecánicos de la trombosis y también detectar anomalías protrombóticas en humanos. Para empezar, utiliza una oblea de silicio para fabricar un molde maestro fotorresistente SU8 mediante fotolitografía estándar según el diseño y asegura el molde maestro en el fondo de una placa de Petri de 15 centímetros con cinta adhesiva. Prepara la mezcla de polidimetilsiloxano, o PDMS, mezclando la base prepolimérica y el agente de curado del kit de elastómeros de silicona en una relación de peso de 10 a 1.

Vierte la mezcla PDMS sobre el molde maestro. Luego coloca la placa que contiene la mezcla de PDMS en un desecador al vacío para desgasificarla. Curar térmicamente la mezcla de PDMS colocándola en una incubadora a 75 grados Celsius durante dos horas.

Tras extraer la muestra de la incubadora, se corta cuidadosamente el PDMS curado del molde maestro y se separa el PDMS curado en unidades individuales de chip. Usando una aguja de sonda, haz agujeros en los lugares designados para crear la entrada y la salida. En una campana química, usa una toallita húmeda con etanol al 75% para limpiar las láminas de cristal y secarlas.

A continuación, usando un generador de alta frecuencia, trata las láminas de vidrio durante 30 segundos y los chips PDMS durante 20 segundos. Alinea cada astilla con una corredera de vidrio y presiona suavemente la astilla sobre la superficie de vidrio para unirla. Ahora une los dispositivos de forma térmica colocándolos en un horno a 150 grados Celsius durante 15 minutos.

Después de la adhesión, guarda los dispositivos a temperatura ambiente en condiciones libres de polvo. Luego, usando una pinza, retira la parte de plástico de las agujas de la sonda y dobla los tubos metálicos a 90 grados para crear conectores para los dispositivos microfluídicos. Después de preparar las reacciones para conjugar fibrinógeno y anticuerpos necesarios con Alexa Fluor, centrifuga las columnas de purificación a 1.100 G durante dos minutos para eliminar el tampón de almacenamiento.

Tras descartar el flujo, cargar la solución de reacción sobre la columna de purificación montada en un vial de recogida compatible y centrifugar a 1.100 g durante cinco minutos para cosechar la mezcla requerida. Usando un espectrofotómetro, mide la absorbancia de la proteína y la señal del colorante. Calcula la concentración de proteínas y la proporción de fluorescencia a molar de proteína.

Guarda los tintes a cuatro grados Celsius en la oscuridad. Añadir heparina al tampón de tirodo a una concentración final de 0,32 unidades por mililitro por 10 mililitros de sangre a recoger, y preparar la jeringuilla aspirando 500 microlitros de tampón de tirodo a pH 7,4. Después de recoger la sangre mediante venpuntura en la jeringuilla que contiene heparina, transfiera a un tubo centrífugo de 15 mililitros y mantenla a 37 grados Celsius.

Diluir el monómero del factor de Von Willebrand a dos microgramos por mililitro en PBS. Pre-recubre los dispositivos microfluídicos con el monómero diluido del factor von Willebrand e incubalos durante una hora a temperatura ambiente. Ahora incuba la muestra de sangre con el sensor fluorescente en el ajuste 1 o el 2 durante 10 minutos a temperatura ambiente.

Después, conecta un dispositivo microfluídico con conectores de entrada y salida y tubos. Conecta el otro extremo del conector de entrada a un tubo que contiene PBS, y luego conecta el otro extremo del conector de salida a una jeringuilla. Montar la jeringuilla en una bomba de jeringuilla y el dispositivo microfluídico en un microscopio invertido.

Mueve manualmente la etapa del microscopio para localizar el lugar de la estenosis. Llena el canal microfluídico y el tubo con PBS usando la bomba de jeringuilla a un caudal de 0,5 mililitros por minuto. Inspecciona el dispositivo para asegurarte de que no hay burbujas de aire alrededor del lugar de la estenosis.

Conecta el tubo de entrada a la muestra de sangre y perfunde la muestra a través del canal microfluídico usando la bomba de jeringuilla a un caudal de 0,018 mililitros por minuto. En un microscopio invertido, ajusta el tiempo de exposición y la ganancia para cada canal de fluorescencia en el software. Realiza imágenes de fluorescencia multicolor en tiempo real alternando entre los cuatro canales y excitando un fluoro-4 a la vez.

Ajusta el plano de enfoque al trombo y registra señales fluorescentes en el lugar de la estenosis durante 15 a 30 minutos. Para el análisis de datos, abre el archivo de datos usando la versión 1.53 de ImageJ. Utiliza el canal C de ajuste SZ 22 para identificar el contorno del trombo.

Luego, usando selecciones de polígonos, selecciona aproximadamente el área del trombo. Para cada canal, elimina la señal de fondo seleccionando imagen, eligiendo Ajustar y luego seleccionando Umbral. Finalmente, mide el área y la intensidad media de la señal dentro del trombo seleccionando Analizar y seleccionando Medida.

Instantáneas representativas mostraron trombos formados en sangre sana dentro del canal estenótico con plaquetas, fibrinógeno, factor von Willebrand y P-selectina visualizados usando el conjunto de sensores 1, y plaquetas, fosfatidilserina, integrina alfa IIb beta 3 E-positiva, una integrina alfa IIb beta 3 activada visualizada usando el conjunto de sensores 2. Se procesó una única imagen de canal de fluorescencia seleccionando el área del trombo, eliminando la señal de fondo y midiendo el área de la señal y el brillo medio para permitir el análisis cuantitativo. El análisis continuo de la intensidad de la señal fluorescente a lo largo del tiempo generó una curva de señal en función del tiempo para la acumulación de plaquetas durante la formación de trombos.

Para cada punto temporal, se obtuvieron las intensidades totales de señal para cuatro biomarcadores en el conjunto de sensores uno y para cuatro biomarcadores en el conjunto de sensores dos. Se calculó el tamaño del trombo y se generó un perfil de trombo en siete dimensiones. Actualmente, no existe un bioensayo disponible para evaluar la tendencia protrombótica de los pacientes humanos, y nuestro trabajo intenta cubrir esta carencia.

Al detectar la actividad biomecánica de las muestras de sangre, nuestro ensayo puede evaluar de forma exhaustiva los atributos protrombóticos de los sujetos. Nuestro ensayo puede desarrollarse como una prueba clínica para detectar la tendencia protrombótica en pacientes, y también puede utilizarse para detectar fármacos antitrombóticos de próxima generación.